Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme doi: 10.3791/53036 Published: January 29, 2016

Summary

Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar.

Abstract

Saha ve laboratuvar çalışmaları mikrobiyal alt popülasyonlar morfolojik ve fizyolojik parametrelerin yüksek heterojenite görüntülemek için gösterilmiştir. Mikropların hücre bölünmesi ve metabolik faaliyetler azalır sayede atıl durumda, var gibi bir mikrobiyal hücre gerçek zamanlı durumunu belirlemek, canlı ya da ölü kategorilerde ötesine geçer. Genel nüfus canlılığı belirlemeye yardımcı olmak için hızlı ve doğru bir yöntem moleküler problar ile tespit ve mikropların ölçümü ihtiyacını, sitometri (FCM) akış sağlar Verilen. Membran bütünlüğünü algılamak için bir model siyanobakterilerin olarak Microcystis aeruginosa SYTOX Yeşil ve SYTOX Turuncu kullanarak, tek bir hücre ölümlerinin hızla endikasyon için bir transfer yöntemi geliştirmek. Actio karşılaştırılabilir moduna sahip benzer bir eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile diğer ürünlerin olmasına rağmen, bu derginin içinde kullanılan moleküler problar (sırasıyla yeşil ve turuncu bir nükleik asit problarının anılacaktırön probları belirtilen n, biz özellikle) başvurun. Moleküler problar kullanılarak protokoller konsantrasyon ve inkübasyon süreleri esas olarak farklı türler arasında değişiklik göstermektedir. M.aeruginosa yola Bu protokol izlenerek, yeşil bir nükleik asit probu 30 dakika kuluçkalama ve 10 dakika sonra 1 uM turuncu bir nükleik asit probu sonra 0,5 uM konsantrasyonlarında optimize edilmiştir. Membran hasarı olan hücrelerin raporlama altında yol açtı belirtilen optimum az Her iki probları konsantrasyonlarda. Bunun aksine, her iki sondalarda 5 uM konsantrasyonları ve daha yüksek 'canlı' hücreler 'canlı olmayan hücreli bir sayı üzerindeki gösterimine neden hedef floresan ürettiği ve böylece spesifik olmayan lekelemeye bir tür, sergiledi. Kontrol nesil uygunluğu tartışma konusu olmaya devam rağmen pozitif kontroller (ısı ile öldürülmüş), sınanabilir ölü biyokütle sağladı. Yeşil ve turuncu nükleik asit probları biz de optimize etmek için adımlar mantıklı bir dizisini gösterereketkin bir siyanobakteriyel fizyolojik durumunu analiz etmek için kullanılabilecek bir protokol oluşturmak için nasıl monstrate.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hücre sürekli fizyolojik parametrelerini değiştirerek ve işlevini değiştirerek çevreye yanıt karmaşık bir sistemdir. 3 - izogenik mikrobiyal nüfus doğada ve laboratuar hem de nüfus dinamikleri bile nispeten sabit çevresel koşullar altında meydana gelen 1, alt popülasyonlar gelişimi etkilenir. Doğal mikrobik topluluk değişkenliği nedeniyle çevre koşullarının oldukça değişken doğası ortaya çıkmaktadır. Bunlar bazen stokastik süreçler sonradan nüfus ortalamasına çok farklı subpopülasyonunun üretirler. Son kanıtlar bu fizyolojik alt popülasyonlar çevresel koşullara farklı tepki ve dramatik etkiler ve genel nüfus 3,4 etkileyen sinyal bileşikleri veya inhibitörleri üretebilir ortaya koymuştur.

Bir nüfus içinde heterojenliği tanımlamak için bir yöntem oluşturulması un anahtarıdırÇeşitli ortamlarda mikroplar ekolojisini ların önemli ve heterocysts gibi özel hücrelerin geliştirilmesi, çevresel dalgalanmalara tepki olarak morfolojik heterojenlik gösterir ağır etkiler insan su güvenliği konusunda. Türler gibi Anabaena gibi toksik Microcystis gibi, sıkıntı siyanobakterilerin bilgi oluştururken gereklidir ve akinetes 2. Buna karşılık, Microcystis hücreleri stres yanıtı sırasında belirgin morfolojik heterojenliğini görüntüler yok. Canlı ve cansız hücreler arasında ayrımcılık fizyolojik farklılaşmanın en önemli yönüdür ve mikrobiyal populasyon dinamiği daha iyi anlaşılmasını verir. Ancak, bakteriyel canlılığı kendisinin kavramsal sorunu zor ve kötü 1,5,6 karakterize kalır.

Flow sitometri (FCM) tek tek hücrelerin analiz güvenilir ve hızlı bir yöntemdir. Tek hücreli fizyo anlayışı artırmak içinFCM aracılığıyla logy moleküler problar metabolik ve biyokimyasal süreçlerin 7 bir dizi ayırmak için kullanılmıştır. Bu hücresel ve nüfus düzeyinde türlerin artan bilgiye açtı ve sırayla su kaynakları yönetimi 8,9 yardımcı oldu. Bununla birlikte, organizmalar, moleküler prob tasarımı ve protokolü uygulaması 6,10,11 bir dizi yol açan hücre duvarları ve zarlarına gözenekler ve pompalar, moleküler prob alımı ve efflux bakımından farklılık gösterir. Ticari ve araştırma amaçlı kullanılabilir moleküler problar genellikle çok farklı hücre tipine uygulanabilir genel bir protokol ile temin edilmektedir. Bir başka 6'ya bir hücre tipi için geliştirilen protokoller transferinde çok dikkatli olmalı, etkin kullanımdan önce moleküler problar optimize etmek önemli bir görev bu nedenle.

Yeşil ve turuncu bir nükleik asit probları en az bir baz ile çift ve tek sarmallı nükleik asit hem bağlama seçinivity ve hücrelerin plazma zarı bütünlüğünün değerlendirmek için kullanılır. Yeşil bir nükleik asit probu, hücre canlılığının bir göstergesi olarak hareket edebilir örneğin propidium iodide bazlı bileşikler 12 gibi diğer moleküler problar, kıyasla belirgin bir şekilde daha iyi hücre etiketleme floresan sinyalini alır. Terimi hücre canlılığı, 'burada, DNA parçalanma, plazma zan bütünlüğü kaybı sonra meydana varsayar. Nükleik asit probları üç pozitif ücretleri ile simetrik olmayan siyanin boyalar ve hem de ökaryotik ve prokaryotik 11,13 14,15 organizmalarda karakterize konsantrasyonlarda altında intakt membranlı hücrelere giremez. Nükleik asitlerin bir nükleik asit sondasının bağlanması, bunların zar bütünlüğü tehlikeye sahip hücrelerde endojen sinyallerden flüoresans emisyonlarının a> 500 misline kadar artış ile sonuçlanabilir. Örneğin yeşil bir nükleik asit prob olarak moleküler problar tek hücre fizyolojisinin iyi bir göstergesi olabilir, ancak, bir ihtiyaç vardır tYalnız Microcystis deneylerde 0.5 uM 15 - - 0,1 mcM 30 dakika ve konsantrasyon aralıkları - 19 inkübasyon süreleri 7 dk arasında değiştiği gibi o, amaçlanan hedef organizmanın her prob optimize.

Burada yeşil sitometrik deneyleri ve (bugüne kadar siyanobakteriyel türler M.aeruginosa üzerinde test edilmemiştir) nispeten yeni turuncu nükleik asit probları optimize etmek bir protokol mevcut. Aşağıdaki gelişmiş metodoloji sonra diğer türlere aktarılır ve böylece mikropların anlayış ve ekolojik davranışları artırarak, diğer moleküler problar protokolleri optimize etmek için bir platform olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Moleküler Probe ve Akış Sitometre 1. hazırlanması

  1. Ultra saf süzüldü H2O gerekli konsantrasyonlarda alikuota dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 5 mM çözelti olarak tedarik edilir, nükleik asit prob, ana solüsyonları seyreltin
  2. 25 o C kadar kullanım - -5 o C arasındaki karanlık koşullarda nükleik asit probları saklayın.
  3. Akış sitometresi ve yük yazılım paketi açın (FCM özellikleri için Malzeme / Ekipman tabloya bakınız).
  4. Numune enjeksiyon probu (SIP) boş bir hemoliz tüpü (12 x 75 mm) koyun, FCM temizleme işlemini başlatmak için geri floş sonra unclog ve tıklayın.
    NOT: SIP için bazı örnek aşamaları mikrosantrifüj tüpler dahil tüpler çeşitli barındırabilir. FCM tertibatında kullanılan moleküler prob seyreltici madde ve kılıf sıvısı analitik dereceli "tip 1" 0,22 um membran filtre kaynağı yer alıyor.
  5. Yeri15 dakika karıştırıldı ve hızlı bir akışkan hızına (veya> 66 | il / dakikalık bir akış oranı) - SIP, aşırı saf, süzüldü, H2O, 2 ml taze bir hemoliz tüpü 10 için bir zaman limiti belirlemek.
  6. Arka plan gürültüsünü azaltmak ve 'koşmak' tıklayın floresan ve ışık yayılımı kanallar hakkında eşikler koymak yeni bir veri hücresini seçin.
  7. Saniyede toplam etkinlik üretici firmaların tavsiyelerine altında değilse, o zaman oruç 2 dakika süreyle dekontaminasyon solüsyonu 2 ml örneği çalıştırmak ve daha sonra 1.4 ve 1.5 adımları tekrarlayın.
    NOT: modelleri arasında değişebilir olarak, start-up protokolleri temizlik FCM için üreticilerin öneriler kontrol ediniz. Belirli eşikleri için test de bazı ekipman arttırmak veya optik dedektörler kaydedilen elektrik sinyali azalan photomultiplier tüpleri (Proje Yönetim Ekipleri) için gerilimler kazanımları uygulamak için izin verir FCM modeli ile uyumlu olması gerekir. Bu deney kullanılan FCM modeliment gerilim PMT sabit ve parçacıkları daha küçük 2.0 mm ve elektronik gürültü dışlamak için 80,000 ileri ışık yayılımı (FSC-H) bir eşiğini kullandı.

Kültürler ve İlk Hücre Sayımı 2. Hazırlık

  1. 120 o C'de 20 dakika boyunca 250 ml'lik bir cam kaba alg ortam (x50 konsantrasyonu), aşırı saf, süzüldü H2O ve 2 ml Otoklav 98 mi
  2. SIP kapsamında bir tüp içine, yüksek kararlı durum yoğunluğu yer örnek 2 ml M.aeruginosa (7806 PCC) bir ilk tarımı kaynaktan. Vorteks veya sonikasyon 20 herhangi bir koloni oluşumunu bölmekte ve ışık mikroskobu ile eşit dağılmış hücreleri onaylayın.
    NOT: Ultrasonik dalgalar aşırı maruz kalma hücre erimesi neden olabilir ve dikkatli kullanılmalıdır. Böyle yan ışık yayılımı olarak çıkışlar (M.aeruginosa gibi türlerde bulunan gibi) sonication gaz veziküller daraltabilirsiniz beri (SSC-H) yoğunluk se daha olabilirnsitive.
  3. FCM yazılımı içinde, ileri ışık saçılım (FSC-H) verileri kaydetmek ve eksen üzerinde bir günlük ölçeğinde görüntülemek için "log" linkine tıklayarak arsa özelliklere yapılandırmak için bir histogram arsa seçin.
  4. Ayrı bir çıkış, böyle M.aeruginosa bulunan aksesuar fotosentetik pigment phycocyanin (FL4-H, 675 ± 12.5 nm) gibi doğal floresan kaydetmek için (ekseni log) Başka bir histogram seçin.
  5. Phycocyanin ve elde edilen floresan kaynaklanan emisyonları filtre bir dedektör heyecanlandırmak bir ışık kaynağı kullanın.
    NOT: fikosiyanin 600 nm üzerinde heyecanlı ve sadece kırmızı ışık kaynağı 21 ile tespit edilecektir ise fotosentetik pigment gibi klorofil olarak, yaygın olarak kullanılan 488 nm mavi lazer ile heyecanlı olabilir. Uyarma ışık kaynakları için akış sitometrelerinde üreticisi ve emisyon dedektörleri spektrumları, burada hem 488 nm ve 640 nm lazer ile kontrol ile birlikte kullanılmıştırBir 675 ± 12.5 nm optik filtre.
  6. Hedef organizmanın (10 mikron) ve nispeten yavaş akış hızı (/ dak 14 ul) çekirdek büyüklüğüne yakın yüksek çözünürlük seçme ayarları kayıt için.
    NOT: En iyi çözünürlük örnekleri için saniyede olayların öneri üreten göre çalıştırılmalıdır.
  7. Elde veri kapı dışarı ışık saçılımı ve / veya floresan sinyallerine bir eşik kullanmadan önce elektronik arka plan gürültüsü veya hücre numunesi enkaz neden olduğu.
  8. Yeni bir veri hücre seçin bir günlük ölçeğinde FSC-H ve SSC-H parametreleri ile bir yoğunluk arsa oluşturmak ve çalıştırmak tıklayın.
  9. Numune yoğunluğu aşırı olay oranı neden olursa, seyreltme adımlar doğruluk ve hassasiyetini arttırmak için alınabilir.
  10. Yoğunluk arsa üzerinde arka plan gürültü ya da enkaz (FSC <320000) tarafından üretilen düşük seviyeli dağılım sinyalleri, dışlamak için önceki histogram yazılım kapıları geçerlidir. Yüksek bağıl floresan Tersine kapısıfikosiyanin hücrelerinden gelen sinyaller ve sadece bu olayları (- 1950000 FL4, 56000) içerir.
  11. Ml başına kaç hücre çalışmak, kapı alanlarda kaydedilen hücre sayısını kullanın ve FCM geçti numunenin toplam hacmine bölerek.
    Not: Burada kullanılan FCM modeli örnek hacmi belirlenecek sağlayan bir mikroişlemci kontrollü peristaltik pompa sistemi vardır. Diğer FCM ekipman kalibre boncuk süspansiyonu veya toplam Numune hacmini doğrulamak H 2 O ağırlık / hacim farklılıkları bir hesaplama gerektirebilir.
  12. M.aeruginosa bir parti büyüme çevriminin (250,000 hücre / ml) başlatmak için taze olarak hazırlanmıştır ortama hücrelerin gerekli hacim.
    NOT: Türler yani bir toplu döngüsü yaşam döngüsü aşamaları belirlemek için önceden kaydedilmiş olmalıdır onların yerinde çevre parametreleri ve besin durumuna bağlı olarak büyüme oranlarında farklılık gösterir.

3. OptimMoleküler Probe Hücre Alımı ve zasyon

  1. M.aeruginosa kültür hasat yarım üslü fazda aşama 2'de hazırlanan bir "canlı" bir kontrol olarak kullanırlar.
    NOT: Düz bir üstel faza yüksek yoğunluklu kültüründen seyreltilmiş numuneler bir başlangıç ​​gecikme / indüksiyon fazından aşılanan kültürlerin karşılaştırıldığında, ölü hücre ciro yoluyla optimizasyon sonuçlarını etkileyebilir.
  2. 30 dakika 6,11,22 1 saat, paraformaldehid veya% 4 formaldehit 60 o C'de yöntemleri gibi% 70 etanol, ısıtma örnekleri kullanarak, bir "ölü" bir kontrol olarak, diğer yarısı hazırlayın. Numuneler mikroçevrede varyasyonları (örneğin., PH) kontrol edin.
    NOT: M.aeruginosa pozitif, ısı ile öldürülmüş, 'ölü' kontrol fikosiyanin sinyalleri onun azalması yoluyla 'canlı' örnek ayrılır. Diğer yöntemlerle mortalite uyaran aynı çıktıyı neden olmayabilir ve bir yerdedirtürlerde y.
  3. Farklı oranları kullanılarak karışık örnekleri kurmak 'canlı' ve 'ölü' örnekleri (örneğin,% 0,% 25,% 50,% 100).
  4. Vorteks veya sonikasyonla koloni oluşumunu bölmekte ve pH'ı kontrol edin.
  5. Kendi ilgili dedektör vasıtasıyla fikosiyanin sinyalleri kaydetmek için 488 nm yeşil floresan gelen kaydedebilirsiniz dedektörleri yanında lazer (FL1, 530 ± 15 nm) ve portakal (FL2, 585 ± 20 nm) nükleik asit probları ve 640 nm lazer seçin.
    Not: DNA ya bağlandığı zaman turuncu bir nükleik asit sondası 570 nm 547 nm ve emisyon maksimumlar bir eksitasyon dalga boyuna sahip iken, yeşil bir nükleik asit probu, 523 nm 504 nm ve emisyon maksimumlar yaklaşık flüoresan uyarma dalga boyuna sahiptir. Bir 488 nm argon iyon katı hal lazer hem moleküler problar uyarmak için kullanılabilir, ancak, (547 nm kadar) yeşil bir lazer daha yüksek bir turuncu bir floresan üretir.
  6. Başlangıç ​​noktası olarak tanıtmaküreticileri ile moleküler prob% 50 'canlı' ve% 50 'ölü' kültüre konsantrasyonunu tavsiye ve karanlıkta inkübe edin.
  7. Yeni bir veri hücre seçin arka plan gürültüsünü (FSC-H 80000) azaltacaktır eşikleri ve tetikleyiciler ile SIP altına numuneyi yerleştirin.
  8. FSC-H ve SSC-H parametreleri ve üç histogramlar ile yoğunluk arsa oluşturun. Ilgili moleküler prob optik detektör kanal (FL1 veya 2), tek bir fikosiyanin emisyonlarını (FL4-H) ve bir log ölçeğinde için diğer FSC H, bütün tespit etmek için kullanılarak, bir histogram.
  9. Zaman noktalarında (1, 5, 10, 15, 30 ve 60 dakika) bir sayıda, ayrı bir veri hücrelerinde kayıt kadar 60 dakika boyunca karanlıkta nükleik asit probları ile M.aeruginosa örnekleri inkübe edin.
    NOT: Belirli kimyasalların potansiyel reaksiyonlar için üretmektedir ile pH kontrol gibi parametreler ayarlarken (test nükleik asit için bir tampon fosfat veya tek değerlikli veya diva yüksek düzeyde içeremez sondalarödünç katyonları, DNA bağlanma azalacaktır gibi).
  10. İlgili floresan prob kanal histogram içine hücre boyutu organizmalar hedef - Bir yazılım kapısı sadece FSC-H histogram (1.500.000 320.000) dahil etmek uygulayın.
    NOT: Bu protokolde kullanılan konsantrasyonlar arttırılması veya M.aeruginosa numune veya nükleik prob başlangıç ​​stok çözeltisi hacmi azaldığı biri ile değiştirilebilir 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ve 100 uM idi.
  11. Floresan prob kanalında en yüksek histogram tepe (- 1650000, turuncu FL2-H, 30.000 - Yeşil FL1-H, 240.000 165.000) başka herşey bir yazılım kapısı uygulamak ve daha sonra kapının o yoğunluk arsa içine pozitif prob floresan.
  12. Moleküler prob konsantrasyonları (örneğin x 0.1 x 10) ve / veya sıcaklık ve pH düzeyini gerekirse ayarlanması,% 100 "canlı",% 100 'ölü' ve tüm karışık kültür örnekleri ile 3.11 - Run 3.1 adımları tekrarlayın.
  13. <li> nükleik aside ile boyanmış hücrelerin toplam yüzdesini bulmak için (yarım toplam FSC-H veya% 100 'ölü' kültüründen alınan) 'ölü' hücreleri orijinal hücre yoğunluğuna pozitif moleküler prob floresan sinyalleri sayısını karşılaştırın Problar.
  14. Non-spesifik boyama (bir Tek Yönlü Varyans Analizi veya Kruskal-Wallis tek yönlü analizi araçları kullanmak üretmeden hücre nükleik prob alımı en yüksek yüzdesi için en uygun protokol bulmak için her konsantrasyon içinde her süre için yapın, verileri) parametrik olmayan ise.

4. Moleküler Probe Floresan Ayrımcılık

  1. Intrinsik veya spesifik olmayan hücre boyama floresan girişim / örtüşme testi için 50% 'canlı' ve% 50 'ölü' karışık kültür verilerini seçin ve tüm kapıları kapalı alır.
  2. Sadece FSC-H histogram (320000 - 1500000) dahil etmek için bir yazılım kapısı uygulayın hedef için phycocyanin içine hücre boyutu organizmalarKanal histogram.
  3. Kapısı 'ölü' olarak etiketlenmiş düşük zirve ilavesi ile 'canlı' olarak en yüksek fikosiyanin zirve ve etiket.
  4. Ortalama dalga boylarını hem kayıt, 'canlı' ve ardından 'ölü' fikosiyanin (FL4) sinyalleri aynı anda birini kullanarak, ilgili moleküler prob floresans histogram kanalına başka bir kapı adımı gerçekleştirin.
    NOT: Bu deneyde mortalite başlatılması için mod bu protokol kapsamında açıkça fikosiyanin sinyallerini azaltır ısıl işlem, tarafından yapıldı. 'Ölü' hücreleri üreten popülasyonlarının diğer yöntemler edinilen çalışır farklı çıkışları verebilir.
  5. Oran pozitif moleküler prob floresan ('ölü') ve içsel / spesifik olmayan sinyal ('canlı') ortalama dalga boyları protokol hassasiyetini belirlemek için.
    NOT: 'canlı' ve 'ölü' popul floresan ayrımcılığı artırmak içinkus, hücre duvarı geçirgenliği ve elde edilen floresan sinyalleri 6 geliştirmek için besin tükenmiş hücreleri veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde Etkin leke alımı karbon kaynağı artar. Spektral örtüşme bazı FCM modellerinde sınırlı tazminat örnek edinme (PMT gerilim değişiklikleri) sırasında veya sonrasında analitik özel yazılım kullanıcı-manipüle ikili düzeltme yapılabilir.
  6. 'Ölü' en yüksek hücre miktarı oluşumu non-spesifik boyanması olmadan lekeli olmuştur optimize protokolü seçin. Testin bir numara varsa benzer sonuçlar iyi floresan sinyal ayrımcılık ile birlikte düşük konsantrasyon ve inkübasyon süresi ile protokol kabul. Takip sitometresinin kapatma işlemi için talimat üretmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Üslü fazda bir M.aeruginosa toplu kültüründen İleri doğru ışık saçılımı (FSC) ve yan ışık dağıtma (SSC) çıkışları, sırasıyla, hücre boyutu (çapı) ve iç boyu bilgileri (Şekil 1A) içerir. FSC M.aeruginosa olmak için çok büyük ve / veya küçük olan hücreleri ayırabilir. Bu ayrımcılık veya yolluk bir FSC çıkışı (Şekil 1C) belli noktaları arasındaki rafine verilerle yapılabilir. Kırmızı bir ışık kaynağı tarafından uyarıldığı zaman fikosiyanin, M.aeruginosa fotosentetik tertibatının önemli bir Yapı güçlü bir sinyal üretir (örn: 640; em: 675 ± 12.5 nm) FSC yapılan benzer başka kapısı popülasyonları için kullanılabilir, yolluk ancak floresan ile (Şekil 1D). FSC ve floresan sinyalleri, veriler f M.aeruginosa ilgili belirli bir veri özgün çıktı (Şekil 1A) gelen kapılanmış edilebilirinal hücre sayıları (Şekil 1B).

Siyanobakteri popülasyonlarında hücre başına Otofloresans fizyolojik durumunun bir fonksiyonu olarak değişiklik göstermektedir. İşte hücreler üstel faz kültürü 'canlı' kontrol popülasyonu için nispeten yüksek uzak kırmızı floresan gösteren ve 'ölü' kontrol 1 saat 60 o C ısıya maruz kalmış hasat edildi. 'Canlı' Ne zaman yüksek pigmentli ve 'ölü' alt pigmentli kontroller otofloresansı azalan kayma açıktır karıştırılır (Şekil 2A ve B). "Ölü" hücre flüoresanı ve FSC parametreleri moleküler prob almış toplam hücrelerin ayırt etmek için kullanılabilir. Tehlikeye zar veya "ölü" hücrelerde nükleik asit probları da ek bir sinyal üretecektir; FL1 kanalı turuncu nükleik ac yeşil nükleik asit probu veya FL2 kanalı (585 ± 20 nm) için (530 ± 15 nm)yerli 'canlı' floresan sinyali ile karşılaştırıldığında id prob (Şekil 3A ve B). Hasar zarlarla hücrelerde hem nükleik asit probların Onay Epifloresans mikroskobu ile görülebilir (Şekil 4A-GE).

Yeşil nükleik asit probu ile boyanmış olmuştu hücrelerinin toplam yüzdesi olan karma örneklerinden elde edildi sadece M.aeruginosa bir FSC-H histogramı (- 1500000 320000) hücreler boyutlu dahil öncesi kapılı. 50:50 'canlı: Ölü' numune, yeşil floresan hücreleri 'ölü' hücre popülasyonunda orijinal yoğunluğa (karşılaştırılmıştır histogram bir FL1 (530 ± 15 nm) en yüksek zirveden Geçitli ya toplam FSC bölünmesiyle H veya) Sadece% 100 'ölü' hücre örnekleri üzerinde ayrı bir hücre sayımı koşuyor. % 100 üzerinde spesifik olmayan bir boyama meydana gelir işaret etmektedir. Yeşil Nükleofilik almıştı hücrelerin ortalama yüzdesiic asit sonda arasında değişmektedir; Inkübasyondan 0,05 uM 10 içinde 100 uM olarak 177,1 ±% 5.1 dakika sonra 1 dakika boyunca (Tablo 1) 15 ±% 0.3. (Dahil değil) 1 uM üzerindeki konsantrasyonlar spesifik olmayan lekelenme göstermiştir (yani., Moleküler sondası almaya başladı "canlı" hücreleri) içerir. Spesifik olmayan lekelenme arzetmemiştir konsantrasyonları arasında bir iki-yönlü varyans analizi (0,05-1 uM) ve yeşil bir nükleik asit probu ve M.aeruginosa, F inkübasyon süresi konsantrasyonu arasındaki etkileşim genel bir anlamlı bir farklılık gösterdi (12 , 40) = 6,48, p <0.001. Yeşil nükleik asit F (3, 40) kullanılan prob = 836.92, p <0.001 ve kuluçka süreleri F (4,40) = 347.98, p <0.001 konsantrasyonlarda genelinde temel etkisi oldu. Bir Post-Hoc Tukey testi 0.5 ve 1 mcM (p <0.001) ve dışındaki tüm konsantrasyonları arasında anlamlı bir farklılık belirtilen60 dakika (p <0,001) - 1 her inkübasyon süreleri arasındaki önemli bir fark. Ancak, One Way ANOVA bir Post Hoc Tukey Testi 0.05 uM (p> 0.05) ve 1 uM (p> 0.05) (Şekil 5A) için 30 ile 60 dakika arasında farklı değildir yeşil nükleik asit probunun ortalama alımını saptandı. (FL4 aracılığıyla ölçülen) popülasyonlarının ayrımcılık FL1 içinde 'canlı' ve 'ölü' nispi floresan sinyalleri ortalama oranı ile 714 ± 14.8 (RFU) 60 dakika sonra 0.1 uM en yüksek yeşil nükleik asit prob değişmekteydi 30 dakika (Tablo 2) sonra 100 mcM 0.8 ± 0.0 (RFU) en düşük. 'Ölü' 'canlı' ve FL1 yoğunluk ayrımcılık için göreceli floresan birimi (RFU) oranlarını karşılaştıran İki Yönlü Varyans Analizi konsantrasyonları ve kuluçka süreleri F arasındaki etkileşim genel bir anlamlı fark raporları sinyalleri p <yeşil nükleik asit probu ile 0.001 =. Tüm konsantrasyonlar F (7,80) = 475,41, p <0.001 ve kuluçka süreleri F (4,80) = 78,28, p <0.001 genelinde ana etkisi anlamlı bir fark vardı. Ölü hücreleri öldüren "canlı" ve ısı arasındaki floresan sinyalleri ayrım oranları 0,05 uM ve 1 uM konsantrasyonları arasındaki zamanla artmıştır, ancak 5 uM ve 100 uM (Şekil 5B) arasında azalmıştır.

Turuncu bir nükleik asit probu ile boyandı hücrelerin yüzdesi inkübasyon 10 dakika (Tablo sonra 100 uM olarak 166 ±% 3.5 yükselen 1 dakika sonra 0,05 uM bir konsantrasyonda, 4 ±% 0.3 bir ortalama düşük bir yüzde gördü 3). Yine 1 uM fazla, aynı zamanda canlı hücre spesifik olmayan lekeler sunulmaktadır konsantrasyonlar. A İki Yönlü Varyans Analizi between herhangi bir spesifik olmayan boyanma gösterdi konsantrasyonu (0,05-1 uM), M.aeruginosa, F (12, 40) = 133.55 tüm turuncu bir nükleik asit sondası konsantresi ve inkübasyon saatleri arasında etkileşim genel bir anlamlı fark rapor p <0.001. Konsantrasyonları F (3, 40) = 6919,67, p <0.001 ve kuluçka süreleri F (3, 40) = 1161,45, p <0.001 genelinde istatistiksel olarak anlamlı temel etkisi vardı. Ancak sadece 1 mcM bir One Way ANOVA aracılığıyla Post Hoc Tukey testi turuncu nükleik asit probu (p> 0.05) (Şekil 6A) alımından hiçbir istatistiksel fark yoktu 10, 30 ve 60 dakika arasındaki inkübasyon süreleri belirtti. FL2 içinde 'canlı' ve lekeli 'ölü' popülasyonları arasındaki Floresan sinyali tefrik 50 mcM ve 30 m 60 dakika sonra 0.3 ± 0.0 (RFU) düşük turuncu nükleik asit prob değişmekteydi158,3 ± 0.4 (RFU) ve en yüksek 100 uM olarak 0.1 uM (Tablo 4) bir konsantrasyonda 60 dakika sonra. A İki Yönlü Varyans Analizi konsantrasyonları ve inkübasyon süresi F (28, 80) = 28,12, p <0.001 arasındaki etkileşimler genel bir istatistiksel anlamlılık bildirdi. Konsantrasyon F (7, 80) = 607.9, p <0.001 ve kuluçka süreleri F (4, 80) = 31.24, p <0.001 ana etkileri de tüm önemli ölçüde farklı olduğu tespit edildi. FL2 öldürüldü 'canlı' ve ısı 'ölü' hücrelerden sinyalleri arasındaki Floresan ayrımcılık 0.05 uM ve 0.5 uM konsantrasyonları arasındaki zamanla arttı ancak 1 mcM ve 100 mcM (Şekil 6B) arasında azalmıştır. Bu nedenle, yeşil bir nükleik asit prob için optimal konsantrasyonu 30 dakikalık bir inkübasyon süresi ile ve portakal nükleik asit probu için 0.5 uM optimal konsantrasyon 1 uM incu olduğunu10 dakika boyunca nefese.

figür 1
Şekil 1. FSC, SSC & M.aeruginosa PCC 7806. (B) kapılı FSC ile Şekil 1A aynı çıktı Far Kırmızı Floresans (675 ± 12.5 nm). (A) FSC ve SSC ve Yoluyla M.aeruginosa FCM Çıktıları uzak kırmızı floresan (ex: 640; em: 675 ± 12.5 nm). Hücrenin boyutları temsil (C) FSC. Kırmızı astarlı ok arka plan gürültü ya da diğer boyut parçacıklar azaltmak için işlenir alanı belirtir. Kırmızı üstel faz toplu kültüründe M.aeruginosa üretilen (D) Yüksek fikosiyanin sinyalleri alanları Geçitli oklu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


M.aeruginosa Isıl İşlem Görmüş. Nükleik asit probu alımını doğrulamak için kullanılan 'canlı' ve 'ölü' hücrelerde M.aeruginosa otofloresans Değişikliği Şekil 2. Phycocyanin Sinyal Shift. (A) daha düşük bir pigmentli 'ölü' nüfus (kırmızı) daha yüksek pigmentli 'canlı' nüfus (yeşil) doğru kayıyor Far kırmızı sinyaller. (B) FSC ve büyüklüğü yaklaşık iki siparişlerin bir kayma ile uzak kırmızı floresan kombine çıktılar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
'Canlı' Unstaine itibaren M.aeruginosa Şekil 3. Portakal Floresan Shift"ölü" olarak lekeli hücreler, d. 30 dakika boyunca 1.0 um'lik bir konsantrasyonda turuncu bir nükleik asit probu ile kuluçkalanmıştır M.aeruginosa "canlı" ve "ölü" karışık kontrol eder. (A) FL2 (585 ± 20 nm) kanal büyüklükte iki sipariş yoluyla 'ölü' lekeli nüfus (turuncu) bir 'canlı' lekesiz nüfus (yeşil) bir artış vardiya bildirir. (B) 'ölü' lekeli nüfus çok kırmızı sinyaller azalmış ancak bir 'canlı' nüfus (yeşil) den FL2 sinyallerini arttı (turuncu). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Molecular Probes ile M.aeruginosa Epifloresans Mikroskopi. Microscope bir M.aeruginosa 50:50 canlı görüntüleri: nükleik asit probları ile inkübe ölü nüfus, tüm görüntüler büyütme x1,000. (A) "ölü" hücreler tarafından alınır, yeşil bir nükleik asit probunun bir epifluorışıma görüntüsüdür. 'Canlı' hücreler nedeniyle klorofil otofloresans kırmızı görünür. (B) membran hasarı ile 'canlı' yeşil pigmentli hücreleri ve daha az pigmentli 'ölü' hücreleri gösteren Şekil 4A Işık mikroskobu görünümü. (C) Yaşıyoruz ölü 50:50 karışık M.aeruginosa nüfusu. Epifloresans mikroskobu ile bir portakal rengi açığa 'ölü' hücreleri ile (D) Şekil 4C Orange nükleik asit prob inkübasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5, Şekil 5. Yeşil Nükleik Asit Probe ile etiketli Hücreleri yüzdesi ve 'Dead' FL1 Sinyallerine 'Live' oranı. Farklı konsantrasyon ve inkübasyon zamanlarında yeşil nükleik asit probu ile boyanmış M.aeruginosa hücrelerinin yüzdesini ortalama. (A), 0.1 uM, 30 dakika sonra, en uygun inkübasyon süreleri gösteren, yeterli hücre, 5 uM göstermektedir spesifik olmayan lekeler ve 0.5 uM konsantrasyonunu ve nüfusun yaklaşık% 100 lekeli 1 uM boyanmadı (a) dır. (B) 'Canlı: ölü' üstel büyüme fazı ve ısıl işlem örneklerinden FL1 sinyallerinin oranları. 0,5 uM ve 1 uM konsantrasyonları kuluçka süresi ile artan FL1 sinyalleri (RFU oranlarının iki büyüklük) iyi bir ayırımcılık gösterir. Üzerinde 10 mcM ve (grafikte temsil edilmeyen) konsantrasyonları 'canlı' bir yoksul floresan sinyal ayrımcılık ve üst üste göstermekd 'ölü' popülasyonları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. Turuncu Nükleik Asit Probe ile etiketli Hücreleri yüzdesi ve 'Dead' Sinyallerine 'Live' oranı. M.aeruginosa popülasyonlarında konsantrasyonu ve inkübasyon süresi değişiklikleri sonuçları. Bir kaydettiği hücrelerin (A) Ortalama yüzdesi konsantrasyonlar FL2 turuncu floresan sinyali; 0,1 uM ve 0.5 uM 10 dakika sonra 1 uM optimum konsantrasyonu ile birlikte, 5 uM boyama canlı hücreler (spesifik olmayan boyama) yeterli hücrelerin boyanması (a) '. 'Canlı: Ölü' (B) turuncu nükleik asit probu FL2 içinde oranlar alıştırma yok üzerinde iyi ayrımcılık ve göstermek1 uM veya daha az konsantrasyonlarda ve 1 uM üzerinde konsantrasyonlarda yoksul örtüşen FL2 sinyallerinin (büyüklük oranları daha düşük bir sipariş) floresan sinyalleri. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.

Kons. Kuluçka süresi (dk)
(uM) 1 5 10 30 60
0.05 15.0 0.3 22.1 0.9 28.1 1.9 41.0 1.9 50.2 2.1
0.1 23.5 1.5 44.1 1.8 54,7 1.6 70.5 0,8 78.3 1.0
0.5 49.0 3.4 74.8 4.8 87.6 3.6 97.3 0,8 98,8 0.1
1 58.5 1.6 77.4 0,7 88.4 0.4 98.0 0.1 99.2 0.1
5 91.4 0.9 98.7 0.5 99.3 0,7 102.2 1.3 106.3 0,8
10 96.1 0.5 97.7 0.1 97.9 0.1 102.0 0.5 113.4 5.1
50 94.6 0.6 99.5 2.3 112.7 3.8 148.7 2.4 153,9 13.0
100 165,8 3.1 174.4 5.7 177,1 5.1 161.5 2.5 159,7 6.6

Hücrelerde Yeşil Nükleik Asit Probe Tablo 1. Yüzde Alımı. Yeşil nükleik asit probu ve% 50 'canlı' ve% 50 'ölü' (ısıl işlem görmüş) nüfus örneği kullanılarak optimizasyon denemesine Masa gösteren veriler. Kaydedilen hücrelerin ortalama yüzdeleriYeşil nükleik asit prob, floresan (FL1) bir FSC H sayısı elde edilen "ölü" toplam hücre sayısına karşı hesaplanmıştır. % 100 gösterisi non-spesifik boyanması üzerindeki değerler (SE altı çizili).

Kons. Kuluçka süresi (dk)
(uM) 1 5 10 30 60
0.05 92.9 5.4 170.0 10.9 237,2 14.9 385,5 15.0 481,9 17.7
0.1 178,3 18.1 343,0 19.5 437,0 20.6 619,1 12.1 714,1 14.8
0.5 202.5 5.9 308,3 13.1 365,8 33.5 426,8 67.2 480,4 73.2
1 205,8 12.1 225,9 13.7 237,3 15.6 241,5 5.8 263,1 8.1
5 69.9 2.6 53.0 0.6 40.2 1.7 27.1 3.7 21.1 3.4
10 44.3 2.9 28.7 5.6 23.6 4.9 11.6 1.2 7.6 1.4
50 6.9 0.1 3.9 0.1 2.9 0.1 1.2 0.1 1.1 0.1
100 1.7 0.1 1.3 0.1 1.1 0.1 0,8 0.1 0,8 0.1

'Canlı' ve 'Dead' Lekeli M.aeruginosa Hücrelerde Yeşil Floresan Sinyallerin Tablo 2. oranı. Yeşil nükleik asit probu ve spesifik olmayan içsel kayıtları ile boyanmış hücreler arasında FL1 sinyal ayrımcılık. Numune% 50 'canlı' ve% 50 'ölü' (ısıl işlem görmüş) M.aeruginosa içeriyordutüm konsantrasyon ve inkübasyon süreleri boyunca ölçülen aynı nüfusun (SE altı çizili).

Kons. Kuluçka süresi (dk)
(uM) 1 5 10 30 60
0.05 4,0 0.3 14.9 0,2 23.5 0,8 39.1 2.4 37.6 1.5
0.1 14.6 0.4 42.2 0.5 55.0 1.1 72.8 0.9 80.2 0.1
0.5 54.5 0.4 79.8 1.2 86.4 0.4 91.2 0.1 93.2 0.1
1 92.0 0,8 94.8 0.1 96.9 0.6 98.4 0.6 98.4 0.3
5 91.4 1.5 93.5 1.8 102.9 5.4 118.9 0.1 124.8 0.1
10 95.9 1.0 102.4 1.8 132,9 6 148.9 4.8 132.8 5.1
50 107.5 3.7 130.6 16.6 145.2 0,2 135,4 16.2 114.6 6.6
100 97.1 0.1 130.7 7.8 166.1 3,5 144,7 6.8 115.1 6.2

Hücrelerde Turuncu Nükleik Asit Probe Tablo 3. Yüzde Alımı. Optimizasyon verileri turuncu nükleik asit probu ve% 50 'canlı' ve% 50 'ölü' (ısıl işlem görmüş) nüfus örneği kullanılarak Tablo. Turuncu nükleik asit sonda floresan (FL2) kaydettik hücrelerin ortalama yüzdesi bir FSC-H sayımından 'ölü' hücrelerinin toplam sayısının karşı hesaplanmıştır (SE altı çizili).

Kons. Kuluçka süresi (dk)
(uM) 1 5 10 30 60
0.05 20.4 0.9 41.3 1.3 56.1 2.4 80.4 3.6 83.3 1.8
0.1 31.2 1.4 76.1 2.4 100.9 3.1 146,2 0.6 158.3 0.4
0.5 80.6 0.4 124.9 2.4 137.3 1.1 138.7 </ td> 2.1 132.8 3.9
1 89.7 16.0 80.9 16.9 69.1 10.7 43.0 5.7 35.9 6.5
5 10.4 0.6 7.5 0.1 5.0 1.0 2.7 0.5 1.5 0.1
10 7,0 0.1 3.6 0.3 2.2 0.4 1.6 0.1 1.2 0.1
50 2.2 0.4 1.6 0.3 1.3 0.0 0.6 0.1 0.3 0.0
100 1.7 0.1 1.1 0.1 0,7 0.1 0.3 0.0 0.5 0,2

'Canlı' ve 'Dead' Lekeli M.aeruginosa Hücrelerde Turuncu Nükleik Asit Tablo 4. oranı. Turuncu nükleik asit probu (FL2) ve non-spesifik içsel kayıtlarından boyanmış hücreler arasında FL2 sinyal ayrımcılık. Numune% 50 'canlı' ve% 50 'ölü' (işlenmiş ısı) tüm konsantrasyon ve inkübasyon süreleri boyunca ölçülen aynı nüfusun M.aeruginosa içeriyordu (SE altı çizili).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

15,19,22,23 - moleküler problar kullanılarak yayın artan sayıları, güvenilir ve bilgilendirici veriler 5,6,8 elde edilebileceğini gösterir. Henüz itibarıyla aynı konsantrasyon ve kuluçkalama süresi 6,10 Tüm türler arasında etkili olabilir hücre canlılığı için mükemmel bir leke yoktur. Değişmiş floresan emisyonları ile prob hatta aynı tip doğru konsantrasyon ve inkübasyon süresi (Tablo 1 ve 3) kurmak için bir gereksinim olduğunu göstermektedir. Bu protokolü kullanarak görüldüğü gibi, portakal, nükleik asit prob için optimal konsantrasyon ve kuluçkalama süresi, yeşil bir nükleik asit probu sadece yarısı konsantrasyonu gerekir iken 1 uM'de 10 dakika, ancak üç kez kadar uzun (Şekil 5 & 6) alır. 1.0 uM üzerindeki konsantrasyonlarda bu hücre geçirgenliği olmayan cyanine monomerlerin ikisi olmayan membran yaralı hücreleri ile spektrumları emisyonlarında bir örtüşme üretmeye başladı. Si bu örtüşmegnals non-spesifik boyama nerede 'canlı' hücrelerin moleküler prob kadar alıyor oluşur kanıt sağlar. Spesifik olmayan boyanması gelen floresan üzerinde ortaya çıkan dikkatle her moleküler prob ve hedef organizma için kurulacak protokol geliştirme ihtiyacını vurgulayarak, yanlış pozitif üretti. Moleküler prob optimize en kritik adımlar olacaktır: 1) Moleküler prob FCM alet ile nasıl etkileşim kurduğu anlamak; 2) Uygun canlı ve ölü kontrolleri benimseyerek; 3) FCM çıkışları parametreleri yolluk bilgi geliştirilmesi ve 4) yerinde ortamlarının anlayışı ile protokol değiştirerek.

Işık kaynağı, optik filtreler, akış sitometrelerinde içinde PMT gerilim ve dedektörleri değiştirme yeteneği öylesine emisyon spektrumları floresan kanallarına ilişkin yatıyor lazer ve nereden nasıl uyarma dalga boyu bir farkındalık önemlidir, üreticiden üreticiye farklılık gösterir. Verilerin satın almalar ile,eşikler aksi belki arka plan gürültü, enkaz veya ölü hücre agrega için kayıp olur artan çözünürlük empoze edilebilir. Moleküler sondalar gibi membran potansiyeli, DNA içeriği ve enzim aktivitesi gibi tek parametreleri aracılığıyla, yetiştirme olmadan türlerin canlılığı içgörü sunabilir. Bununla birlikte, çevresel numuneler içinde benzer bir hücre boyutu ve floresan çok organizma olabilir. Uniagal kültürlerin içinde ek olarak, hücre popülasyonları, kaçınılmaz olarak moleküler prob alımını etkileyen fizyolojik durumlarda 3, bir derecesine sahip olacaktır. FCM ana avantajlarından biri ayırt ve genellikle hızlı ve dinamik koşullara tabi olarak, in-situ mikroorganizmalar canlılığı okuyan zaman esastır gerçek zamanlı olarak bireysel hücre düzeyinde fizyolojik durumları karakterize etmek yeteneğidir. Onun sık kullanılmasına rağmen, hücre canlılığı kavramı hala tanımlamak güçtür. Genellikle hücre proliferasyonu uygulanancanlılık çok büyüme temelli yaklaşımla puanlanır. Koşulları çoğaltmak tek tek hücrelerin uygun olmayabilir gibi bu underpinning varsayım, kısa düşebilir ama yine de tolere edilebilir. DNA döngüsü veya metabolik bazlı sondalar yanlış negatifler veren bir moleküler prob ile etkileşime olmayabilir sessizliğini veya G (0) hücre döngüsü aşamasını 27 girdiniz bir proliferasyon fizyolojik durumda hücreler.

Moleküler probları optimize etmek için laboratuvar yetiştirilen ya da taze izole hücreler kullanılarak ekolojik çalışmalarda kullanılan verilerin rafine yardımcı olacaktır. Toplu kültürlerinden optimizasyonu kullanılan hücreler sıklıkla üstel veya erken sabit fazlarda alınan ve en yüksek canlılığı sahip olduğu varsayılır. Hücre-dışı matrisler üretmek yüksek hücre yoğunlukları, bir geç sabit faz durumunda olanlar veya mikroplar kullanarak ancak fazladan dikkatli alınmalıdır. Bu protokol hücrelerin ölü nüfusu kontrol 1 saat 60 o C ısıya maruz bırakıldı,mikroskopi sayesinde görülen membran hasarı ve pigment bozulması onay (Şekil 4) ve FCM floresan çıkışları (Şekil 2 ve 3) ile. Doğal hücre ölüm nedenlerinin simulasyonu olarak son derece zordur; grazers viral lizis, programlanmış hücre ölümü ya da asimetrik bölünme 24 olasılığı ile alımı her zaman mümkün veya laboratuar şartlarında görülebilir değildir. Ahlak Deneysel modları da çevreden kaynaklı streslere eşdeğer olmayabilir sıklıkta (örneğin, ısı öldürme) sorgulanır ve bazı bireyler öldürülmüş ve diğer hücrelerin gözlemlenebilir hücre bozulması ya da ölümü 3 göstermek hangi bir heterojen tepki olabilir , 25. Böyle bir paradoks karışıklığa 6,23 yol olarak değil ölçülen deneyler açıkça çalışmalar arasındaki normalleşme hafifletilmesi, kurulacak gereken operasyonel tanımını önlemek için.

Çeşitli farklı yöntemler have moleküler problar ile birlikte kültürlerde analiz hücre canlılığı ile istihdam edilmiştir. Photobleaching veya yakın hücrelerden eser sinyallerinin giriş bir under veya nüfus yeterince hızlı kayıtlı değilse fizyolojik durum tahmini üzerinde verebilir, ancak Epifloresans mikroskopi, kullanılan geleneksel bir yöntemdir. Bu potansiyel olarak düşük doğrulukla, çok zor görüntüleme yoluyla optimizasyon yapar. Gibi DNA ve RNA büyütme yöntemleri her ikisini de kullanarak hücresel canlılığı genomik değerlendirilmesi; Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) da kullanılmıştır transkriptaz (RT-PCR) ve nükleik asit sekansı bazlı amplifikasyon (NASBA) ters. Nükleik asidin sebat ağır potansiyel gayet 28 farklı gerçek hücre canlılığı korelasyon, çevresel koşullara bağlıdır Ancak, genomik değerlendirme sadece canlılık doğrulama dolaylı bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Doğal fotoğraflar arasında ışık yayılımı ve / veya floresan bir arada kullanarakVerilerin artış çözünürlüğü, nadir nüfus yanıtları belirlemek ve yanlış pozitif sonuçlara azaltabilir: edebilir popülasyonların ynthetic pigmentler (Şekil 1) yolluk. Moleküler prob boyunca FCM, hız, doğruluk ve çoklu parametrelerin kayıt için tek bir hücre fizyolojik test önceki belirtilen tekniklerle sıyrılıyor.

FCM Sucul mikrobiyoloji ve moleküler problar ilavesi ile güçlü bir analitik araç da dahil olmak üzere sanayi sektörlerinde tek hücreli ve toplum analizi alanlarında (örneğin., Içme suyu kaynakları izleme) bir dizi geniş bir potansiyele sahip olduğunu. Gelecek gelişmeler FCM algılar ve yoğun heterojen numunelerin içindeki bireysel hücrelerin spesifik genetik dizileri yerelleştirebilirsiniz in situ hibridizasyon (FISH), içinde floresan dahil görebiliyordu. In-situ kayıtları için FCM ve moleküler prob taşınabilirliği gelişimi erken s uygulamak için su kaynaklarının hayati veriler sağlayabilirkaynak yönetimi için trategies. Burada geliştirilen optimizasyon protokolü takiben, FCM ve moleküler problar potansiyel sucul ortamlarda mikrobiyal fizyolojisi hakkında değerli veriler sağlayan kritik bir rol oynayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Acknowledgments

Yazarlar araştırma ve tesisler için destek ve finansman için doktora öğrencisi Dave Hartnell ve Bournemouth Üniversitesi kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences by request BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
  2. Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144, (1), 3-33 (1999).
  3. Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6, (10), 705-712 (2010).
  4. Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8, (1), 30-36 (2006).
  5. Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
  6. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77, (16), 5571-5576 (2011).
  7. Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. 273-410 (2003).
  8. Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42, (1-2), 269-277 (2008).
  9. Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28, (8), 416-424 (2010).
  10. Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
  11. Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47, (3), 692-702 (2011).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, (6), (1997).
  13. Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57, (1), 305-317 (2012).
  14. Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64, (7), 2697-2700 (1998).
  15. Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47, (July), 195-206 (2012).
  16. Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517, (1-3), 107-120 (2004).
  17. Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19, (1), 20-25 (2004).
  18. Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8, (6), 857-863 (2009).
  19. Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47, (6), 1316-1325 (2011).
  20. Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13, (3), 269-277 (1978).
  21. Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. Academic press. 253-268 (2005).
  22. Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
  23. Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60, (4), 641-696 (1996).
  24. Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36, (1), 11-17 (2013).
  25. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62, (4), 1311-1316 (1996).
  26. Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
  27. Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, (2), 187-206 (2004).
  28. Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53, (2), 175-183 (2003).
Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Akım Sitometri Kullanımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).More

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter