Abstract
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en kompleks meshwork af tværbundne proteiner, som giver biofysiske og biokemiske signaler, der er større regulatorer af celleproliferation, overlevelse, migration osv ECM spiller vigtige roller i udvikling og i forskellige patologier, herunder hjerte-kar- og muskuloskeletale lidelser, fibrose og kræft. Således kunne karakterisere sammensætningen af ECM'er af normale og sygdomsramte væv føre til identifikation af hidtil ukendte prognostiske og diagnostiske biomarkører og potentielle hidtil ukendte terapeutiske mål. Imidlertid har selve karakteren af ECM-proteiner (store i størrelse, cross-linked og kovalent bundne, stærkt glykosyleret) gjort biokemiske analyser af ECM'er udfordrende. For at overvinde denne udfordring, vi udviklet en metode til at berige ECM'er fra friske eller frosne væv og tumorer, der tager fordel af uopløselighed af ECM-proteiner. Vi beskriver her i detaljer decellularization procedure, der består af fortløbende Incubations i buffere med forskellig pH og salt og vaskemiddel koncentrationer og som resulterer i 1) udvinding af intracellulære (cytosol, nukleare, membran og cytoskeletal) proteiner og 2) berigelse af ECM-proteiner. Vi beskriver derefter hvordan deglycosylate og fordøje ECM-beriget proteinpræparater til peptider for efterfølgende analyse ved massespektrometri.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en kompleks meshwork tværbundet og glycosylerede proteiner, der giver arkitektonisk støtte og forankring for celler og definerer, delvist, væv 'biomekaniske egenskaber 1,2. ECM-proteiner også signalere til cellerne enten direkte via deres receptorer (fx integriner, syndecans etc.) eller ved at modulere vækstfaktor signalering 3. ECM dermed giver biofysiske og biokemiske signaler, der er vigtige regulatorer af cellulære processer såsom spredning, overlevelse, polarisering, differentiering, migration osv
ECM spiller centrale roller i fysiologi, udvikling og aldring 4. Desuden er der flere patologier, såsom hjerte-kar-sygdomme, fibrose, muskuloskeletale lidelser, kræft, forårsaget af, eller resultere i, ECM ændringer. Desuden ECM bidrager til opretholdelsen af stamceller nicher og påpege de vigtigste ECM molekyler thved støtte stemness vil have direkte anvendelse i tissue engineering og regenerativ medicin 5. Men på trods af dens betydning, er ECM forblev, indtil for nylig, underexplored 6.
I silico analyse har vist, at matrisome, defineret som ensemble af ECM og ECM-associerede proteiner, omfatter produkter af flere hundrede gener i både menneskelige og mus genomer 1,7,8. Imidlertid har uopløseligheden af ECM-proteiner hindret systematisk karakterisering af sammensætningen af in vivo ekstracellulære matrixer af normale og patologiske prøver. Vi har for nylig vist, at denne uopløselighed kunne vendes til fordel og blive brugt til at berige ECM-proteiner 8-10. Vi og andre endvidere dokumenteret, massespektrometri var en fremgangsmåde til valg at karakterisere sammensætningen af ECM'er 8-10, 13.
Vibeskriver her en decellularization procedure, der består af sekventielle inkubationer i buffere med forskellig pH og salt og opvaskemiddel koncentrationer. Denne procedure resulterer i udvinding (eller udtømning) af cytosoliske, nukleare, membran- og cytoskeletale proteiner, og berigelse af ECM-proteiner. Vi beskriver derefter hvordan at fordøje ECM-berigede proteinpræparater til peptider for efterfølgende analyse ved massespektrometri.
Anvendelse af de procedurer detaljeret og illustreret her, har vi med succes beriget og karakteriseret ved massespektrometri de ekstracellulære matricer fra ti forskellige væv og tumortyper: normal murin lunge 8, human og murin colon 8,9, human lever 9, humane colorektale tumorer og afledte levermetastaser 9, melanoma xenografter 8, brystkirtler tumorxenotransplantater 10, murine pancreas-øer og murine insulinomaer (Naba et al., upublicerede). Sammenligning af de forskellige matrisomes afslørede vævs- og tumorspecifikke ECM signaturer, kan endvidere anvendes som potentielle diagnostiske eller prognostiske biomarkører.
Vi mener, at denne procedure kan anvendes på andre prøver med ingen eller relativt mindre modifikationer.
Protocol
BEMÆRK: Proceduren kan udføres på friske eller flash frosne væv. Vi anbefaler perfusion stærkt vaskulariserede væv med PBS på tidspunktet for dissektion for at fjerne røde blodlegemer og plasmaproteiner. Vi anbefaler ikke at gennemføre proceduren på faste væv som fiksering (dvs. kemisk krydsbinding) forstyrrer decellularization og kan også kompromittere efterfølgende massespektrometrianalyse betydeligt. For hele proceduren, anbefaler vi brug af lav-fastholdelse rør og pipettespidser til at maksimere protein og peptid opsving.
1. Decellularization af væv eller tumorer
BEMÆRK: Før du starter, forberede reagenser og tilføje proteasehæmmere (følger med Rum Protein Extraction kit) til den ønskede mængde af hver buffer. Alle buffere og prøver skal opbevares på is for varigheden af forsøget undtagen Buffer CS, der skal holdes på RT for at forhindre SDS nedbørgrænsning.
BEMÆRK: Protokollen anvender en række inkubering i buffere med forskellig pH og indeholdende forskellige mængder af salte og detergenter til sekventielt ekstrakt intracellulære proteiner og berige for uopløselige ECM-proteiner (figur 1, tabel 1, se også Diskussion alternativer til anvendelsen af kommercielt kit detaljeret her). Mængden af reagenser nedenfor er for 100 mg væv eller tumorer (se tabel 1) og skal justeres hensigtsmæssigt.
- Homogenisere 100 mg væv i 500 pi puffer C indeholdende proteaseinhibitorer ved anvendelse af en vævshomogenisator indtil vævet er fuldstændigt afbrudt, og en homogen suspension opnås.
BEMÆRK: Læg deoxyribonuklease I (endelig koncentration: 200 mg / ml, rekonstitueret i henhold til producentens anvisninger), og ribonuclease A (slutkoncentration: 20 mg / ml, rekonstitueret i henhold til producentens anvisninger) tilBuffer N. - Sekventiel ekstraktion af intracellulære opløselige proteiner
- Ekstraktion af cytosoliske proteiner. Inkubere homogenatet på et rør rotator i 20 minutter ved 4 ° C. Gemme en lille portion (10 pi til 20 pi) af homogenatet til efterfølgende western blot-analyse (se Forventede resultater sektion og figur 2).
- Centrifugeres homogenatet ved 16.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Opsaml supernatanten i et rent rør, vil dette udgøre cytosol (C) fraktion af western blot analyse. Flash fryse denne fraktion og opbevares ved -80 ° C.
- At vaske, pellet resuspenderes i 400 pi puffer W indeholdende proteaseinhibitorer og inkuberes prøven på et rør rotator i 20 minutter ved 4 ° C. Centrifugeres homogenatet ved 16.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Kassér supernatanten.
- At udtrække, nukleare proteiner, pellet resuspenderes i 150 ul buffer N indeholder proteasehæmmere, deoxyribonucleaSE I og ribonuclease A og inkubere prøven på et rør rotator i 30 minutter ved 4 ° C.
- Centrifugeres prøven ved 16.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C, og den ovenstående væske opsamles i et rent rør. Gentag dette trin én gang: efter centrifugering af prøven for anden gang, tilsæt supernatanten til den forrige supernatant: dette vil udgøre det nukleare (N) brøkdel af Western blot analyse. Flash fryse denne fraktion og opbevares ved -80 ° C. Udfør derefter vask som pr trin 1.2.3.
- At ekstrahere membranproteiner, pellet resuspenderes i 100 pi puffer M indeholdende proteaseinhibitorer og inkuberes prøven på et rør rotator i 30 minutter ved 4 ° C. Centrifugeres prøven ved 16.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C
- Opsaml supernatanten i et rent rør: dette vil udgøre membranen (M) fraktion af western blot analyse. Flash fryse denne fraktion og opbevares ved -80 ° C.
- At udtrække cytoskeletproteiner, pellet resuspenderes i 200 pi buffer CS indeholdende proteaseinhibitorer og inkuberes prøven på et rør rotator i 30 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk, at pelleten ikke vil opløses fuldstændigt. Vi foreslår at forstyrre pellet ved pipettering op og ned, indtil observere forstyrrelse af pelleten. - Centrifugeres prøven ved 16.000 xg i 30 minutter ved stuetemperatur. Opsaml supernatanten i et rent rør. Her bemærkes en yderligere markant fald i størrelsen af pellet (se video).
- Pellet resuspenderes i 150 pi af buffer C indeholdende proteaseinhibitorer og inkuberes prøven på et rør rotator i 20 minutter ved 4 ° C. Centrifugeres prøven ved 16.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
- Saml supernatanten og føje den til forrige supernatant: dette vil udgøre cytoskeletal (CS) brøkdel af Western blot analyse. Flash fryse denne fraktion og opbevares ved -80 ° C.
- Udføre yderligere vaske. Pellet resuspenderes i 500 pi PBS indeholdende proteaseinhibitorer ennd inkubere prøven på et rør rotator i 5 min ved 4 ° C. Centrifugeres prøven ved 16.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Kassér supernatanten. Gentag dette trin tre gange.
BEMÆRK: Alle spor af rengøringsmidler skal fjernes af omfattende vask før fordøjelsen af proteinerne i peptider (se afsnit 3). På dette tidspunkt kan ECM-berigede pellet være lynfrosset og opbevaret ved -80 ° C. Bemærk, at størrelsen af pelletten vil afhænge af mængden af uopløselige (ECM) proteiner i udgangsmaterialet og effektiviteten af decellularization.
2. Overvågning af kvaliteten af Decellularization / ECM berigelse ved SDS-PAGE og Western Blot
- Bland 10-20 pi alikvot af total vævsekstrakt og 50 pi prøver af mellemprodukter fraktioner med Laemmli-buffer indeholdende 100 mM DTT. Resuspender ECM-berigede, uopløselige fraktion i 3x Laemmli puffer indeholdende 100 mM DTT.
Bemærk: han forhøjede koncentrationerDTT og SDS bistå med solubilisering af ECM-proteiner, der er relativt uopløselige. - Adskille proteiner ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner.
- Udføre immun-blots ved anvendelse af antistoffer til at overvåge proteiner repræsentant for hver af de cytosoliske, nukleare, membran, cytoskelet og ECM fraktioner (se repræsentant afsnittet Resultater, tabel 2 og figur 2).
3. I-opløsning fordøjelsen af proteiner til peptider for massespektrometri Analyse
BEMÆRK: pellet opnået efter decellularization procedure og fjernelse af SDS er højt beriget i uopløselige ECM-proteiner til yderligere analyse ved massespektrometri disse proteiner skal fordøjes til peptider. Bemærk at, som følge af ECM protein uopløselighed, er det ikke muligt på dette trin for at måle proteinkoncentrationen i prøven. Vi giver således mængder af reagenser til at fordøje ECM-Enritede prøver til peptider baseret på størrelsen (mm) eller tør vægt af ECM-berigede pellet (tabel 3). Løsningerne af ammonium bicarbonat, urinstof, DTT, iodoacetamid og trifluoreddikesyre alle skal være frisklavet.
- Resuspender ECM-beriget prøve ved tilsætning af det passende volumen 8 M urinstof til ECM-berigede pellet og tilsæt DTT ved en slutkoncentration på 10 mM (se tabel 3). Inkuber under kontinuerlig omrøring ved 1.400 rpm i 2 timer ved 37 ° C.
BEMÆRK: På dette tidspunkt ECM-proteiner ikke bliver helt opløst, og de synligt store protein partikler bør ikke kasseres ved centrifugering eller filtrering. Suspensionen vil klart efter deglycosylering og fordøjelse (se video). - Alkylering
- Forbered iodoacetamid løsning HPLC-kvalitet vand. Prøven til stuetemperatur afkøle og tilsæt iodacetamid til en slutkoncentration på 25 mM. For fuldstændig alkylering, DTT: bør iodoacetamid forholdet være mellem 1: 2.5 og 1: 3.
- Der inkuberes i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Deglycosylering:
Bemærk: deglycosylering er nødvendig for at fjerne carbohydratsidekæder som interfererer med identifikation af peptider modificeret ved N-forbundet glycosylering.- Fortyndes til 2 M urinstof med 100 mM ammoniumbicarbonat, pH 8,0, og tilføje den passende mængde af PNGaseF (se tabel 3). Inkuber under kontinuerlig omrøring ved 1.400 rpm i 2 timer ved 37 ° C.
- Fordøjelsen
- Tilføj Lys-C og inkuberes med kontinuerlig omrøring ved 1.400 rpm i 2 timer ved 37 ° C. Tilsæt trypsin og inkuberes med kontinuerlig omrøring ved 1.400 rpm O / N ved 37 ° C.
BEMÆRK: ECM-rige suspension, der begyndte overskyet ved første rekonstituering i 8M urinstof synes klart efter O / N fordøjelse (se video). - Tilføje en anden portion trypsin til prøven og inkuberes med kontinuerlig omrøring ved 1.400 rpm i yderligere 2 timer ved 37 ° C. </ Li>
- Tilføj Lys-C og inkuberes med kontinuerlig omrøring ved 1.400 rpm i 2 timer ved 37 ° C. Tilsæt trypsin og inkuberes med kontinuerlig omrøring ved 1.400 rpm O / N ved 37 ° C.
- Forsuring
- Efter afslutning af fordøjelsen, inaktivere trypsin ved syrning af prøven med frisk fremstillet 50% trifluor-eddikesyre (TFA). Prøven skal nå pH <2. Vi foreslår tilsætning 1-1,5 pi 50% TFA på et tidspunkt og under anvendelse af 1 pi af peptidet løsning til at måle opløsningens pH under anvendelse af pH-papir (se video).
- Centrifugeres forsuret prøve ved 16.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Opsaml supernatanten i en ren lav retention rør. På dette tidspunkt kan peptidet opløsningen opbevares ved -20 ° C.
- Afsaltning
Bemærk: at dette sidste trin normalt udføres ved en massespektrometri facilitet i henhold til deres egne foretrukne metoder.- Forud for proteomics analyse, afsalte prøverne og peptider elueret med frisk fremstillet 60% acetonitril, 0,1% trifluoreddikesyre, efterfulgt af koncentration i vakuum koncentrator. Resuspender peptiderne i frisk fremstillet 3% acetonitrile, 0,1% trifluoreddikesyre 8.
BEMÆRK: at, kan måles ved spektrofotometri efter afsaltning koncentrationen af peptidet opløsning (se forventede resultater afsnit). - Nu analysere prøverne ved massespektrometri, stadig ifølge de optimale procedurer massespektrometri facilitet.
BEMÆRK: Vi opfordrer forskere er interesserede i at karakterisere sammensætningen af ECM'er anvendelse af massespektrometri til at henvise til vores andre publikationer 8-10 og website, der giver yderligere detaljeret forklaring, herunder LC-MS / MS-parametre, masse søgning spektrometri data for protein identifikation og dataanalyse ved hjælp af den i silico matrisome annotation værktøj, vi udviklet 8.
- Forud for proteomics analyse, afsalte prøverne og peptider elueret med frisk fremstillet 60% acetonitril, 0,1% trifluoreddikesyre, efterfulgt af koncentration i vakuum koncentrator. Resuspender peptiderne i frisk fremstillet 3% acetonitrile, 0,1% trifluoreddikesyre 8.
Representative Results
Kvalitetskontrol af decellularization procedure
Effektiviteten af decellularization kan overvåges ved at analysere proteinindholdet i hver fraktion ved western blot. Tabel 2 viser proteiner af diagnostisk værdi at vurdere kvaliteten af decellularization procedure. Figur 2A viser effektiv udtrækning i de mellemliggende fraktioner af cytosolisk (GAPDH ), nukleare (histoner), membran (β1 integrin) og cytoskeletal (actin) proteiner, hvorimod der ikke ECM proteiner (kollagen I) er påvist i disse fraktioner (figur 2). Til gengæld er den endelige pellet beriget for ECM-proteiner og stort set tømt for intracellulære proteiner (figur 2A). Figur 2B viser tilfredsstillende intracellulært protein depletion (ingen histon detekteres i fraktionen ECM-rige), selvom actin stadig kan påvises i ECM-rige fraktion og udtømning af monomert collagen I- Tilsyneladende molekylvægt ~ 110 kDa, formodentlig svarer til usamlet kollagen I - kan observeres i CS fraktionen.
Vi også rutinemæssigt overvåge yderligere ECM-proteiner, såsom fibronectin og laminin, selv om det i nogle væv disse komponenter kan være delvist solubiliseret i tidligere fraktioner 8-10. For eksempel fibronectin forekommer også som opløseligt plasmafibronektin, der ikke er indarbejdet i ECM. Perfusion af vævet før ekstraktion reducerer plasma-fibronectin koncentration, men ikke altid fjerne det. I nogle væv, er lamininer findes løst forbundet med celleoverfladen eller ECM og ekstrakt i mellemliggende fraktioner. Hvis dette sker den kan rettes ved at ændre ekstraktionsbetingelser (se Diskussion).
Bemærk, at berigelsen af ECM-proteiner og samtidig udtømning af intracellulære komponenter er baseret på den relative opløselighed af proteiner i de forskellige buffere. Ther afviger blandt forskellige væv - i nogle tilfælde histoner og actin er lettere ekstraheres end i andre. Bemærk også, at selv forventes hentes i N fraktion (figur 2B) histoner, vi ofte observere en mere fuldstændig udtømning af histoner i M eller CS fraktion (figur 2A og B).
Vejledende peptidkoncentration forventet
Koncentrationen af peptidet opløsning opnået efter fordøjelse, forsuring og afsaltning kan måles ved spektrofotometri enten ved at måle absorbansen af peptidet opløsning ved anvendelse af 280 nm bølgelængde svarende til tryptophan, tyrosin, eller ved hjælp af 205 nm bølgelængde svarende til absorbansen af peptidet bindinger.
Vi målte koncentrationen af peptid-opløsninger opnået fra decellularization af tre murine lunger prøver (82 mg, 100 mg og 100 mg henholdsvis) preparød parallelt og opnået fra hver: 424 ng / pl, 450 ng / pl, og 580 ng / pl af peptider hhv.
Identifikation af ECM peptider ved massespektrometri
Massespektrometrisk analyse af sammensætningen af ECM-beriget proteinprøver, fremstillet som beskrevet her, viser, at> 70% af signalintensiteten svarer til ECM og ECM-associerede proteiner 8-10.
Tabel 1. Omfanget af reagenser fra kompartmental Extraction kit til at decellularize 100 mg (våd vægt) væv eller tumor. Denne tabel viser sammensætningen og mængden af hver buffer bruges til at gennemføre decellularization på 100 mg af væv eller tumor. En cocktail af proteaseinhibitorer er tilvejebragt som en 50x-opløsning og skal sættes til hver puffer 2.
| Reagenser fra Rum Protein Extraction Kit | Volumen for 100 mg væv | Sammensætning (baseret på Millipore datablad cat # 2145 1) |
| Buffer C | 500 pi | HEPES (pH 7,9 3), MgCl2, KCI, EDT 4, saccharose, glycerol, natriumorthovanadat 5 |
| Buffer W | 400 pi | HEPES (pH 7,9), MgCI2, KCI, EDTA, saccharose, glycerol, natriumorthovanadat |
| Buffer N | 150 pi x 2 | HEPES (pH 7,9), MgCl2, NaCl, EDTA, glycerol, natriumorthovanadat |
| Buffer W | 400 pi | HEPES (pH 7,9), MgCI2, KCI, EDTA, saccharose, glycerol, natriumorthovanadat |
| Buffer M | 100 pi | HEPES (pH 7,9), MgCI2, KCI, EDTA, saccharose, glycerol, Sodium deoxycholat (DOC) 6, NP-40 6 |
| Buffer CS | 200 pi | PIPES (pH 6,8), MgCl2, NaCl, EDTA, Saccharose, natriumdodecylsulfat (SDS) 7, natriumorthovanadat |
| Buffer C | 150 pi | HEPES (pH 7,9), MgCI2, KCI, EDTA, saccharose, glycerol, natriumorthovanadat |
| 1x PBS | 500 pl / vask | - |
Bemærkninger:
1 For proprietære årsager kunne vi ikke få den præcise sammensætning af buffere fra leverandøren af kit, men vi inkluderer her nogle noter baseret på vores egne erfaringer ved hjælp af hjemmelavede buffere til at gennemføre lignende ekstraktioner.
2 Protease inhibitor: det er tilrådeligt at indbefatte en række af inhibitorer mod cystein, serin og threonin peptidaser, serinesteraser, divalente kation-afhængige metalloproteinaser etc.Der findes mange kommercielt tilgængelige proteasehæmmere cocktails.
3 pH over 7,0 er en effektiv inhibitor af lysosomale proteaser.
4 EDTA (normalt bruges ved 2 mM) er en effektiv inhibitor af divalente kationer afhængige proteaser.
5 natriumorthovanadat er en phosphatase-inhibitor. En typisk effektiv koncentration ville være 0,5-5 mM.
6 NP40 ved 0,1% -0.5% er tilstrækkelig til at solubilisere mest membranlipider. Kombinationen af NP40 og DOC - ofte anvendes i lige store koncentrationer (f.eks 0,5% af hver) - bruges ofte som en mere stringent ekstraktion, der stadig efterlader mange protein-protein interaktioner intakt.
7 SDS er en mere stringent ionisk detergent (CMC 0,1%). Det kan også anvendes i kombination med de to andre detergenter SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% som et mellemprodukt stringens puffer.
Tabel 2. Diagnostiske proteiner tilovervåge kvaliteten af den decellularization procedure. Denne tabel viser eksempler på proteiner, der er karakteristika for hver subcellulært afsnit (cytosol, kerne, plasmamembran, cytoskelettet og ECM), der kan bruges til at overvåge kvaliteten af decellularization forhandling og effektiviteten af ECM-berigelse.
| Intracellulært | Diagnostiske Proteiner |
| Cytosoliske proteiner | Glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) |
| Kerneproteiner | Histoner, laminer, Nucleoporin |
| Membranproteiner | Integriner, transferrinreceptor |
| Cytoskeletproteiner | Actin tubulin, vimentin |
| Basalmembran ECM-proteiner | Collagen IV, Nidogens, lamininer |
| Interstitielle ECM-proteiner (interstitielle) | Kollagen I, kollagen III, kollagen VI, fibronectin |
For henstilling om antistoffer, se vores publikationer 8-10.
Tabel 3. Volumen af reagenser at fordøje ECM-berigede prøver i peptider. Denne tabel viser de reagenser, der anvendes til at resuspendere ECM-beriget proteinprøver og reducere, alkylat, deglycosylate og fordøje proteiner prøver i peptider før massespektrometrianalyse.
| Reagenser | Forberedelse | Afsluttende Koncentration / Beløb for 1 mm tyk pellet (~ 5-10 mg tørvægt) | Volumen for 1 mm tyk pellet (~ 5-10 mg tørvægt) |
| Ammoniumbicarbonat (NH4 HCO 3) | 100 mM opløsning i HPLC-kvalitet vand | - | - |
| Urea | 8 M opløsning i 100 mM ammoniumbicarbonat | 8 M | 50 pi |
| Dithiothreitol | Rekonstituer i HPLC-kvalitet vand ved 500 mM | 10 mM | 1 pi |
| Iodoacetamid | Rekonstituer i HPLC-kvalitet vand ved 500 mM | 25 mM | 2,5 pi |
| Peptid- N -Glycosidase F (PNGaseF) | Kommerciel opløsning ved 500 U / pl | 1.000 U | 2 pi |
| Endoproteinase LysC, massespektrometri-grade | Rekonstituer i HPLC-kvalitet vand ved 0,5 pg / pl | 1 ug | 2 pi |
| Trypsin, massespektrometri-grade (runde 1) | Kommerciel opløsning ved 0,5 pg / pl | 3 ug | 6 pi |
| Trypsin, massespektrometri-grade (runde 2) | Kommerciel opløsning ved 0,5 pg / pl | 1,5 pg | 3 pi |
| Trifluor-eddikesyre (TFA) | 50% opløsning i HPLC-kvalitet vand | - | 2-5 pi |
| Acetonitril (eluering) | 60% opløsning med 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vand | - | 500 pi |
| Acetonitril (rekonstituering) | 3% opløsning med 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vand | - | 100 pi |
Figur 1. Ordningen af den eksperimentelle procedure. Skematisk workflow af protocol at decellularize væv (Afsnit 1), kontrollere kvaliteten af decellularization og evaluere ECM berigelse (afsnit 2) og fordøje ECM-beriget proteinprøver i peptider før massespektrometri analyse (afsnit 3).
Figur 2. Kvalitetskontrol af decellularization procedure ved western blot Western blots blev udført på murine lunge (A) og human mammae carcinoma xenograft (B) prøver under anvendelse af følgende antistoffer:. Kanin anti-actin (klon 14-1) og kanin-anti -β1 integrin antistoffer produceret i vores laboratorium; kanin-anti-kollagen I, muse-anti-GAPDH og kanin-anti-pan-histoner antistoffer var fra Millipore. Følgende primære antistof inkubation blev membranerne vasket og inkuberet i nærværelse af HRP-konjugeret gede-anti-kanin eller gede-anti-mouSE sekundært antistof fra Jackson ImmunoResearch Laboratory. Endelig blev membranerne vasket og inkuberet i Western Lightning ™ Kemiluminescens Reagent (PerkinElmer LAS). * Angiver minimal residual histon forurening af fraktionen ECM-rige. ** Indikerer delvis udtømning af monomer (formodentlig usamlet) kollagen I i CS-fraktionen. *** Angiver resterende actin forurening af fraktionen ECM-rige. Den påvist med anti-collagen-antistof smear repræsenterer forskellige niveauer af post-translationelle modifikationer (fx tværbinding, glycosylering).
Discussion
Ændringer
Selvom vi ansat netop denne procedure for at berige ECM fra ti væv og tumortyper 8-10, bør ændringer af protokollen skal overvejes i følgende tilfælde:
1) Påvisning af ECM-proteiner i de mellemliggende fraktioner.
Ekstracellulære matricer fra forskellige væv eller tumortyper kan variere i deres ekstraherbarhed / uopløselighed, som diskuteret ovenfor for fibronectin og lamininer. For eksempel antages det, at ECM for fibrotiske væv eller remodeling væv vender meget dynamisk og dermed kunne man iagttage en større andel af ECM-proteiner i disse væv til at være mere kunne udtrækkes 12. Afhængigt af den del, hvori der påvises ECM-proteiner, foreslår vi at reducere inkubationstiden af trinnet forårsager ekstraktion af ECM-proteiner eller udelade dette skridt.
2) Detection af en betydelig del af intracellulære komponenter i ECM-berigede pellet. I nogle væv eller tumortyper ratio celler: ECM er særligt høje (f.eks, lever, milt, ikke-desmoplastiske tumorer). I dette tilfælde kan der observeres en betydelig forurening af ECM-berigede fraktion af intracellulære proteiner (især cytoskeletale proteiner og / eller histoner). At nedbryder intracellulære proteiner effektivt, foreslår vi gentagne gange inkubationen i Buffer M og / eller Buffer CS (begge indeholder rengøringsmidler, dette normalt udtømmer rigelige intracellulære proteiner). Et andet alternativ ville være at anvende alternative puffere med højere koncentrationer detergent, med det forbehold, at dette kan føre til nedbrydning af relativt mere opløselige ECM-proteiner samt (se næste afsnit).
3) Alternativ til anvendelse af et kommercielt kit.
Vi var ikke i stand til proprietære årsager, for at opnå den nøjagtige sammensætning af bufferne from leverandøren af kompartment Protein Extraction kit. Men vi har medtaget i tabel 1 noter baseret på vores egne erfaringer ved hjælp af hjemmelavede buffere med defineret detergent (NP-40, natriumdeoxycholat og SDS) koncentrationer til at gennemføre lignende ekstraktioner. En nylig undersøgelse fremhævede også betydningen af pH i decellularization buffere at beholde ECM-proteiner 13.
Begrænsninger af teknikken
Metoden præsenteres her bygger på den kendsgerning, at ECM-proteiner er uløseligt mere uopløselige end de fleste intracellulære proteiner. Imidlertid decellularization fremgangsmåde beskrevet her bestemt ekstraherer opløselige bestanddele til stede i ECM såsom nogle vækstfaktorer eller ECM-remodellering enzymer. Selv om ECM-associerede proteiner tæt bundet til ECM-proteiner blev detekteret ved proteomics i prøver fremstillet som beskrevet, kan denne metode være for strenge til fuldt ud at profilere sammensætningen af matrisome-associeredeproteiner.
Betydning af teknikken med hensyn til andre metoder
Fordelen ved fremgangsmåden præsenteret her over andre metoder er, at den kan tilpasses til arten af ECM af interesse: mellemliggende trin kan udelades eller gentages for at forhindre tab af ECM-proteiner eller øge udtømning af kontaminerende intracellulære proteiner hhv. Denne metode også bruger kun minimale mængder af detergenter, der skylles af at forhindre deres interferens med efterfølgende fremstilling peptid og massespektrometri. Endelig beskrives her at fordøje ECM-rige proteinpræparater til peptider fremgangsmåde har også den fordel, at den ikke kræver proteiner at være opløselige og kan udføres på "rå" ECM-berigede fraktioner.
Alternative decellularization metoder, der udnytter chaotroper (såsom guanidinhydrochlorid) at studere sammensætningen af ECM'er ved massespektrometri har been rapporteret i litteraturen (gennemgået i 14) og er blevet anvendt i kombination med massespektrometri til at karakterisere ECM sammensætning af brusk 15,16, hjerte 17, brystkirtel 18 og vaskulære 19 og glomerulære 20 basalmembraner.
Anbefalinger
Bør ikke anvendes Decellularization fremgangsmåder, der anvender trypsin at fordøje ud celler, hvis ECM'er er beriget for efterfølgende proteomics analyser, som trypsinisering vil resultere i en delvis ECM fordøjelse og tab af ECM-proteiner og peptider. Tilsvarende hvis kollagenasefordøjelse skulle bruges til at støtte vævssprængning, ville det skal overvåges omhyggeligt, da det forårsager ECM fordøjelse og tab af ECM-proteiner og peptider.
In-opløsning vs. in-gel fordøjelse? ECM-proteiner er tværbundet og meget tungtopløseligt og selv når resuspenderet i 3x Laemmli-puffer (indeholdende 6% SDS) og 100 mM DTT, separat poorly på SDS-geler. Således i-gel fordøjelse er ikke den foretrukne metode.
Fremtidige applikationer
Det er værd at bemærke, at selv ikke behandles her, sammensætningen af hver af de mellemliggende fraktioner indsamlet under decellularization kan også analyseres ved massespektrometri. Dette kan være særligt værdifulde, når studere meget små prøver (dvs. humane biopsier) eller når der ønskes information om andre cellulære fraktioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | |
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 |
References
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308 (2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
