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Medicine

आण्विक जांच अनुकूलन (संश्लेषक जीव में सेल मृत्यु दर निर्धारित करने के लिए doi: 10.3791/53036 Published: January 29, 2016

Summary

माइक्रोबियल आबादी समग्र व्यवहार निर्देशित कर सकते हैं जो पर्याप्त सेल विविधता, होते हैं। फ्लो के माध्यम से आण्विक जांच विश्लेषण हालांकि अपने आवेदन प्रजातियों के बीच होती है, कोशिकाओं के शारीरिक राज्यों निर्धारित कर सकते हैं। इस अध्ययन underestimating या झूठी सकारात्मक परिणाम रिकॉर्डिंग के बिना, सही ढंग से एक साइनोबैक्टीरीयम आबादी के भीतर सेल मृत्यु दर निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

Abstract

क्षेत्र और प्रयोगशाला अध्ययन में माइक्रोबियल उप-जनसंख्या रूपात्मक और शारीरिक मापदंड में उच्च विविधता प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। रोगाणुओं कोशिका विभाजन और चयापचय गतिविधियों को कम कर रहे हैं जिससे एक निष्क्रिय अवस्था में मौजूद कर सकते हैं के रूप में एक माइक्रोबियल सेल की वास्तविक समय राज्य का निर्धारण, जीवित या मृत श्रेणियों से परे चला जाता है। कुल आबादी व्यवहार्यता का निर्धारण करने में मदद करने के लिए एक तेजी से और सही विधि आणविक जांच के साथ पता लगाने और रोगाणुओं की मात्रा का ठहराव के लिए की जरूरत है, cytometry (FCM) प्रवाह प्रदान करता है को देखते हुए। झिल्ली अखंडता का पता लगाने के लिए मॉडल सायनोबैक्टीरिया में Microcystis aeruginosa Sytox ग्रीन और Sytox ऑरेंज उपयोग करके, हम एकल कोशिका मृत्यु दर में तेजी से संकेत के लिए एक हस्तांतरणीय विधि का विकास। कार्रवाई का एक तुलनीय मोड है कि इसी तरह की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ अन्य उत्पादों रहे हैं, हालांकि इस पत्रिका के भीतर इस्तेमाल आणविक जांच (क्रमशः के रूप में हरे या नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच के लिए भेजा जाएगासामने जांच उल्लेख n करने के लिए, हम विशेष रूप से) का उल्लेख है। आणविक जांच का उपयोग कर प्रोटोकॉल एकाग्रता और ऊष्मायन समय में मुख्यतः भिन्न प्रजातियों के बीच बदलती हैं। M.aeruginosa पर निकल पड़े इस प्रोटोकॉल के बाद हरी न्यूक्लिक एसिड जांच 30 ऊष्मायन के मिनट और 10 मिनट के बाद 1 माइक्रोन पर नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच के बाद 0.5 माइक्रोन की सांद्रता में अनुकूलित किया गया था। झिल्ली क्षति के साथ कोशिकाओं की रिपोर्टिंग के तहत एक करने के लिए नेतृत्व कहा इष्टतम से कम दोनों जांच सांद्रता में। इसके विपरीत, दोनों जांच में 5 माइक्रोन सांद्रता और उच्च 'जी' 'कोशिकाओं अलाभकारी' सेल नंबर के एक से अधिक प्रतिनिधित्व करने के लिए अग्रणी लक्ष्य प्रतिदीप्ति का उत्पादन किया है जिसके तहत गैर विशिष्ट धुंधला का एक प्रकार का प्रदर्शन किया। नियंत्रण पीढ़ी के औचित्य बहस का विषय बनी हुई है, हालांकि सकारात्मक नियंत्रण (गर्मी मारे गए), परीक्षण योग्य मृत बायोमास प्रदान की है। हरे और नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच हम डी के अनुकूलन के लिए कदम के एक तार्किक अनुक्रम प्रदर्शन करकेप्रभावी ढंग से cyanobacterial शारीरिक स्थिति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक प्रोटोकॉल बनाने के लिए कैसे monstrate।

Introduction

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सेल लगातार शारीरिक मापदंड को संशोधित करने और अपने कार्य को बदलकर वातावरण का जवाब है, जो एक जटिल प्रणाली है। 3 - isogenic माइक्रोबियल आबादी प्रकृति में और प्रयोगशाला दोनों की जनसंख्या गतिशीलता भी अपेक्षाकृत स्थिर पर्यावरण की स्थिति 1 के तहत होने वाली है, उप-जनसंख्या के विकास से प्रभावित हैं। प्राकृतिक माइक्रोबियल समुदायों की परिवर्तनशीलता के कारण पर्यावरण की स्थिति का अत्यधिक परिवर्तनशील प्रकृति के लिए उठता है। ये कभी कभी stochastic प्रक्रियाओं बाद में आबादी औसत करने के लिए बहुत अलग हैं कि उप-जनसंख्या का उत्पादन। हाल ही में सबूत इन ​​शारीरिक उप-जनसंख्या पर्यावरण की स्थिति के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया और नाटकीय रूप से प्रभावित करते हैं और कुल जनसंख्या 3,4 को प्रभावित करने वाले संकेत यौगिकों या अवरोधकों उत्पादन कर सकते हैं कि पता चला है।

आबादी के भीतर विविधता को परिभाषित करने के लिए एक विधि की स्थापना के लिए संयुक्त राष्ट्र की कुंजी हैविभिन्न वातावरण में रोगाणुओं की पारिस्थितिकी derstanding और heterocysts की तरह विशेष कोशिकाओं के विकास, पर्यावरण के उतार-चढ़ाव के जवाब में रूपात्मक विविधता को प्रदर्शित जो भारी प्रभाव डालता है मानव जल सुरक्षा पर। प्रजाति ऐसी Anabaena के रूप में विषाक्त Microcystis, के रूप में, उपद्रव साइनोबैक्टीरीया के ज्ञान का निर्माण जब आवश्यक है और akinetes 2। इसके विपरीत, Microcystis कोशिकाओं में एक तनाव प्रतिक्रिया के दौरान स्पष्ट रूपात्मक विविधता प्रदर्शित नहीं करते। व्यवहार्य और अलाभकारी कोशिकाओं के बीच भेदभाव शारीरिक भेदभाव का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है और माइक्रोबियल जनसंख्या गतिशीलता का एक बेहतर समझ की अनुमति देता है। हालांकि, बैक्टीरियल व्यवहार्यता के ही वैचारिक समस्या मुश्किल और खराब 1,5,6 विशेषता बनी हुई है।

प्रवाह cytometry (FCM) व्यक्तिगत कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय और तेजी से विधि है। एकल कक्ष फिजियो की समझ बढ़ाने के लिएFCM के माध्यम से सना हुआ, आणविक जांच चयापचय और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं 7 के एक नंबर भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह एक सेलुलर और जनसंख्या के स्तर पर प्रजातियों की वृद्धि हुई ज्ञान के लिए नेतृत्व किया और बदले में जल संसाधन प्रबंधन 8,9 में मदद मिली है। हालांकि, जीवों की वजह से आणविक जांच डिजाइन और प्रोटोकॉल कार्यान्वयन 6,10,11 के एक नंबर करने के लिए नेतृत्व किया है, जो सेलुलर दीवारों और झिल्ली के छिद्रों और पंप, आणविक जांच तेज और तपका के मामले में भिन्न होते हैं। वाणिज्यिक और अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उपलब्ध आणविक जांच अक्सर एक बहुत ही अलग सेल प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है जो एक सामान्य प्रोटोकॉल के साथ आपूर्ति की जाती है। एक दूसरे से 6 एक प्रकार की कोशिका के लिए विकसित प्रोटोकॉल को स्थानांतरित करने में बहुत सावधान रहना होगा, इसे प्रभावी ढंग से उपयोग करने से पहले आणविक जांच अनुकूलन करने के लिए एक आवश्यक कार्य इसलिए है।

हरे और नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच न्यूनतम आधार के साथ डबल और सिंगल फंसे न्यूक्लिक एसिड दोनों के लिए बाध्य चयनivity और कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली अखंडता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हरी न्यूक्लिक एसिड जांच भी सेल व्यवहार्यता का एक संकेतक के रूप में कार्य कर सकते हैं, जो इस तरह propidium आयोडाइड आधारित यौगिकों के रूप में 12 अन्य आणविक जांच, की तुलना में एक स्पष्ट रूप से सुधार सेल लेबलिंग प्रतिदीप्ति संकेत है। शब्द 'सेल व्यवहार्यता' यहाँ डीएनए गिरावट प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के नुकसान के बाद होता है कि मानता है। न्यूक्लिक एसिड जांच तीन सकारात्मक आरोपों के साथ भोंडा जाती रंजक हैं और दोनों यूकेरियोटिक 11,13 और प्रोकार्योटिक 14,15 जीवों में, विशेषता सांद्रता के तहत बरकरार झिल्ली के साथ कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकते हैं। न्यूक्लिक एसिड के लिए एक न्यूक्लिक एसिड जांच के बंधन उनकी झिल्ली अखंडता समझौता है कि कोशिकाओं में अंतर्जात संकेतों से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का एक> 500 गुना वृद्धि करने के लिए हो सकता है। ऐसे हरी न्यूक्लिक एसिड जांच के रूप में आणविक जांच एकल कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान का एक अच्छा संकेत हो सकता है, एक की जरूरत है टीअकेले Microcystis प्रयोगों में 0.5 माइक्रोन 15 - - 0.1 माइक्रोन से 30 मिनट और एकाग्रता पर्वतमाला - 19 ऊष्मायन बार 7 मिनट से अलग है के रूप में ओ, इच्छित लक्ष्य जीव के साथ हर जांच का अनुकूलन।

यहाँ हम हरे रंग की cytometric assays और (तारीख को cyanobacterial प्रजातियों M.aeruginosa पर परीक्षण नहीं किया गया है) अपेक्षाकृत नई नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच अनुकूलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। निम्नलिखित विकसित पद्धति तो अन्य प्रजातियों को हस्तांतरित करने और इस तरह के रोगाणुओं की समझ और उनके पारिस्थितिक व्यवहार बढ़ रही है, अन्य आणविक जांच में प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

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आण्विक जांच और फ्लो cytometer की 1. तैयारी

  1. Ultrapure फ़िल्टर्ड एच 2 ओ में आवश्यक सांद्रता की aliquots को dimethylsulfoxide (DMSO) में एक 5 मिमी समाधान के रूप में आपूर्ति की जाती है, जो न्यूक्लिक एसिड जांच, के शेयर समाधान पतला
  2. 25 सी जब तक उपयोग - -5 सी और बीच अंधेरे की स्थिति में न्यूक्लिक एसिड जांच स्टोर।
  3. प्रवाह और लोड सॉफ्टवेयर पैकेज पर बारी (FCM विनिर्देशों के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें)।
  4. नमूना इंजेक्शन जांच (एसआईपी) पर एक खाली haemolysis ट्यूब (12 x 75 मिमी), जगह FCM सफाई की प्रक्रिया शुरू करने के लिए वापस फ्लश तो unclog और क्लिक करें।
    नोट: एसआईपी के लिए कुछ नमूना चरणों microcentrifuge ट्यूब सहित नलियों के कई प्रकार समायोजित कर सकते हैं। FCM तंत्र में इस्तेमाल किया आणविक जांच मंदक और म्यान तरल पदार्थ एक विश्लेषणात्मक ग्रेड "टाइप 1" 0.22 माइक्रोन झिल्ली फ़िल्टर किया स्रोत से है।
  5. जगह15 मिनट के लिए और तेज करने के लिए एक fluidic गति (या> 66 μl / मिनट के प्रवाह की दर) - एसआईपी पर ultrapure फ़िल्टर्ड एच 2 ओ के 2 मिलीलीटर के साथ एक ताजा haemolysis ट्यूब, 10 के लिए एक समय सीमा निर्धारित करें।
  6. पृष्ठभूमि शोर को कम करने और 'रन' क्लिक करने के लिए प्रतिदीप्ति और प्रकाश बिखराव चैनलों के लिए प्रासंगिक थ्रेसहोल्ड पर डाल एक नया डेटा सेल, का चयन करें।
  7. प्रति सेकंड की कुल घटनाओं निर्माताओं 'सिफारिश नीचे नहीं कर रहे हैं, तो अनशन पर 2 मिनट के लिए परिशोधन समाधान के 2 मिलीलीटर नमूना चलाने के लिए और उसके बाद 1.4 और 1.5 चरणों को दोहराएँ।
    नोट: वे मॉडलों के बीच अलग-अलग हो सकते हैं, के रूप में शुरू हुआ प्रोटोकॉल सफाई FCM के लिए निर्माताओं की सिफारिशों की जाँच करें। विशिष्ट थ्रेसहोल्ड के लिए परीक्षण भी कुछ उपकरण को बढ़ाने या ऑप्टिकल डिटेक्टरों से दर्ज की गई बिजली के संकेत को कम photomultiplier ट्यूब (PMTs) को voltages लाभ लागू करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है के रूप में FCM मॉडल के साथ लाइन में होने की जरूरत है। इस अनुभव में इस्तेमाल FCM मॉडलजाहिर वोल्टेज PMTs तय की और छोटे कणों से 2.0 माइक्रोन और इलेक्ट्रॉनिक शोर बाहर करने के लिए 80,000 आगे प्रकाश तितर बितर (एफएससी-एच) की एक सीमा का इस्तेमाल किया गया है।

संस्कृति और प्रारंभिक कोशिकाओं की गिनती की 2. तैयारी

  1. 120 सी पर 20 मिनट के लिए एक 250 मिलीलीटर बीकर में काई मीडिया (X50 एकाग्रता) के ultrapure फ़िल्टर्ड एच 2 हे और 2 मिलीलीटर की आटोक्लेव 98 मिलीलीटर
  2. एसआईपी के तहत एक ट्यूब में एक उच्च स्थिर राज्य घनत्व जगह नमूना के 2 मिलीलीटर में M.aeruginosa (7806 पीसीसी) की एक प्रारंभिक मोनोकल्चर से। Vortexing या sonication के 20 से किसी भी कॉलोनी गठन disaggregate और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से समान रूप से छितरी हुई कोशिकाओं की पुष्टि करें।
    नोट: अल्ट्रासोनिक तरंगों के लिए अत्यधिक जोखिम सेल करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और सावधानी से किया जाना चाहिए। ऐसे पक्ष प्रकाश बिखराव के रूप में आउटपुट (M.aeruginosa तरह प्रजातियों के रूप में पाया) sonication गैस पुटिकाओं गिर सकते हैं के बाद से (एसएससी-एच) तीव्रता एसई अधिक बन सकता हैnsitive।
  3. FCM सॉफ्टवेयर के भीतर, आगे प्रकाश तितर बितर (एफएससी-एच) से डेटा रिकॉर्ड और अक्ष पर एक लॉग पैमाने में देखने के लिए "लॉग" पर क्लिक करके साजिश विनिर्देशों विन्यस्त करने के लिए एक हिस्टोग्राम भूखंड का चयन करें।
  4. एक अलग उत्पादन में, इस तरह M.aeruginosa में पाया गौण संश्लेषक वर्णक phycocyanin (FL4-एच, 675 ± 12.5 एनएम), के रूप में प्राकृतिक प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड करने के लिए (अक्ष लॉग इन करें) एक और हिस्टोग्राम चयन करें।
  5. Phycocyanin और जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति से उत्सर्जन फिल्टर कर सकते हैं जो एक डिटेक्टर उत्तेजित कर सकते हैं कि एक प्रकाश स्रोत का प्रयोग करें।
    नोट: phycocyanin 600 एनएम से अधिक उत्साहित है और केवल एक लाल बत्ती स्रोत 21 के साथ पता लगाया जाएगा जबकि संश्लेषक वर्णक ऐसे क्लोरोफिल के रूप में, आमतौर पर इस्तेमाल 488 एनएम नीले लेजर के साथ उत्साहित हो सकता है। उत्तेजना प्रकाश स्रोतों के लिए प्रवाह cytometers निर्माता और उत्सर्जन डिटेक्टरों की स्पेक्ट्रा, यहाँ दोनों एक 488 एनएम और एक 640 एनएम लेजर के साथ चेक के साथ इस्तेमाल किया गयाएक 675 ± 12.5 एनएम ऑप्टिकल फिल्टर।
  6. लक्ष्य जीव (10 माइक्रोन) और एक अपेक्षाकृत धीमी गति से प्रवाह की दर (/ मिनट 14 μl) के मूल आकार के लिए निकटतम उच्चतम संकल्प का चयन सेटिंग्स की रिकॉर्डिंग के लिए।
    नोट: सबसे अच्छा समाधान के नमूने के लिए प्रति सेकंड की घटनाओं की सिफारिश विनिर्माण के अनुसार चलाया जाना चाहिए।
  7. प्राप्त डेटा गेट बाहर प्रकाश बिखराव और / या प्रतिदीप्ति संकेतों को एक सीमा से उपयोग करने से पहले इलेक्ट्रॉनिक पृष्ठभूमि शोर या सेल नमूना मलबे की वजह से कर रहे हैं।
  8. एक नए डेटा कक्ष का चयन एक लॉग पैमाने पर एफएससी-एच और एसएससी-एच मानकों के साथ एक घनत्व साजिश बनाने और चलाने के लिए क्लिक करें।
  9. नमूना घनत्व एक अत्यधिक घटना दर की ओर जाता है, तो कमजोर पड़ने कदम सटीकता और परिशुद्धता बढ़ाने के लिए लिया जा सकता है।
  10. घनत्व भूखंड पर पृष्ठभूमि शोर या मलबे (एफएससी <320,000) द्वारा उत्पादित निम्न स्तर बिखराव का संकेत है, बाहर करने के लिए पिछले हिस्टोग्राम से सॉफ्टवेयर फाटकों लागू होते हैं। उच्च सापेक्ष प्रतिदीप्ति विपरीत फाटकphycocyanin कोशिकाओं से संकेतों और केवल इन घटनाओं (- 1,950,000 FL4, 56,000) शामिल हैं।
  11. मिलीलीटर प्रति कितने कोशिकाओं को बाहर काम करने के लिए, gated क्षेत्रों में दर्ज की कोशिकाओं की संख्या का प्रयोग करें और FCM के माध्यम से पारित कर दिया गया है कि नमूने की कुल मात्रा से विभाजित।
    नोट: यहां इस्तेमाल FCM मॉडल नमूना मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देता है एक माइक्रोप्रोसेसर नियंत्रित क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप प्रणाली है। अन्य FCM उपकरण नपे-तुले मनका निलंबन या कुल नमूना मात्रा सत्यापित करने के लिए एच 2 ओ वजन / मात्रा मतभेद की एक गणना आवश्यकता हो सकती है।
  12. M.aeruginosa के एक बैच के विकास चक्र (250,000 कोशिकाओं / एमएल) शुरू करने के क्रम में हौसले से तैयार मीडिया के लिए कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा में जोड़ें।
    नोट: प्रजाति तो एक बैच चक्र जीवन चक्र के चरणों का निर्धारण करने के लिए पूर्व दर्ज किया जाना चाहिए उनकी यथास्थान पर्यावरण मानकों और पोषक तत्वों की उपलब्धता पर निर्भर करता है विकास दर में अलग होगा।

3. Optimआण्विक जांच सेल तेज की ization

  1. M.aeruginosa संस्कृति की फसल आधे घातीय चरण से चरण 2 में तैयार किया है और एक 'जी' नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल करते हैं।
    नोट: सीधे एक घातीय चरण के लिए एक उच्च घनत्व संस्कृति से पतला नमूने एक प्रारंभिक अंतराल / शामिल चरण से टीका संस्कृतियों की तुलना में, मृत सेल कारोबार के माध्यम से अनुकूलन के परिणामों को प्रभावित कर सकता है।
  2. 30 मिनट 6,11,22 के लिए 1 घंटा, paraformaldehyde या 4% formaldehyde के लिए 60 सी में तरीकों जैसे 70% इथेनॉल, हीटिंग नमूने का उपयोग करके एक 'मृत' नियंत्रण के रूप में अन्य आधा तैयार करें। नमूने microenvironment में बदलाव (उदा।, पीएच) की जाँच करें।
    नोट: M.aeruginosa में सकारात्मक, गर्मी की मौत हो गई, 'मृत' नियंत्रण phycocyanin संकेतों में अपनी कमी के माध्यम से एक 'जी' नमूना से विख्यात है। अन्य तरीकों से मृत्यु दर उत्प्रेरण ही उत्पादन का कारण नहीं हो सकता है और वार होगाप्रजातियों में वाई।
  3. के विभिन्न अनुपात का उपयोग मिश्रित नमूने सेट अप 'जी' और 'मृत' नमूने (जैसे, 0%, 25%, 50%, 100%)।
  4. Vortexing या sonication द्वारा कॉलोनी गठन disaggregate और पीएच की जाँच करें।
  5. अपने संबंधित डिटेक्टर के माध्यम से phycocyanin संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए एक 488 एनएम हरे रंग से प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड कर सकते हैं जो डिटेक्टरों के साथ लेजर (FL1, 530 ± 15 एनएम) और नारंगी (FL2, 585 ± 20 एनएम) न्यूक्लिक एसिड जांच और 640 एनएम लेजर का चयन करें।
    नोट: डीएनए के लिए बाध्य करते हैं नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच 570 ​​एनएम के 547 एनएम और उत्सर्जन Maxima के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य है है, जबकि हरी न्यूक्लिक एसिड जांच, 523 एनएम के 504 एनएम और उत्सर्जन Maxima की एक अनुमानित प्रतिदीप्ति उत्तेजना तरंग दैर्ध्य है। एक 488 एनएम आर्गन आयन ठोस राज्य लेजर दोनों आणविक जांच उत्तेजित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, तथापि, (547 एनएम तक) एक हरे रंग की लेजर एक उच्च नारंगी प्रतिदीप्ति का उत्पादन होगा।
  6. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, परिचयनिर्माताओं के साथ आणविक जांच 50% 'जी' और 50% 'मृत' संस्कृति के लिए एकाग्रता की सिफारिश की है और अंधेरे में सेते हैं।
  7. एक नए डेटा कक्ष का चयन पृष्ठभूमि शोर (एफएससी-एच 80,000) कम हो जाएगा कि थ्रेसहोल्ड और चलाता है के साथ एसआईपी के तहत नमूना रखें।
  8. एफएससी-एच और एसएससी-एच पैरामीटर, और तीन histograms के साथ एक घनत्व साजिश बनाएँ। संबंधित आणविक जांच ऑप्टिकल डिटेक्टर चैनल (FL1 या 2), एक phycocyanin उत्सर्जन (FL4-एच) और एक लॉग पैमाने पर अन्य एफएससी-एच, सभी का पता लगाने के लिए उपयोग कर एक हिस्टोग्राम।
  9. समय अंक (1, 5, 10, 15, 30 और 60 मिनट) के एक नंबर पर, अलग डेटा कोशिकाओं में रिकॉर्डिंग, अप करने के लिए 60 मिनट के लिए अंधेरे में न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ M.aeruginosa के नमूने सेते हैं।
    नोट: कुछ रसायनों से संभावित प्रतिक्रिया के लिए निर्माताओं के साथ इस तरह के पीएच जाँच के रूप में मानकों का समायोजन करते हैं (परीक्षण न्यूक्लिक एसिड के लिए एक बफर फॉस्फेट या मोनोवैलेन्ट या दिवा के उच्च स्तर को नियंत्रित नहीं कर सकते हैं जांचव्रत फैटायनों, डीएनए के साथ बंधन कम हो जाएगा के रूप में)।
  10. संबंधित प्रतिदीप्ति जांच चैनल हिस्टोग्राम में, सेल आकार जीवों लक्ष्य के लिए - एक सॉफ्टवेयर गेट केवल एफएससी-एच हिस्टोग्राम (1500000 320000) में शामिल करने के लिए लागू करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सांद्रता बढ़ रही है या M.aeruginosa नमूना या न्यूक्लिक जांच के प्रारंभिक शेयर समाधान की मात्रा कम हो सकते हैं या तो द्वारा बदला जा सकता है, जो 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 और 100 माइक्रोन थे।
  11. प्रतिदीप्ति जांच चैनल में, उच्चतम हिस्टोग्राम में चोटी (- 1,650,000, नारंगी FL2-एच, 30,000 - हरी FL1-एच, 240,000 165,000) के लिए एक और समावेशी सॉफ्टवेयर गेट लागू करते हैं और बाद में गेट कि घनत्व साजिश में सकारात्मक जांच प्रतिदीप्ति।
  12. आणविक जांच सांद्रता (जैसे एक्स 0.1 एक्स 10) और / या तापमान और पीएच स्तर यदि आवश्यक समायोजन, 100% "जी", 100% 'मृत' और मिली जुली संस्कृति के नमूनों के साथ 3.11 - भागो 3.1 कदम।
  13. <ली> न्यूक्लिक एसिड के साथ दाग कोशिकाओं की कुल प्रतिशत खोजने के लिए (आधा कुल एफएससी-एच या एक 100% 'मृत' संस्कृति से लिया गया) 'मृत' कोशिकाओं की मूल सेल घनत्व के लिए सकारात्मक आणविक जांच प्रतिदीप्ति संकेतों की संख्या की तुलना करें जांच।
  14. गैर विशिष्ट धुंधला (एक तरह से एनोवा या विचरण के Kruskal वालिस एक तरह से विश्लेषण में साधनों का उपयोग उत्पादन के बिना सेल न्यूक्लिक जांच तेज की सर्वोच्च प्रतिशत के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल खोजने के लिए प्रत्येक एकाग्रता के भीतर प्रत्येक समय अवधि के लिए यह करो, डेटा) गैर पैरामीट्रिक है।

4. आण्विक जांच प्रतिदीप्ति भेदभाव

  1. आंतरिक या गैर विशिष्ट सेल धुंधला से प्रतिदीप्ति हस्तक्षेप / ओवरलैप के परीक्षण के लिए 50% 'जी' और 50% 'मृत' मिश्रित संस्कृति डेटा का चयन करें और सभी फाटकों दूर ले।
  2. केवल एफएससी-एच हिस्टोग्राम (320,000 - 1,500,000) शामिल करने के लिए एक सॉफ्टवेयर गेट लागू करें लक्ष्य के लिए phycocyanin में, सेल आकार जीवोंचैनल हिस्टोग्राम।
  3. गेट 'मृत' के रूप में चिह्नित सबसे कम चोटी के अलावा के साथ 'जी' के रूप में उच्चतम phycocyanin शिखर और लेबल,।
  4. मतलब तरंग दैर्ध्य दोनों रिकॉर्डिंग, 'जी' और फिर 'मृत' phycocyanin (FL4) का संकेत है कि एक समय में एक का उपयोग कर, संबंधित आणविक जांच प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम चैनल में एक और गेट कदम प्रदर्शन।
    नोट: इस प्रयोग में मृत्यु दर उत्प्रेरण के लिए मोड इस प्रोटोकॉल के तहत स्पष्ट रूप से phycocyanin संकेतों कम हो जाती है, जो गर्मी उपचार, द्वारा किया गया था। 'मृत' कोशिकाओं के उत्पादन आबादी के अन्य तरीकों का अधिग्रहण रन में विभिन्न outputs उपज हो सकती है।
  5. अनुपात सकारात्मक आणविक जांच प्रतिदीप्ति ('मृत') और आंतरिक / गैर विशिष्ट संकेत ('जी') का मतलब तरंग दैर्ध्य प्रोटोकॉल संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए।
    नोट: 'जी' और 'मृत' popul के प्रतिदीप्ति भेदभाव सुधार करने के लिएations, सेल दीवार पारगम्यता और जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति संकेतों 6 में सुधार करने के लिए पोषक तत्व समाप्त हो कोशिकाओं या ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) में सक्रिय दाग तेज करने के लिए कार्बन स्रोत वृद्धि हुई है। वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए कुछ FCM मॉडल में सीमित मुआवजा नमूना अधिग्रहण (पीएमटी वोल्टेज परिवर्तन) के दौरान या बाद विश्लेषणात्मक विशेष सॉफ्टवेयर से उपयोगकर्ता के लिए चालाकी से जोड़ो में सुधार के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है।
  6. 'मृत' कोशिकाओं की सबसे अधिक राशि घटना गैर विशिष्ट धुंधला बिना दाग कर दिया गया है, जहां अनुकूलित प्रोटोकॉल का चयन करें। परीक्षण की एक संख्या है, तो इसी तरह के परिणाम अच्छा प्रतिदीप्ति संकेत भेदभाव के साथ सबसे कम एकाग्रता और ऊष्मायन समय के साथ प्रोटोकॉल, स्वीकार करते हैं। पालन ​​कोशिकामापी बंद प्रक्रिया के लिए निर्देश बनाती है।

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Representative Results

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घातीय चरण में एक M.aeruginosa बैच संस्कृति से आगे प्रकाश तितर बितर (एफएससी) और प्रकाश की ओर तितर बितर (एसएससी) outputs के क्रमश: सेल आकार (व्यास) और आंतरिक दाने की शक्ल के बारे में जानकारी (चित्रा 1 ए) प्रदान करता है। एफएससी M.aeruginosa होने के लिए बहुत बड़ी है और / या छोटे हैं कि कोशिकाओं भेदभाव कर सकते हैं। यह भेदभाव या gating के एक एफएससी निर्गम (चित्रा 1 सी) के कुछ बिंदुओं के बीच रिफाइनिंग डेटा के द्वारा किया जा सकता है। एक लाल बत्ती स्रोत से पूछताछ जब Phycocyanin, M.aeruginosa संश्लेषक तंत्र का एक प्रमुख संविधान एक मजबूत संकेत पैदा (पूर्व: 640, उन्हें: 675 ± 12.5 एनएम) एफएससी में किया है कि इसी तरह आगे गेट आबादी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो, gating लेकिन प्रतिदीप्ति के साथ (चित्रा -1)। एफएससी और प्रतिदीप्ति संकेतों से, डेटा च के लिए M.aeruginosa पर विशिष्ट डेटा के लिए मूल निर्गम (चित्रा 1 ए) से गेटेड किया जा सकताinal सेल मायने रखता है (चित्रा 1 बी)।

साइनोबैक्टीरीया आबादी में सेल प्रति Autofluorescence शारीरिक स्थिति के एक समारोह के रूप में अलग है। यहाँ कोशिकाओं एक घातीय चरण संस्कृति एक 'जी' नियंत्रण आबादी के लिए अपेक्षाकृत अधिक दूर लाल प्रतिदीप्ति दिखा रहा है और 'मृत' नियंत्रण 1 घंटे के लिए 60 सी गर्मी के संपर्क में था से काटा गया। 'जी' जब उच्च रंजित और 'मृत' कम पिगमेंटड नियंत्रण autofluorescence में कम पारी स्पष्ट है मिश्रित कर रहे हैं (आंकड़े 2A और बी)। 'मृत' सेल प्रतिदीप्ति और एफएससी मापदंडों के आणविक जांच ले लिया है कि कुल कोशिकाओं भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। समझौता झिल्ली या 'मृत' कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड जांच पर या तो एक अतिरिक्त संकेत उत्पादन होगा; FL1 चैनल नारंगी न्यूक्लिक एसी के लिए हरी न्यूक्लिक एसिड जांच या FL2 चैनल (585 ± 20 एनएम) के लिए (530 ± 15 एनएम)मूल निवासी 'जी' प्रतिदीप्ति संकेत की तुलना ID जांच (आंकड़े 3 ए और बी),। क्षति झिल्ली के साथ कोशिकाओं में दोनों न्यूक्लिक एसिड जांच की पुष्टि epifluorescence माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा जा सकता है (आंकड़े -4 ए एंड डी)।

हरी न्यूक्लिक एसिड जांच से दाग दिया गया था कि कोशिकाओं के कुल प्रतिशत थे जो मिश्रित नमूनों से प्राप्त किया गया था केवल M.aeruginosa एक एफएससी-एच हिस्टोग्राम (- 1500000 320,000) से कोशिकाओं के आकार में शामिल करने के लिए पूर्व-गेटेड। 50:50 'लाइव: मृत' में नमूना, हरी प्रतिदीप्ति कोशिकाओं 'मृत' सेल की आबादी में मूल घनत्व (की तुलना में था हिस्टोग्राम एक FL1 (530 ± 15 एनएम) की सबसे ऊंची चोटी से गेटेड या तो कुल FSC- संयोग से एच या) केवल 100% 'मृत' सेल के नमूने पर एक अलग सेल गिनती चल रहा है। 100% से ऊपर गैर विशिष्ट धुंधला होता है कि संकेत होगा। हरी nucle लिया था कि कोशिकाओं का मतलब प्रतिशतआईसी एसिड जांच से लेकर; ऊष्मायन के 0.05 माइक्रोन 10 के दौरान 100 माइक्रोन में 177.1 ± 5.1% करने के लिए 1 मिनट के बाद मिनट (1 टेबल) में 15 ± 0.3%। (शामिल नहीं) 1 माइक्रोन से अधिक सांद्रता गैर विशिष्ट धुंधला से पता चला है (यानी।, आणविक जांच को लेने के लिए शुरू कर दिया है कि 'जी' कोशिकाओं)। गैर विशिष्ट धुंधला प्रदर्शन नहीं किया था कि सांद्रता के बीच एक दो तरह एनोवा (0.05-1 माइक्रोन) और हरी न्यूक्लिक एसिड जांच और M.aeruginosa, एफ में ऊष्मायन समय की एकाग्रता के बीच बातचीत में एक समग्र महत्वपूर्ण अंतर दिखाया (12 40) = 6.48, पी <0.001। हरी न्यूक्लिक एसिड एफ (3, 40) का इस्तेमाल जांच = 836.92, पी <0.001 और ऊष्मायन बार एफ (4,40) = 347.98, पी <0.001 की सांद्रता भर में एक मुख्य प्रभाव नहीं था। एक के बाद एक छोटी सी कीमत Tukey परीक्षण 0.5 और 1 माइक्रोन (पी <0.001) और एक को छोड़कर सभी सांद्रता के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर संकेत दिया60 मिनट (पी <0.001) - 1 के सभी ऊष्मायन समय के बीच महत्वपूर्ण अंतर है। हालांकि, एक तरह से एनोवा से एक पद अस्थायी Tukey टेस्ट 0.05 माइक्रोन (P> 0.05) और 1 माइक्रोन (P> 0.05) (चित्रा 5 ए) के लिए 30 और 60 मिनट के बीच अलग नहीं है हरी न्यूक्लिक एसिड जांच का मतलब तेज का पता चला। (FL4 के माध्यम से मापा) आबादी के भेदभाव के लिए FL1 में 'जी' और 'मृत' रिश्तेदार प्रतिदीप्ति संकेतों का मतलब अनुपात को 714 ± 14.8 (RFU) के 60 मिनट बाद 0.1 माइक्रोन में सबसे ज्यादा से हरी न्यूक्लिक एसिड जांच में बताया गया 30 मिनट (तालिका 2) के बाद 100 माइक्रोन में 0.8 ± 0.0 (RFU) की सबसे कम है। 'मृत' 'जी' और FL1 में तीव्रता भेदभाव के लिए रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) के अनुपात की तुलना करना एक तरह से दो एनोवा सांद्रता और ऊष्मायन बार एफ के बीच बातचीत में एक समग्र महत्वपूर्ण अंतर की रिपोर्ट का संकेत पी <हरी न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ 0,001 =। सभी सांद्रता एफ (7,80) = 475.41, पी <0.001 और ऊष्मायन बार एफ (4,80) = 78.28, पी <0.001 भर में मुख्य प्रभाव में एक महत्वपूर्ण अंतर भी हुई थी। 'मृत' कोशिकाओं को मार डाला 'जी' और गर्मी के बीच संकेतों के प्रतिदीप्ति भेदभाव अनुपात 0.05 माइक्रोन और 1 माइक्रोन की सांद्रता के बीच समय के साथ वृद्धि हुई है लेकिन 5 माइक्रोन और 100 माइक्रोन (चित्रा 5 ब) के बीच की कमी हुई।

नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ दाग थे जो कोशिकाओं का प्रतिशत ऊष्मायन के 10 मिनट (तालिका के बाद 100 माइक्रोन में 166 ± 3.5% करने के लिए बढ़ रहे हैं, 1 मिनट के बाद 0.05 माइक्रोन की एकाग्रता में, 4 ± 0.3% की एक मतलब कम प्रतिशत को देखा 3)। फिर 1 से अधिक माइक्रोन भी जीवित कोशिकाओं के गैर विशिष्ट धुंधला प्रस्तुत सांद्रता। एक दो तरह एनोवा between कोई गैर विशिष्ट धुंधला पता चला है जो सांद्रता (0.05-1 माइक्रोन), M.aeruginosa, एफ (12, 40) = 133.55 में सभी नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच की सांद्रता और ऊष्मायन बार के बीच बातचीत में एक समग्र महत्वपूर्ण अंतर सूचना दी पी <0.001। सांद्रता एफ (3, 40) = 6919.67, पी <0.001 और ऊष्मायन बार एफ (3, 40) = 1161.45, पी <0.001 भर में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव नहीं था। हालांकि सिर्फ 1 माइक्रोन पर एक तरह से एनोवा के माध्यम से एक पद अस्थायी Tukey परीक्षण नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच (सभी पी> 0.05) (चित्रा 6A) के तेज में कोई अंतर सांख्यिकीय था 10, 30 और 60 मिनट के बीच है कि ऊष्मायन बार संकेत दिया। FL2 में 'जी' और दाग 'मृत' आबादी के बीच प्रतिदीप्ति संकेत भेदभाव 50 माइक्रोन और 30 मीटर में 60 मिनट के बाद 0.3 ± 0.0 (RFU) के सबसे कम से नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच में बताया गया158.3 ± 0.4 (RFU) के उच्चतम करने के लिए 100 माइक्रोन में 0.1 माइक्रोन (तालिका 4) की एकाग्रता में 60 मिनट के बाद। एक तरह से दो एनोवा सांद्रता और ऊष्मायन समय एफ (28, 80) = 28.12, पी <0.001 के बीच बातचीत में एक समग्र सांख्यिकीय महत्व की सूचना दी। एकाग्रता एफ (7, 80) = 607.9, पी <0.001 और ऊष्मायन बार एफ (4, 80) = 31.24, पी <0.001 का मुख्य प्रभाव भी सब काफी अलग होना पाया गया है। FL2 में मारे गए 'जी' और गर्मी 'मृत' कोशिकाओं से संकेतों के बीच प्रतिदीप्ति भेदभाव 0.05 माइक्रोन और 0.5 माइक्रोन की सांद्रता के बीच समय के साथ वृद्धि हुई लेकिन 1 माइक्रोन और 100 माइक्रोन (चित्रा 6B) के बीच की कमी हुई। इसलिए हरी न्यूक्लिक एसिड जांच के लिए इष्टतम एकाग्रता 30 मिनट की एक ऊष्मायन समय के साथ और नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच के लिए 0.5 माइक्रोन के इष्टतम एकाग्रता 1 माइक्रोन incu है10 मिनट के लिए bated।

आकृति 1
चित्रा 1. एफएससी, एसएससी और M.aeruginosa पीसीसी 7806. (बी) गेटेड एफएससी साथ चित्रा 1 ए के रूप में ही उत्पादन के सुदूर लाल प्रतिदीप्ति (675 ± 12.5 एनएम)। (ए) FSC और एसएससी और के माध्यम से M.aeruginosa की FCM आउटपुट अब तक लाल प्रतिदीप्ति (पूर्व: 640, उन्हें: 675 ± 12.5 एनएम)। सेल के आकार का प्रतिनिधित्व (सी) एफएससी। लाल लाइन में खड़ा तीर पृष्ठभूमि शोर या अन्य आकार कणों को कम करने के लिए gated है उस क्षेत्र को दर्शाता है। लाल रंग के साथ एक घातीय चरण बैच संस्कृति में M.aeruginosa से उत्पादित (डी) उच्च phycocyanin संकेतों क्षेत्रों गेटेड arrowed। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


M.aeruginosa जब गर्मी का इलाज किया। न्यूक्लिक एसिड जांच तेज मान्य किया 'जी' और 'मृत' कोशिकाओं में M.aeruginosa autofluorescence के बदले में चित्रा 2. Phycocyanin सिग्नल शिफ्ट। (ए) एक कम पिगमेंटड 'मृत' जनसंख्या (लाल) के लिए एक उच्च पिगमेंटड 'जी' जनसंख्या (हरा) से स्थानांतरण सुदूर लाल का संकेत है। (बी) एफएससी और परिमाण के लगभग दो आदेशों के बदलाव के साथ अब तक लाल प्रतिदीप्ति संयुक्त outputs के। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
'लाइव' Unstaine से M.aeruginosa में चित्रा 3. ऑरेंज प्रतिदीप्ति शिफ्ट'मृत' दाग कोशिकाओं के लिए डी। 30 मिनट के लिए 1.0 माइक्रोन की एकाग्रता में नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ incubated M.aeruginosa 'जी' और 'मृत' मिश्रित नियंत्रित करता है। (ए) FL2 (585 ± 20 एनएम) चैनल परिमाण के दो आदेशों के माध्यम से एक 'मृत' दाग आबादी (नारंगी) के लिए एक 'जी' बेदाग आबादी (हरा) से एक वृद्धि की पारी की रिपोर्ट। (बी) एक 'मृत' दाग आबादी अब तक लाल संकेतों की कमी हुई है, लेकिन एक 'जी' जनसंख्या (हरा) से FL2 संकेतों में वृद्धि हुई है, जो (नारंगी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. आण्विक जांच के साथ M.aeruginosa की epifluorescence माइक्रोस्कोपी। माइकroscope एक M.aeruginosa 50:50 लाइव से छवियों: न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ incubated मृत आबादी, सभी छवियों बढ़ाई x1,000। (ए) 'मृत' कोशिकाओं द्वारा लिया हरी न्यूक्लिक एसिड जांच की एक epifluorescence छवि। 'लाइव' कोशिकाओं की वजह से क्लोरोफिल के autofluorescence के लिए लाल दिखाई देते हैं। (बी) झिल्ली क्षति के साथ 'जी' हरी pigmented कोशिकाओं और कम पिगमेंटड 'मृत' कोशिकाओं, दिखा चित्रा -4 ए के प्रकाश माइक्रोस्कोप देखें। (सी) लाइव: मृत 50:50 मिश्रित M.aeruginosa आबादी। Epifluorescence माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एक नारंगी रंग का खुलासा 'मृत' कोशिकाओं के साथ (डी) चित्रा 4C से ऑरेंज न्यूक्लिक एसिड जांच ऊष्मायन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 चित्रा 5. ग्रीन न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ लेबल कोशिकाओं का प्रतिशत और 'मृत' FL1 सिग्नल के लिए 'लाइव' का अनुपात। विभिन्न एकाग्रता और ऊष्मायन बार में हरी न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ दाग M.aeruginosa कोशिकाओं का प्रतिशत मतलब। (ए) 0.1 माइक्रोन के 30 मिनट के बाद इष्टतम ऊष्मायन बार दिखा रहा है, पर्याप्त कक्षों, 5 माइक्रोन शो गैर विशिष्ट धुंधला और 0.5 माइक्रोन की सांद्रता और जनसंख्या का लगभग 100% दाग 1 माइक्रोन दाग नहीं था (एक)। (ख) 'लाइव: मृत' एक बहुत तेजी से विकास के चरण और गर्मी इलाज के नमूने से FL1 संकेतों के अनुपात। 0.5 माइक्रोन और 1 माइक्रोन की सांद्रता ऊष्मायन समय के साथ बढ़ FL1 संकेतों (RFU अनुपात परिमाण के दो आदेशों) की अच्छी भेदभाव दिखा। से अधिक 10 माइक्रोन और (ग्राफ पर प्रतिनिधित्व नहीं) की सांद्रता 'जी' एक के गरीब प्रतिदीप्ति संकेत भेदभाव और अतिव्यापी दिखानेघ 'मृत' आबादी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 ऑरेंज न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ लेबल कोशिकाओं का प्रतिशत और 'मृत' सिग्नल 'लाइव' का अनुपात। M.aeruginosa की आबादी में एकाग्रता और ऊष्मायन समय परिवर्तन से परिणाम। एक दर्ज की गई थी कि कोशिकाओं की (ए) मतलब प्रतिशत की सांद्रता के साथ FL2 में नारंगी प्रतिदीप्ति संकेत; 0.1 माइक्रोन और 0.5 माइक्रोन के 10 मिनट बाद 1 माइक्रोन का इष्टतम एकाग्रता के साथ-साथ, 5 माइक्रोन धुंधला जीवित कोशिकाओं (गैर विशिष्ट धुंधला) पर्याप्त कक्षों धुंधला हो जाना नहीं (क)। 'लाइव: मृत' (बी) नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच FL2 में अनुपात lapping पर कोई अच्छा भेदभाव और दिखाने1 माइक्रोन या उससे कम की सांद्रता और 1 माइक्रोन से अधिक सांद्रता के साथ गरीब ओवरलैपिंग FL2 संकेतों (परिमाण के अनुपात में कम से कम एक आदेश) में संकेतों के प्रतिदीप्ति। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सान्द्र। ऊष्मायन समय (मिनट)
(माइक्रोन) 1 5 10 30 60
0.05 15.0 0.3 22.1 0.9 28.1 1.9 41.0 1.9 50.2 2.1
0.1 23.5 1.5 44.1 1.8 54.7 1.6 70.5 0.8 78.3 1.0
0.5 49.0 3.4 74.8 4.8 87.6 3.6 97.3 0.8 98.8 0.1
1 58.5 1.6 77.4 0.7 88.4 0.4 98.0 0.1 99.2 0.1
5 91.4 0.9 98.7 0.5 99.3 0.7 102.2 1.3 106.3 0.8
10 96.1 0.5 97.7 0.1 97.9 0.1 102.0 0.5 113.4 5.1
50 94.6 0.6 99.5 2.3 112.7 3.8 148.7 2.4 153.9 13.0
100 165.8 3.1 174.4 5.7 177.1 5.1 161.5 2.5 159.7 6.6

प्रकोष्ठों में ग्रीन न्यूक्लिक एसिड जांच की तालिका 1. प्रतिशत तेज। हरी न्यूक्लिक एसिड जांच और एक 50% 'जी' और 50% 'मृत' (गर्मी का इलाज) जनसंख्या नमूने का उपयोग अनुकूलन प्रयोग से तालिका दिखा डेटा। दर्ज की गई है कि कोशिकाओं का मतलब प्रतिशतहरी न्यूक्लिक एसिड जांच प्रतिदीप्ति (FL1) एक एफएससी-एच गिनती से प्राप्त 'मृत' कोशिकाओं की कुल संख्या के खिलाफ गणना की गई है। 100% शो गैर विशिष्ट धुंधला ऊपर मूल्यों (एसई रेखांकित)।

सान्द्र। ऊष्मायन समय (मिनट)
(माइक्रोन) 1 5 10 30 60
0.05 92.9 5.4 170.0 10.9 237.2 14.9 385.5 15.0 481.9 17.7
0.1 178.3 18.1 343.0 19।5 437.0 20.6 619.1 12.1 714.1 14.8
0.5 202.5 5.9 308.3 13.1 365.8 33.5 426.8 67.2 480.4 73.2
1 205.8 12.1 225.9 13.7 237.3 15.6 241.5 5.8 263.1 8.1
5 69.9 2.6 53.0 0.6 40.2 1.7 27.1 3.7 21.1 3.4
10 44.3 2.9 28.7 5.6 23.6 4.9 11.6 1.2 7.6 1.4
50 6.9 0.1 3.9 0.1 2.9 0.1 1.2 0.1 1.1 0.1
100 1.7 0.1 1.3 0.1 1.1 0.1 0.8 0.1 0.8 0.1

'लाइव' और 'मृत' सना हुआ M.aeruginosa प्रकोष्ठों में ग्रीन संकेतों के प्रतिदीप्ति तालिका 2 अनुपात। हरी न्यूक्लिक एसिड जांच और गैर विशिष्ट आंतरिक रिकॉर्डिंग के साथ दाग कोशिकाओं के बीच FL1 संकेत भेदभाव। नमूना एक 50% 'जी' और 50% 'मृत' (गर्मी का इलाज) M.aeruginosa निहितसभी एकाग्रता और ऊष्मायन बार पर मापा ही आबादी की (एसई रेखांकित)।

सान्द्र। ऊष्मायन समय (मिनट)
(माइक्रोन) 1 5 10 30 60
0.05 4.0 0.3 14.9 0.2 23.5 0.8 39.1 2.4 37.6 1.5
0.1 14.6 0.4 42.2 0.5 55.0 1.1 72.8 0.9 80.2 0.1
0.5 54.5 0.4 79.8 1.2 86.4 0.4 91.2 0.1 93.2 0.1
1 92.0 0.8 94.8 0.1 96.9 0.6 98.4 0.6 98.4 0.3
5 91.4 1.5 93.5 1.8 102.9 5.4 118.9 0.1 124.8 0.1
10 95.9 1.0 102.4 1.8 132.9 6.0 148.9 4.8 132.8 5.1
50 107.5 3.7 130.6 16.6 145.2 0.2 135.4 16.2 114.6 6.6
100 97.1 0.1 130.7 7.8 166.1 3.5 144.7 6.8 115.1 6.2

प्रकोष्ठों में ऑरेंज न्यूक्लिक एसिड जांच की तालिका 3. प्रतिशत तेज। अनुकूलन डेटा नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच और एक 50% 'जी' और 50% 'मृत' (गर्मी का इलाज) जनसंख्या नमूना उपयोग करने के साथ तालिका। नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच प्रतिदीप्ति (FL2) दर्ज की गई है कि कोशिकाओं का मतलब प्रतिशत एक एफएससी-एच गिनती से 'मृत' कोशिकाओं की कुल संख्या के खिलाफ गणना की गई है (एसई रेखांकित)।

सान्द्र। ऊष्मायन समय (मिनट)
(माइक्रोन) 1 5 10 30 60
0.05 20.4 0.9 41.3 1.3 56.1 2.4 80.4 3.6 83.3 1.8
0.1 31.2 1.4 76.1 2.4 100.9 3.1 146.2 0.6 158.3 0.4
0.5 80.6 0.4 124.9 2.4 137.3 1.1 138.7 </ टीडी> 2.1 132.8 3.9
1 89.7 16.0 80.9 16.9 69.1 10.7 43.0 5.7 35.9 6.5
5 10.4 0.6 7.5 0.1 5.0 1.0 2.7 0.5 1.5 0.1
10 7.0 0.1 3.6 0.3 2.2 0.4 1.6 0.1 1.2 0.1
50 2.2 0.4 1.6 0.3 1.3 0.0 0.6 0.1 0.3 0.0
100 1.7 0.1 1.1 0.1 0.7 0.1 0.3 0.0 0.5 0.2

'लाइव' और 'मृत' सना हुआ M.aeruginosa प्रकोष्ठों में ऑरेंज न्यूक्लिक एसिड की तालिका 4. अनुपात। नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच (FL2) और गैर विशिष्ट आंतरिक रिकॉर्डिंग से दाग कोशिकाओं के बीच FL2 संकेत भेदभाव। नमूना एक 50% 'जी' और 50% 'मृत' (इलाज गर्मी) सभी एकाग्रता और ऊष्मायन बार पर मापा ही आबादी के M.aeruginosa निहित (एसई रेखांकित)।

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Discussion

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15,19,22,23 - आणविक जांच का उपयोग प्रकाशनों की बढ़ी संख्या विश्वसनीय और जानकारीपूर्ण डेटा 5,6,8 प्राप्त किया जा सकता है कि इंगित करता है। अभी तक के रूप में एक ही एकाग्रता और ऊष्मायन समय 6,10 के साथ सभी प्रजातियों भर में कारगर हो सकता है कि सेल व्यवहार्यता के लिए कोई सही दाग नहीं है। बदल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के साथ जांच की भी एक ही प्रकार का सही एकाग्रता और ऊष्मायन समय (टेबल्स 1 और 3) स्थापित करने के लिए एक आवश्यकता को दर्शाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय देखा, नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच के लिए इष्टतम एकाग्रता और ऊष्मायन समय हरी न्यूक्लिक एसिड जांच केवल आधा एकाग्रता की आवश्यकता होगी, जबकि 1 माइक्रोन पर 10 मिनट है, लेकिन तीन बार के रूप में लंबे समय तक (आंकड़े 5 एवं 6) लेता है। 1.0 माइक्रोन से ऊपर सांद्रता के साथ इन सेल impermeant जाती monomers के दोनों गैर झिल्ली घायल कोशिकाओं के साथ स्पेक्ट्रा उत्सर्जन में एक ओवरलैप उत्पादन शुरू कर दिया। सी के इस ओवरलैपgnals गैर विशिष्ट धुंधला जहां 'जी' कोशिकाओं आणविक जांच ले रहे हैं होता है कि सबूत उपलब्ध कराता है। गैर विशिष्ट धुंधला से प्रतिदीप्ति से अधिक है, जिसके परिणामस्वरूप ध्यान से प्रत्येक आणविक जांच और लक्ष्य जीव के लिए स्थापित किया जा करने के लिए प्रोटोकॉल के विकास के लिए की जरूरत को रेखांकित झूठी सकारात्मक उत्पन्न। एक आणविक जांच के अनुकूलन में सबसे महत्वपूर्ण कदम होगा: 1) आणविक जांच FCM साधन के साथ सूचना का आदान प्रदान कैसे समझ; 2) उपयुक्त रहते हैं और मृत नियंत्रण अपनाने; 3) FCM outputs से मानकों को gating के ज्ञान के विकास और 4) में सीटू के वातावरण की समझ के माध्यम से प्रोटोकॉल को संशोधित।

प्रकाश स्रोत, ऑप्टिकल फिल्टर, प्रवाह cytometers भीतर पीएमटी वोल्टेज और डिटेक्टरों को बदलने की क्षमता इतनी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा प्रतिदीप्ति चैनलों के संबंध में निहित लेजर और जहां से क्या उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के बारे में जागरूकता के लिए महत्वपूर्ण हैं, निर्माता से निर्माता के लिए अलग-अलग हो। डेटा के अधिग्रहण के साथ,थ्रेसहोल्ड अन्यथा शायद पृष्ठभूमि शोर, मलबे या मृत सेल समुच्चय के लिए खो जाएगा कि बढ़ती संकल्प लगाया जा सकता है। आणविक जांच ऐसी झिल्ली क्षमता, डीएनए सामग्री और एंजाइम गतिविधि के रूप में एकल पैरामीटर के माध्यम से, खेती के बिना प्रजातियों की व्यवहार्यता में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। हालांकि, पर्यावरण के नमूनों के भीतर एक समान सेल आकार और प्रतिदीप्ति के कई जीव नहीं हो सकता है। Uniagal संस्कृतियों के भीतर इसके अलावा, कोशिकाओं की आबादी अनिवार्य रूप से आणविक जांच तेज प्रभावित कर सकता है, जो शारीरिक राज्यों 3, के एक डिग्री होगा। FCM के मुख्य लाभ में से एक भेद है और वे अक्सर तेजी से और गतिशील शर्तों के अधीन हैं, के रूप में सीटू सूक्ष्मजीवों व्यवहार्यता का अध्ययन करते समय आवश्यक है, जो वास्तविक समय में अलग-अलग सेल स्तर पर शारीरिक राज्यों को चिह्नित करने की क्षमता है। इसके लगातार इस्तेमाल के बावजूद, सेल व्यवहार्यता की अवधारणा अब भी परिभाषित करने के लिए मुश्किल बना हुआ है। आमतौर पर सेलुलर प्रसार करने के लिए आवेदन किया है,व्यवहार्यता बहुत ज्यादा एक विकास आधारित दृष्टिकोण पर रन बनाए है। की स्थिति को पुन: पेश करने के लिए अलग-अलग कोशिकाओं अनुरूप नहीं हो सकता, क्योंकि यह आधार धारणा कमी हो सकती है, लेकिन वे अभी भी संतोषजनक हो सकता है। डीएनए चक्र या चयापचय आधारित जांच में झूठी नकारात्मक देने के लिए एक आणविक जांच के साथ बातचीत नहीं कर सकते हैं एक निष्क्रियता या एक जी (0) कोशिका चक्र चरण 27 में प्रवेश किया है, जो एक nonproliferating शारीरिक स्थिति में कोशिकाओं।

आणविक जांच अनुकूलन करने के लिए प्रयोगशाला हो या हौसले से अलग कक्षों का प्रयोग पारिस्थितिक अध्ययन में इस्तेमाल किया डेटा की रिफाइनिंग सहायता करेगा। बैच संस्कृतियों से अनुकूलन में इस्तेमाल किया कोशिकाओं सामान्यतः घातीय या जल्दी स्थिर चरणों में ले लिया है और उच्चतम व्यवहार्यता है ग्रहण कर रहे हैं। बाह्य मेट्रिसेस उत्पादन उच्च सेल घनत्व, एक देर स्थिर चरण में उन लोगों या रोगाणुओं का उपयोग करते हैं, तथापि, अतिरिक्त सावधानी लिया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में कोशिकाओं के मृत जनसंख्या नियंत्रण के लिए 1 घंटे के लिए 60 सी गर्मी से अवगत कराया गया,माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा झिल्ली को नुकसान और वर्णक गिरावट की पुष्टि (चित्रा 4) और FCM प्रतिदीप्ति आउटपुट (आंकड़े 2 और 3) के साथ। प्राकृतिक कोशिका मृत्यु के कारणों का अनुकरण के रूप में बेहद मुश्किल है; चरती, वायरल सेल, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु या असममित प्रभाग 24 की संभावना से घूस हमेशा संभव या प्रयोगशाला परिस्थितियों में देखा नहीं जा रहे हैं। नैतिकता की प्रायोगिक मोड वे पर्यावरण से प्रेरित तनाव के बराबर नहीं हो सकता है के रूप में अक्सर (जैसे, गर्मी हत्या) पूछताछ कर रहे हैं और कुछ व्यक्तियों की मौत हो गई और अन्य कोशिकाओं कोई नमूदार सेल गिरावट या मौत 3 दिखा रहे हैं जिसके द्वारा एक विषम प्रतिक्रिया, हो सकता है 25। इस तरह के एक विरोधाभास भ्रम 6,23 करने के लिए नेतृत्व करने के रूप में तो नहीं मापा प्रयोगों स्पष्ट रूप से पढ़ाई के बीच सामान्य बनाने सहजता, स्थापित किया जाना चाहिए जिसके द्वारा परिचालन परिभाषा से बचने के लिए।

विभिन्न वैकल्पिक तरीकों हवलदारई आणविक जांच के साथ संयोजन के रूप में संस्कृतियों में विश्लेषण सेल व्यवहार्यता के लिए नियोजित किया गया। Photobleaching या आसपास की कोशिकाओं से मूर्ति संकेतों की शुरूआत के तहत एक या एक आबादी जल्दी पर्याप्त दर्ज नहीं करता है, तो शारीरिक स्थिति का अनुमान से अधिक दे सकता है, हालांकि Epifluorescence माइक्रोस्कोपी, इस्तेमाल एक परंपरागत तकनीक है। यह संभवतः कम सटीकता के साथ, बहुत मुश्किल इमेजिंग के माध्यम से अनुकूलन बना देता है। जैसे डीएनए और आरएनए प्रवर्धन तरीकों का उपयोग कर दोनों सेलुलर व्यवहार्यता के जीनोमिक मूल्यांकन; पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), भी इस्तेमाल किया गया है ट्रांसक्रिपटेस (आरटी पीसीआर) और न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम आधारित प्रवर्धन (NASBA) रिवर्स। न्यूक्लिक एसिड के हठ भारी संभावित बेहद 28 अलग-अलग वास्तविक सेल व्यवहार्यता के संबंध के साथ, पर्यावरण की स्थिति पर निर्भर करता है लेकिन, जैसा कि जीनोमिक आकलन केवल व्यवहार्यता सत्यापन का एक अप्रत्यक्ष विधि के रूप में कार्य करता है। प्राकृतिक तस्वीरों के माध्यम से प्रकाश बिखराव और / या प्रतिदीप्ति का एक संयोजन का उपयोग करकेडेटा की वृद्धि के संकल्प, दुर्लभ आबादी प्रतिक्रियाओं की पहचान करने और झूठी सकारात्मक परिणामों को कम कर सकते हैं आबादी की ynthetic पिगमेंट (चित्रा 1) gating। आणविक जांच के साथ FCM अपनी गति, सटीकता और कई मापदंडों की रिकॉर्डिंग के लिए एकल कक्ष शारीरिक परीक्षण में पिछले उल्लेख तकनीक से बाहर खड़ा है।

FCM जलीय सूक्ष्म जीव विज्ञान में और आणविक जांच के अलावा के साथ एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण, सहित औद्योगिक क्षेत्रों के लिए एकल कक्ष और समुदाय विश्लेषण क्षेत्रों (जैसे।, पीने के पानी की आपूर्ति की निगरानी) के एक नंबर में एक व्यापक क्षमता है। भविष्य अग्रिमों FCM का पता लगाने और घने विषम नमूने के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं में विशिष्ट आनुवंशिक दृश्यों स्थानीयकरण कर सकते हैं, जिसमें सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति शामिल देख सकता था। में सीटू रिकॉर्डिंग के लिए FCM और आणविक जांच पोर्टेबिलिटी का विकास जल्दी रों को लागू करने के लिए पानी के स्रोतों पर महत्वपूर्ण डेटा प्रदान कर सकता हैसंसाधन प्रबंधन के लिए trategies। यहां विकसित अनुकूलन प्रोटोकॉल के बाद, FCM और आणविक जांच संभावित जलीय वातावरण में सूक्ष्म जीवाणु शरीर विज्ञान के बारे में महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

लेखकों अनुसंधान और सुविधाओं के लिए समर्थन और धन के लिए पीएचडी के छात्र डेव Hartnell और बोर्नमाउथ विश्वविद्यालय को स्वीकार करना होगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences by request BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO

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Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).More

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

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