Abstract
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en kompleks meshwork av tverrbundet proteiner som gir biofysiske og biokjemiske signaler som er viktige regulatorer av celleproliferasjon, overlevelse, migrasjon, etc. ECM spiller viktige roller i utvikling og i ulike patologier inkludert kardiovaskulære og muskel- og skjelettsykdommer, fibrose og kreft. Således karakteriserer sammensetningen av ECM'er fra normale og syke vev vil kunne føre til identifisering av nye diagnostiske og prognostiske biomarkører og potensielle nye terapeutiske mål. Imidlertid har selve innholdet av ECM proteiner (store i størrelse, tverrbundet og kovalent bundet, tungt glykosylert) gjengis biokjemiske analyser av ECM'er utfordrende. For å overvinne denne utfordringen, har vi utviklet en metode for å berike ECM'er fra ferske eller frosne vev og svulster som utnyttet uoppløseligheten av ECM proteiner. Vi beskriver her i detalj decellularization prosedyre som består av sekvensiell jegncubations i buffere med forskjellig pH og saltkonsentrasjoner og vaskemiddel og som resulterer i 1) utvinning av intracellulært (cytosolisk, nukleær, membran og cytoskeletal) proteiner og 2) anriking av ECM-proteiner. Vi beskriver deretter hvordan du deglycosylate og fordøye ECM-beriket proteinpreparater inn peptider for senere analyse av massespektrometri.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en kompleks meshwork av krysskoblet, og glykosylert proteiner som gir arkitektonisk støtte og forankring for celler og definerer, delvis, vev 'biomekaniske egenskaper 1,2. ECM-proteiner også signal til cellene enten direkte gjennom deres reseptorer (f.eks griner, syndecans, etc.) eller ved å modulere vekstfaktor signale 3. ECM gir dermed biofysiske og biokjemiske signaler som er viktige regulatorer av cellulære prosesser som spredning, overlevelse, polarisering, differensiering, migrasjon, etc.
ECM spiller sentrale roller i fysiologi, utvikling og aldring fire. Dessuten er flere sykdommer, for eksempel hjerte-karsykdommer, fibrose, muskel- og skjelettsykdommer, kreft, forårsaket av, eller føre til, ECM endringer. Videre bidrar ECM til opprettholdelse av stamcelle nisjer og identifisere viktige ECM-molekyler thpå støtte stemness vil ha direkte anvendelse i tissue engineering og regenerativ medisin 5. Men til tross for sin betydning, har ECM forble, inntil nylig, underexplored 6.
In silico-analyse har vist at matrisome, definert som ensemble av ECM og ECM-assosierte proteiner, omfatter produkter av flere hundre gener i både humane og muse genomer 1,7,8. Imidlertid har uoppløseligheten av ECM-proteiner hindret systematisk karakterisering av sammensetningen av in vivo ekstracellulære matriser av normale og patologiske prøver. Vi har nylig vist at dette insolubility kunne vendes til fordel og brukes til å berike ECM proteiner 8-10. Vi og andre ytterligere demonstrert at massespektrometri var en metode for valg å karakterisere sammensetningen av ECM'er 8 - 10, 13.
Vibeskriver her et decellularization prosedyre som består av sekvensielle inkubasjonene i buffere av ulik pH og salt og vaskemiddel konsentrasjoner. Denne prosedyren resulterer i utvinning (eller uttømming) av cytosoliske, kjernefysiske, membran og cytoskeletal proteiner og anriking av ECM proteiner. Vi beskriver deretter hvordan å fordøye ECM-beriket proteinpreparater inn peptider for senere analyse av massespektrometri.
Ved hjelp av prosedyrene detaljert og illustrert her, har vi lykkes beriket og preget av massespektrometri de ekstracellulære matriser fra ti forskjellige vev og krefttyper: normal murine lunge 8, menneskelige og murine tykktarm 8,9, human lever 9, menneskelige kolorektal tumorer og avledet levermetastaser 9, melanom xenografts 8 melke tumorxenografter 10, murine bukspyttkjertelen holmer og murine insulinomer (Naba et al., upubliserte). Sammenligning av de forskjellige matrisomes avslørt vevs- og tumorspesifikke ECM signaturer som kan videre brukes som potensielle diagnostiske eller prognostiske biomarkører.
Vi tror at denne fremgangsmåten kan anvendes for andre prøver med ingen eller forholdsvis mindre modifikasjoner.
Protocol
MERK: Prosedyren kan utføres på friske eller flash frosset vev. Vi anbefaler perfusert sterkt vaskularisert vev med PBS ved disseksjon å fjerne røde blodceller og plasmaproteiner. Vi anbefaler ikke å gjennomføre inngrepet på faste vev som fiksering (dvs. kjemisk kryssbinding) forstyrrer decellularization og kan også betydelig kompromiss påfølgende massespektrometri analyse. For hele prosedyren, anbefaler vi bruk av lav-oppbevaring rør og pipetter for å maksimere protein og peptid utvinning.
1. Decellularization av vev eller svulster
MERK: Før du starter, forberede de reagenser og legge proteasehemmere (som følger med Kammer Protein Extraction kit) til ønsket volum på hver buffer. Alle buffere og prøvene bør holdes på is i løpet av forsøket, bortsett fra bufferen, CS som må holdes ved RT for å forhindre SDS Mengde-utfelling.
MERK: protokollen bruker en serie av inkubasjon i buffere med forskjellig pH-verdi og som inneholder forskjellig mengde av salter og vaskemidler for å sekvensielt ekstrakt intracellulære proteiner og berike for uoppløselige ECM-proteiner (figur 1, tabell 1; se også diskusjon på alternativer til bruken av kommersielt sett beskrevet her). Volumene av reagensene er gitt nedenfor, er for 100 mg vev eller tumor (se tabell 1) og må justeres tilsvarende.
- Homogen 100 mg vev i 500 ul buffer C inneholdende protease inhibitorer ved anvendelse av en vevshomogenisator inntil vevet er fullstendig avbrutt, og en homogen suspensjon oppnås.
MERK: Legg deoxyribonuclease jeg (endelig konsentrasjon: 200 mikrogram / ml, tilberedt i henhold til produsentens anvisninger) og ribonuklease A (endelig konsentrasjon: 20 mikrogram / ml, tilberedt i henhold til produsentens instruksjoner) tilBuffer N. - Sekvensiell ekstraksjon av intracellulære løselige proteiner
- Utvinning av cytosoliske proteiner. Inkuber homogenatet på et rør rotator i 20 minutter ved 4 ° C. Lagre en liten alikvot (10 ul til 20 ul) av homogenatet for påfølgende Western blot-analyse (se avsnitt Forventede resultater og figur 2).
- Sentrifuger homogenatet ved 16.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Utlevering av væsken i et rent rør, vil dette være den cytosoliske (C) brøkdel av Western blot-analyse. Flash fryse denne fraksjonen og oppbevares ved -80 ° C.
- Å vaske, resuspender pelleten i 400 ul buffer inneholdende W proteaseinhibitorer og inkuber prøven på et rør rotator i 20 minutter ved 4 ° C. Sentrifuger homogenatet ved 16.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Kast supernatanten.
- Å trekke ut, kjerneproteiner, resuspender pelleten i 150 mL buffer N inneholder proteasehemmere, deoxyribonucleaSE I og ribonuklease A og inkuber prøven på et rør rotator i 30 minutter ved 4 ° C.
- Sentrifuger prøven ved 16.000 xg i 30 min ved 4 ° C og samle supernatanten i et rent rør. Gjenta denne fremgangsmåten en gang: Etter sentrifugering av prøven for andre gang, legger supernatanten til den forrige supernatanten: dette vil utgjøre det nukleære (N) brøkdel av Western blot-analyse. Flash fryse denne fraksjonen og oppbevares ved -80 ° C. Utfør deretter vasker som per trinn 1.2.3.
- For å trekke ut membranproteiner, resuspender pelleten i 100 pl buffer inneholdende M-proteasehemmere og inkuber prøven på et rør rotator i 30 minutter ved 4 ° C. Sentrifuger prøven ved 16.000 xg i 30 min ved 4 ° C
- Utlevering av væsken i et rent rør, da vil utgjøre membranen (M) brøkdel av Western blot-analyse. Flash fryse denne fraksjonen og oppbevares ved -80 ° C.
- Å trekke ut cytoskeletal proteiner, resuspender pelleten i to00 ul buffer inneholdende CS-proteasehemmere og inkuber prøven på et rør rotator i 30 minutter ved RT.
Legg merke til at det ikke vil fullt ut pellet oppløses. Vi foreslår å forstyrre pelleten ved å pipettere opp og ned til å observere forstyrrelse av pellet. - Sentrifuger prøven ved 16.000 xg i 30 min ved RT. Utlevering av væsken i et rent rør. Legg merke på dette tidspunkt en ytterligere markert reduksjon i størrelsen av pelleten (se video).
- Resuspender pelleten i 150 ul buffer C inneholdende proteaseinhibitorer og inkuber prøven på et rør rotator i 20 minutter ved 4 ° C. Sentrifuger prøven ved 16.000 xg i 20 min ved 4 ° C.
- Samle supernatanten og legge den til i forrige supernatanten: dette vil utgjøre cytoskeletal (CS) brøkdel av western blot analyse. Flash fryse denne fraksjonen og oppbevares ved -80 ° C.
- Utføre flere vasker. Resuspender pelleten i 500 ul PBS som inneholdt protease-inhibitorer and inkubere prøven på et rør rotator i 5 min ved 4 ° C. Sentrifuger prøven ved 16.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten. Gjenta dette trinnet tre ganger.
MERK: Alle spor av vaskemidler må fjernes av omfattende vasker før fordøyelsen av proteinene til peptider (se avsnitt 3). På dette punktet, kan ECM-anrikede pellet være flash-frosset og holdt ved -80 ° C. Legg merke til at størrelsen av pelleten vil avhenge av mengden av uoppløselige (ECM) proteiner i utgangsmaterialet, og effektiviteten av decellularization.
2. overvåke kvaliteten av Decellularization / ECM berikelse av SDS-PAGE og Western Blot
- Bland 10-20 mL delmengde av total vevsekstrakt og 50 ul porsjoner av mellom fraksjoner med Laemmli Buffer inneholder 100 mM DTT. Suspendere ECM-beriket, uløselig fraksjon i 3x Laemmli Buffer som inneholder 100 mM DTT.
Merk: han forhøyede konsentrasjonerDTT og SDS hjelpe til oppløsning av ECM-proteiner som er relativt uløselig. - Separer proteiner ved SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembraner.
- Utføre immun-blots ved anvendelse av antistoffer for å overvåke proteiner representant for hver av de cytosoliske, Nuclear, membran, cytoskeletal og ECM fraksjoner (se avsnitt, tabell 2 og figur 2 Representative resultater).
3. In-oppløsning fordøyelsen av proteiner til peptider massespektrometrianalyse
MERK: oppnådd etter decellularization fremgangsmåte og fjerning av SDS-pelleten er meget anriket i uløselig ECM-proteiner for videre analyse ved massespektrometri disse proteiner trenger å bli fordøyd i peptider. Legg merke til at, som en konsekvens av ECM protein uløselighet, er det ikke mulig på dette trinn å måle proteinkonsentrasjonen i prøven. Vi gir dermed volumer av reagenser for å fordøye ECM-Enrikrapet prøvene til peptider basert på størrelse (mm) eller tørrvekten av ECM-anrikede pellet (tabell 3). De oppløsninger av ammoniumbikarbonat, urea, DTT, jodacetamid og trifluoreddiksyre alle må være nyfremstilt.
- Resuspender ECM-anrikede prøven ved å tilsette den passende mengde av 8 M urea til ECM-anrikede pellet og tilsett DTT ved en sluttkonsentrasjon på 10 mM (se tabell 3). Inkuber med kontinuerlig omrøring ved 1400 rpm i 2 timer ved 37 ° C.
MERK: på dette punkt ECM-proteiner ikke vil bli fullstendig oppløst og synlig store proteinpartikler ikke skal kastes ved sentrifugering eller filtrering. Suspensjonen vil klare på deglykosylering og fordøyelse (se video). - Alkylering
- Forbered iodoacetamide løsning i HPLC-grade vann. Avkjøl prøven til romtemperatur og tilsett jodacetamid til en sluttkonsentrasjon på 25 mM. For komplett alkylering, DTT: bør iodoacetamide forholdet være mellom 1: 2.5 og 1: 3.
- Inkuber i mørke i 30 minutter ved romtemperatur.
- Deglykosylering:
Merk: deglykosylering er nødvendig for å fjerne karbohydratsidekjeder som forstyrrer identifisering av peptider modifisert av N -bundne glykosylering.- Fortynne til 2 M urea med 100 mM ammoniumbikarbonat pH 8,0 og legge til riktig mengde PNGaseF (se tabell 3). Inkuber med kontinuerlig omrøring ved 1400 rpm i 2 timer ved 37 ° C.
- Fordøyelse
- Legg Lys-C og inkuber med kontinuerlig omrøring ved 1400 rpm i 2 timer ved 37 ° C. Tilsett trypsin og inkuberes under kontinuerlig omrøring ved 1400 opm O / N ved 37 ° C.
MERK: ECM-rik suspensjon som begynte overskyet ved første tilberedning i 8M urea synes klart etter at O / N fordøyelse (se video). - Legg til en andre aliquot av trypsin til prøven og inkuber med kontinuerlig omrøring ved 1400 opm i ytterligere 2 timer ved 37 ° C. </ Li>
- Legg Lys-C og inkuber med kontinuerlig omrøring ved 1400 rpm i 2 timer ved 37 ° C. Tilsett trypsin og inkuberes under kontinuerlig omrøring ved 1400 opm O / N ved 37 ° C.
- Forsuring
- Ved fullføring av fordøyelsen, inaktivere trypsin ved surgjøring av prøven med nylaget 50% trifluor-eddiksyre (TFA). Prøven skal nå pH <2. Vi foreslår tilsetning av 1-1,5 ul av 50% TFA i en tid og ved hjelp av en ul av peptid løsning for å måle pH i oppløsningen ved hjelp av pH-papir (se video).
- Sentrifuger den surgjorte prøve ved 16.000 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Samle supernatanten i en ren lav retensjon tube. Ved dette punkt kan peptidet oppløsningen oppbevares ved -20 ° C.
- Avsalting
Merk: at dette siste trinnet blir vanligvis utført ved en massespektrometri anlegg i henhold til sine egne foretrukne metoder.- Før proteomikk analyse, avsalte prøvene og peptider eluert med nylaget 60% acetonitril, 0,1% trifluoreddiksyre, etterfulgt av konsentrering i vakuum konsentratoren. Suspender peptider i nylaget 3% acetonitrIle, 0,1% trifluoreddiksyre 8.
Merk at etter avsalting, kan konsentrasjonen av peptidet oppløsningen måles ved spektrofotometri (se forventede resultater avsnitt). - Nå analysere prøven ved hjelp av massespektrometri, igjen i henhold til de optimale fremgangsmåter for massespektrometri anlegg.
MERK: Vi oppfordrer forskere som er interessert i å karakterisere sammensetningen av ECM'er bruker massespektrometri for å referere til våre andre publikasjoner 8-10 og nettsted som gir ytterligere detaljert forklaring, blant annet LC-MS / MS parametere, massespektrometri datasøk for protein identifisering og analyse av data bruker i silico matrisome annotering verktøyet vi utviklet åtte.
- Før proteomikk analyse, avsalte prøvene og peptider eluert med nylaget 60% acetonitril, 0,1% trifluoreddiksyre, etterfulgt av konsentrering i vakuum konsentratoren. Suspender peptider i nylaget 3% acetonitrIle, 0,1% trifluoreddiksyre 8.
Representative Results
Kvalitetskontroll av decellularization prosedyre
Effektiviteten til decellularization kan overvåkes ved å analysere proteininnholdet i hver fraksjon ved Western blot. Tabell 2 lister proteiner av diagnostisk verdi for å bedømme kvaliteten på decellularization fremgangsmåte. Figur 2A viser den effektive ekstraksjon i de mellomliggende fraksjoner av cytosoliske (GAPDH ), kjerne (histoner), membranen (β1 integrin) og cytoskeletal (actin) proteiner, mens ingen ECM-proteiner (kollagen) detekteres i disse fraksjoner (figur 2). I sin tur, blir den endelige pellet anriket for ECM-proteiner og stort sett tømt for intracellulære proteiner (figur 2A). Figur 2B viser tilfredsstillende intracellulært protein uttømming (ingen histon påvises i ECM-rik fraksjon), selv om, actin fortsatt kan påvises i ECM-rik fraksjon og uttømming av monomerisk kollagen I- Tilsynelatende molekylvekt ~ 110 kDa, presumptivt tilsvarer umontert kollagen I - kan observeres i CS fraksjon.
Vi har også rutinemessig ytterligere ECM-proteiner så som fibronektin og laminin, selv om det i noen vev, kan disse komponentene være delvis oppløst i tidligere fraksjoner 8-10. For eksempel, fibronektin oppstår også som oppløselig plasma fibronektin som ikke er innlemmet i ECM. Perfusjon av vevet før ekstraksjon reduserer plasma fibronektinet konsentrasjon, men ikke alltid eliminere den. I noen vev, laminins finnes løst forbundet med celleoverflaten eller ECM og ekstrakt i mellomliggende fraksjoner. Hvis dette skjer kan løses ved å endre uttrekkingsforhold (se diskusjon).
Merk at anrikning av ECM-proteiner og samtidig uttømming av intracellulære komponenter er basert på den relative løseligheten av proteiner i forskjellige buffere. Ther forskjellig mellom forskjellige vev - i noen tilfeller histoner og aktin er lettere ekstraheres enn i andre. Legg også merke til at selv om histoner er forventet å bli ekstrahert på N fraksjon (figur 2B), vi ofte observere en mer fullstendig tømming av histoner i M eller CS fraksjon (figur 2A og B).
Omtrentlig peptidkonsentrasjonen forventet
Konsentrasjonen av peptid-oppløsningen oppnådd etter fordøyelse, surgjøring og avsalting kan måles ved spektrofotometri, enten ved å måle absorbansen av peptidet løsningen ved hjelp av 280 nm bølgelengde som svarer til tryptofan, tyrosin, eller ved bruk av 205 nm bølgelengde som svarer til absorbans av peptidet obligasjoner.
Vi målte konsentrasjonen av peptidet oppløsninger oppnådd fra decellularization av tre murine lungene prøver (82 mg, 100 mg og 100 mg, respektivt) behandling anleggrød parallelt og oppnådd fra hver: 424 ng / mL, 450 ng / mL, og 580 ng / mL av peptider henholdsvis.
Identifisering av ECM peptider ved hjelp av massespektrometri
Massespektrometrisk analyse av sammensetningen av ECM-anrikede proteinprøver, fremstilt som beskrevet her, viste at> 70% av signalintensitet svarer til ECM og ECM-assosierte proteiner 8-10.
Tabell 1. Volum av reagenser fra compartment Utvinning kit til decellularize 100 mg (våtvekt) av vev eller svulst. Denne tabellen viser sammensetningen og volumet av hver buffer som brukes til å gjennomføre decellularization av 100 mg vev eller tumor. En cocktail av proteaseinhibitorer er gitt som en 50x løsning og må legges til hver buffer 2.
| Reagenser fra Kammer Protein Extraction Kit | Volumet for 100 mg vev | Sammensetning (basert på Millipore dataark katt # 2145 1) |
| Buffer C | 500 mL | HEPES (pH 7,9 3), MgCl2, KCl, EDT 4, sukrose, glyserol, natriumortovanadat 5 |
| Buffer W | 400 mL | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sukrose, glyserol, natriumortovanadat |
| Buffer N | 150 ul x 2 | HEPES (pH 7,9), MgCl2, NaCl, EDTA, glyserol, natriumortovanadat |
| Buffer W | 400 mL | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sukrose, glyserol, natriumortovanadat |
| Buffer M | 100 ul | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sukrose, glyserol, natriumdeoksykolat (DOC) 6, NP-40 6 |
| Buffer CS | 200 ul | PIPES (pH 6,8), MgCl2, NaCl, EDTA, sukrose, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 7, natriumortovanadat |
| Buffer C | 150 ul | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sukrose, glyserol, natriumortovanadat |
| 1 x PBS | 500 mL / vask | - |
Merknader:
1 For proprietære grunner, men vi klarte ikke å få den nøyaktige sammensetningen av buffere fra leverandøren av settet, men vi har her noen notater basert på vår egen erfaring med hjemmelagde buffere til å utføre tilsvarende uttrekk.
2 Proteasehemmer: er det tilrådelig å inkludere et utvalg av inhibitorer mot cystein, serin og treonin peptidaser, serin esteraser, toverdige kationer, avhengig av metalloproteinaser etc.Mange kommersielt tilgjengelige proteasehemmer cocktails eksisterer.
3 pH over 7,0 er en effektiv inhibitor av lysosomale proteaser.
4 EDTA (vanligvis brukt ved 2 mM) er en effektiv inhibitor av toverdige kationer avhengige proteaser.
5 natriumortovanadat er en fosfatase inhibitor. En typisk effektiv konsentrasjon vil være 0,5-5 mM.
6 NP40 på 0,1% -0,5% er tilstrekkelig til å oppløse de fleste membranlipider. Kombinasjonen av NP40 og DOC - ofte brukt ved like konsentrasjoner (for eksempel 0,5% av hver) - er ofte brukt som et strengere ekstraksjon som likevel etterlater mange protein-protein interaksjoner intakte.
7 SDS er en strengere ionisk vaskemiddel (CMC 0,1%). Den kan også brukes i kombinasjon med de to andre vaskemidler SDS / NP40 / doc 0,1 / 0,5 / 0,5% som et mellomprodukt stringens buffer.
Tabell 2. Diagnostiske proteiner tilovervåke kvaliteten av decellularization prosedyre. Denne tabell viser eksempler på proteiner som er egenskapene til hver subcellulære rom (cytosol, nucleus, plasmamembranen, cytoskjelettet og ECM) som kan brukes til å overvåke kvaliteten på decellularization måten og effektiviteten av ECM-berikelse.
| Intracellulære rommet | Diagnostiske Proteiner |
| Cytosoliske proteiner | Glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) |
| Kjerneproteiner | Histoner, Lamins, Nucleoporin |
| Membran proteiner | Inte, Transferrin Receptor |
| Cytoskeletal proteiner | Actin, Tubulin, vimentin |
| Basalmembran ECM proteiner | Kollagen IV, Nidogens, Laminins |
| Interstitiell ECM proteiner (interstitiell) | Collagen jeg Collagen III, Collagen VI, Fibronectin |
For anbefaling på antistoffer, se våre publikasjoner 8-10.
Tabell 3. Volum av reagenser å fordøye ECM-beriket prøvene til peptider. Denne tabellen viser reagenser som brukes til å suspendere ECM-beriket proteinprøver og redusere, alkylat, deglycosylate og fordøye proteiner prøvene inn peptider før massespektrometri analyse.
| Reagenser | Forberedelse | Sluttkonsentrasjon / Mengde i 1 mm tykk pellet (~ 5-10 mg tørrvekt) | Volum for 1 mm tykt pellet (~ 5-10 mg tørrvekt) |
| Ammoniumbicarbonat (NH 4 HCO 3) | 100 mM oppløsning i HPLC-kvalitet vann | - | - |
| Urea | 8 M løsning i 100 mM ammoniumbikarbonat | 8 M | 50 pl |
| Dithiothreitol | Rekonstituere i HPLC-grade vann ved 500 mm | 10 mm | 1 mL |
| Iodoacetamide | Rekonstituere i HPLC-grade vann ved 500 mm | 25 mm | 2,5 mL |
| Peptid- N -Glycosidase F (PNGaseF) | Kommersiell løsning på 500 U / mL | 1000 U | 2 pl |
| Endoproteinase Lyse, massespektrometri-grade | Rekonstituere i HPLC-grade vann på 0,5 ug / ul | 1 mikrogram | 2 pl |
| Trypsin, massespektrometri-klasse (runde 1) | Kommersiell løsning ved 0,5 ug / ul | 3 ug | 6 pl |
| Trypsin, massespektrometri-grade (runde 2) | Kommersiell løsning ved 0,5 ug / ul | 1,5 mikrogram | 3 pl |
| Trifluor-eddiksyre (TFA) | 50% oppløsning i HPLC-kvalitet vann | - | 2-5 pl |
| Acetonitril (eluering) | 60% løsning med 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vann | - | 500 mL |
| Acetonitril (oppløsning) | 3% løsning med 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vann | - | 100 ul |
Figur 1. Scheme av den eksperimentelle prosedyren. Skjematisk arbeidsflyten av protokollen,l å decellularize vev (§ 1), kontrollere kvaliteten på decellularization og evaluere ECM berikelse (§ 2) og fordøye ECM-beriket proteinprøver i peptider før massespektrometri analyse (§ 3).
Figur 2. kvalitetskontroll av decellularization prosedyren ved western blot Western blot ble utført på murine lunge (A) og human mammary carcinoma xenotransplantat (B) prøver ved hjelp av de følgende antistoffer:. Kanin-anti-actin (klon 14-1) og kanin-anti -β1 inte antistoffer produsert i vårt laboratorium; kanin anti-kollagen I, mus anti-GAPDH og kanin anti-pan-histoner antistoffer var fra Millipore. Etter primært antistoff inkubasjon ble membranene vasket og inkubert i nærvær av HRP-konjugert geite-anti-kanin eller geit anti-mouse sekundært antistoff fra Jackson Immunoresearch Laboratory. Til slutt ble membranene vasket og inkuberes i Vest Lightning ™ Chemiluminescence Reagens (PerkinElmer LAS). * Viser minimal rest histon kontaminasjon av ECM-rik fraksjon. ** Indikerer delvis nedbryting av monomere (presumptivt umontert) kollagen jeg i CS fraksjonen. *** Indikerer rest aktin kontaminasjon av ECM-rik fraksjon. Den påvist med anti-kollagen antistoff smøre representerer forskjellige nivåer av post-translasjonelle modifiseringer (for eksempel tverrbinding, glykosyleringsseter).
Discussion
Modifikasjoner
Selv om vi ansatt denne nøyaktige fremgangsmåten for å berike ECM fra ti vev og krefttyper 8 - 10, bør vurderes endringer i protokollen i følgende tilfeller:
1) Påvisning av ECM-proteiner i de mellomliggende fraksjoner.
Ekstracellulære matriser fra forskjellige vev eller tumortyper kan variere i deres extractability / uløselighet, som diskutert ovenfor for fibronectin og laminins. For eksempel, er det tenkt at ECM av fibrotiske vev eller ombygging vev svinger over svært dynamisk og dermed kan man observere en høyere andel av ECM proteiner i disse vev for å være lettere utvinnbar 12. Avhengig av den fraksjon som ECM-proteiner påvises, foreslår vi å redusere inkubasjonstiden av trinnet forårsaker utvinning av ECM-proteiner eller utelate dette trinnet.
2) Detection av en betydelig andel av intracellulære komponenter i ECM-anrikede pellet. I enkelte vev eller tumortyper, de forholds celler: ECM er særlig høy (for eksempel lever, milt, ikke-desmoplastic tumorer). I dette tilfelle kan en betydelig forurensning av ECM-anriket fraksjon av intracellulære proteiner (spesielt cytoskeletal proteiner og / eller histoner) observeres. Å utarme intracellulære proteiner effektivt, foreslår vi gjentatte ganger inkubasjonstiden i buffer M og / eller buffer CS (begge inneholder vaskemidler, dette tapper vanligvis rikelig intracellulære proteiner). Et annet alternativ vil være å bruke alternative buffere med høyere konsentrasjoner vaskemiddel, med det forbeholdet at dette kan føre til utarming av relativt mer løselig ECM proteiner i tillegg (se neste avsnitt).
3) alternativ til å bruke et kommersielt kit.
Vi var i stand til, for farmasøytiske grunner, for å oppnå den nøyaktige sammensetningen av bufferne from leverandøren av compartment Protein Extraction kit. Men vi har tatt med i tabell 1 notater basert på vår egen erfaring med hjemmelaget buffere med definert vaskemiddel (NP-40, natriumdeoksycholat og SDS) konsentrasjoner å gjennomføre tilsvarende utdrag. En fersk studie har også understreket betydningen av pH decellularization buffere for å beholde ECM proteiner 13.
Begrensninger av teknikken
Metoden som presenteres her bygger på det faktum at ECM-proteiner er egentlig mer uoppløselige enn de fleste intracellulære proteiner. Men den decellularization metoden beskrevet her sikkert trekker løselige komponenter til stede i ECM som noen vekstfaktorer eller ECM-ombygging enzymer. Selv om ECM-assosierte proteiner tett bundet til ECM proteiner ble oppdaget av proteomikk i prøver fremstilt som beskrevet, kan denne metoden være for strengt å fullt profilere sammensetningen av matrisome-forbundetproteiner.
Betydningen av teknikken med hensyn til andre fremgangsmåter
Fordelen med fremgangsmåten som presenteres her i forhold til andre metoder, er at det kan tilpasses til arten av ECM av interesse: mellomliggende trinn kan utelates eller gjentatt for å hindre tap av ECM-proteiner eller øke uttømming av forurensende intracellulære proteiner respektivt. Denne metoden har også bare benytter minimale mengder av vaskemidler som skylles av for å hindre deres interferens med påfølgende peptidpreparat og massespektrometri. Endelig har metoden beskrevet her for å fordøye ECM-rike proteinpreparater i peptider også den fordel at det ikke krever proteiner å være løselige og kan bli gjennomført på "rå" ECM-anrikede fraksjoner.
Alternative fremgangsmåter som benytter decellularization kaotroper (slik som guanidinhydroklorid) å undersøke sammensetningen av ECM'er ved massespektrometri har been rapportert i litteraturen (oversikt i 14), og er blitt brukt i kombinasjon med massespektrometri for å karakterisere ECM sammensetningen av brusk 15,16, 17 hjerte, brystkjertel 18 og vaskulær 19 og 20 glomerulær basalmembraner.
Anbefalinger
Decellularization fremgangsmåter som anvender trypsin å fordøye ut cellene bør ikke brukes dersom ECM'er er anriket for påfølgende proteomforskning analyser, som trypsinering vil resultere i delvis ECM fordøyelse og tap av ECM-proteiner og peptider. Tilsvarende, hvis kollagenase fordøyelse skulle brukes til å hjelpe vev avbrudd, ville det må overvåkes nøye, da det fører til ECM fordøyelse og tap av ECM-proteiner og peptider.
In-løsning vs. in-gel fordøyelsen? ECM-proteiner er fornettet og meget uoppløselig, og selv når resuspendert i 3 x Laemmli-buffer (inneholdende 6% SDS) og 100 mM DTT, separat poorly på SDS geler. Således in-gel fordøyelse er ikke en foretrukket metode.
Fremtidige søknader
Det er verdt å merke seg at selv ikke diskutert her, sammensetningen av hver av de mellomliggende fraksjoner oppsamlet under decellularization kan også analyseres ved massespektrometri. Dette kan være spesielt verdifullt når man studerer meget små prøver (dvs. humane biopsier) eller når informasjonen er ønsket på andre cellulære fraksjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | |
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 |
References
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308 (2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
