Abstract
מטריקס (ECM) הוא meshwork מורכב של חלבונים צולבים המספק רמזי biophysical וביוכימיים שרגולטורים עיקריים של התפשטות תאים, הישרדות, הגירה, וכו 'ECM משחק תפקידים חשובים בפיתוח ובפתולוגיות שונות, כולל לב וכלי דם ומחלות שרירים ושלד, סיסטיק, וסרטן. לפיכך, המאפיין את ההרכב של ECMS של רקמות בריאות וחולות יכול להוביל לזיהוי של סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ואבחון חדשניים ומטרות טיפוליות חדשניות פוטנציאל. עם זאת, הטבע מאוד של חלבוני ECM (גדולים בגודל, צולבים וקוולנטית כפותים, glycosylated בכבדות) הפך את הניתוחים ביוכימיים של ECMS המאתגר. כדי להתגבר על האתגר הזה, פיתחנו שיטה להעשרת ECMS מרקמות טריות או קפוא וגידולים שמנצל את insolubility של חלבוני ECM. אנו מתארים כאן בפירוט את הליך decellularization שמורכבת מאני עוקבncubations במאגרים של pH שונה וריכוזי מלח ואבקת כביסה וכי תוצאות 1) הפקת תאית (cytosolic, גרעיני, הקרום וcytoskeletal) חלבונים ו -2) ההעשרה של חלבוני ECM. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד deglycosylate ולעכל הכנות חלבון מועשר ECM לפפטידים לניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.
Introduction
מטריקס (ECM) הוא meshwork מורכב של חלבונים צולבים ומסוכרים שמספקים תמיכה אדריכלית ומעגן לתאים ומגדיר, בחלקו, ביו-המכאניים המאפיינים 'רקמות 1,2. חלבוני ECM גם לאותת לתאים באופן ישיר באמצעות קולטנים (למשל, integrins, syndecans, וכו ') שלהם או על ידי ויסות גורם גדילת איתות 3. ECM כך מספק רמזי biophysical וביוכימיים שרגולטורים עיקריים של תהליכים תאיים כגון התפשטות, הישרדות, קיטוב, בידול, הגירה, וכו '
ECM משחק תפקידי מפתח בפיזיולוגיה, התפתחות והזדקנות 4. יתר על כן, כמה פתולוגיות, כגון מחלות לב וכלי דם, סיסטיק, מחלות שרירים ושלד, סרטן, נגרמות על ידי, או לגרום ל, שינויי ECM. יתר על כן, ECM תורם לשמירה על נישות בתאי גזע וזיהוי מולקולות ECM מפתח הבstemness התמיכה יהיה יישום ישיר בהנדסת רקמות ורפואת רגנרטיבית 5. עם זאת, למרות חשיבותה, ECM נשאר, עד לאחרונה, underexplored 6.
בסיליקון והניתוח גילה כי matrisome, שהוגדר כהרכב של ECM וחלבונים הקשורים ECM, כולל את המוצרים של כמה מאה גנים בגנום האנושי והן עכבר 1,7,8. עם זאת, insolubility של חלבוני ECM הפריע האפיון השיטתי של הרכב in vivo מטריצות תאית של דגימות נורמליות ופתולוגיים. לאחרונה הוכיחו כי insolubility זה יכול להיות הפך ליתרון ולהשתמש בם כדי להעשיר את חלבוני ECM 8 - 10. אנחנו ואחרים נוספים הוכיחו כי ספקטרומטר מסה הייתה שיטה של בחירה לאפיין את ההרכב של ECMS 8 - 10, 13.
אנחנומתאר כאן הליך decellularization שמורכב מincubations רציף במאגרים של pH שונה וריכוזי מלח וחומרי ניקוי. תוצאות הליך זה בחילוץ (או דלדול) של חלבוני cytosolic, גרעיניים, קרום וcytoskeletal וההעשרה של חלבוני ECM. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד לעכל הכנות חלבון מועשר ECM לפפטידים לניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.
שימוש בנהלים מפורטים ומאויר כאן, יש לנו מועשר בהצלחה ומאופיינת בספקטרומטר מסת המטריצות תאית מעשר רקמות שונות וסוגי גידולים: ריאות נורמליות עכברית 8, אנושי ומעי גס בעכברי 8,9, כבד אנושי 9, גידולי מעי גס אנושיים ונגזרים גרורות בכבד 9, xenografts מלנומה 8, xenografts החלב גידול 10, איי לבלב בעכברים וinsulinomas עכברי (נאבא et al., לא פורסם). השוואה של matrisom השוניםes חשף חתימות ECM דקיקות ובגידול ספציפי שעוד יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים לאבחון או לפרוגנוסטיים פוטנציאליים.
אנו מאמינים כי הליך זה יכול להיות מיושם על דגימות אחרות ללא או קטנים יחסית שינויים.
Protocol
הערה: ההליך יכול להתנהל על רקמות קפואים או הבזק. אנו ממליצים מרוססים רקמות כלי דם מאוד עם PBS בעת הנתיחה כדי לחסל תאי דם אדומים וחלבוני פלזמה. אנחנו לא ממליצים לנהל את ההליך ברקמות קבועות כקיבעון (כלומר, crosslinking הכימי) מפריע לdecellularization וגם יכול להתפשר ניתוח ספקטרומטר מסה שלאחר מכן באופן משמעותי. להליך כולו, אנו ממליצים על השימוש בצינורות נמוך שימור וטיפים פיפטה כדי למקסם את התאוששות חלבון ופפטיד.
1. Decellularization של רקמות או גידולים
הערה: לפני שמתחיל, להכין את חומרים כימיים ולהוסיף מעכבי פרוטאז (מסופקים עם ערכת חילוץ חלבון תא) להיקף הרצוי של כל מאגר. כל מאגרי דגימות צריכים להיות כל הזמן על קרח למשך הניסוי מלבד CS הצפת שצריך להיות כל הזמן על RT כדי למנוע precip SDSitation.
הערה: הפרוטוקול משתמשת בסדרה של דגירה במאגרים של pH שונה ומכיל כמות המלחים וחומרי הניקוי ברצף חלבונים תאיים תמצית ולהעשיר לחלבונים מסיסים ECM (איור 1, טבלת 1 שונה; ראה גם דיון לחלופות לשימוש ב ערכה מסחרית מפורט כאן). הכרכים של ריאגנטים בהתחשב להלן לרקמות או גידולים (ראה טבלה 1) 100 מ"ג וצריכים להיות מותאמים כראוי.
- Homogenize של רקמה 100 מ"ג ב 500 μl של הצפת C המכיל מעכבי פרוטאז באמצעות homogenizer רקמה עד הרקמה מופרת לחלוטין והשעיה הומוגנית מתקבלת.
deoxyribonuclease להוסיף אני (ריכוז סופי: 200 מיקרוגרם / מיליליטר, מחדש בהתאם להוראות היצרן) הערה וribonuclease (ריכוז סופי: מיליליטר 20 מיקרוגרם /, מחדש בהתאם להוראות היצרן) להמאגר נ - חילוץ רציף של חלבונים מסיסים תאיים
- הפקה של חלבוני cytosolic. דגירה homogenate על הכתף צינור במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס. שמור aliquot קטן (10 μl 20 μl) של homogenate לניתוח כתם מערבי לאחר מכן (ראה סעיף תוצאות צפויים ואיור 2).
- צנטריפוגה homogenate ב16,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant בצינור נקי, זה יהווה חלק cytosolic (ג) ניתוח הכתם המערבי. פלאש להקפיא חלק זה ולאחסן ב -80 ° C.
- לשטוף, resuspend גלולה ב400 μl של הצפת W מכיל מעכבי פרוטאז ודגירה מדגם על הכתף צינור במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה homogenate ב16,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
- כדי לחלץ, חלבונים גרעיניים, resuspend גלולה ב150 μl של הצפת N המכיל מעכבי פרוטאז, deoxyribonuclease אני וribonuclease דגירה המדגם על הכתף צינור למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant בצינור נקי. חזור על פעולה זו פעם אחת: לאחר צנטריפוגה המדגם בפעם השנייה, להוסיף את supernatant לsupernatant הקודם: זה יהווה החלק הגרעיני (N) של ניתוח הכתם המערבי. פלאש להקפיא חלק זה ולאחסן ב -80 ° C. לאחר מכן, לבצע שטיפות לפי צעד 1.2.3.
- כדי לחלץ חלבוני קרום, resuspend גלולה במאגר של M 100 μl מכיל מעכבי פרוטאז ודגירה מדגם על הכתף צינור למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס
- לאסוף את supernatant בצינור נקי: זה יהווה חלק הקרום (M) של ניתוח הכתם המערבי. פלאש להקפיא חלק זה ולאחסן ב -80 ° C.
- כדי לחלץ חלבוני cytoskeletal, resuspend גלולה ב 200 μl של הצפת CS מכיל מעכבי פרוטאז ודגירה מדגם על הכתף צינור למשך 30 דקות ב RT.
שים לב שהגלולה לא לפזר באופן מלא. אנו מציעים לשבש את הכדור על ידי pipetting למעלה ולמטה עד שהתבוננות שיבוש של גלולה. - צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 30 דקות ב RT. לאסוף את supernatant בצינור נקי. שים לב, בשלב זה ירידה מסומנת נוסף בגודל של גלולה (ראה וידאו).
- Resuspend גלולה ב150 μl של מעכבי פרוטאז המכיל מאגר C ו דגירה המדגם על הכתף צינור במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לאסוף את supernatant ולהוסיף אותו לsupernatant הקודם: זה יהווה חלק cytoskeletal (CS) של ניתוח הכתם המערבי. פלאש להקפיא חלק זה ולאחסן ב -80 ° C.
- לבצע שטיפות נוספות. Resuspend גלולה ב 500 μl של PBS המכיל מעכבי פרוטאזND דגירה המדגם על הכתף צינור במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה המדגם ב16,000 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
הערה: כל העקבות של חומרי ניקוי צריך להסיר על ידי שוטף נרחב לפני העיכול של החלבונים לפפטידים (ראה סעיף 3). בשלב זה, את גלולה מועשרת ECM יכולה להיות פלאש-קפוא והמשיכה ב -80 מעלות צלזיוס. שים לב שהגודל של גלולה יהיה תלוי בכמות של חלבונים מסיסים (ECM) בחומר ההתחלה ואת היעילות של decellularization.
2. ניטור איכות Decellularization / העשרת ECM על ידי SDS-PAGE ומערב כתם
- לערבב 10-20 aliquot μl בסך הכל תמצית רקמה ו -50 aliquots μl של שברים ביניים עם Laemmli מאגר המכיל 100 מ"מ DTT. Resuspend, החלק בלתי מסיס מועשר ECM ב3x Laemmli מאגר המכיל 100 מ"מ DTT.
הערה: הוא העלה ריכוזיםשל DTT וSDS לסייע בsolubilization של חלבוני ECM שיחסית לא מסיסים. - הפרד את החלבונים על ידי SDS-עמוד ומועבר על גבי קרומי nitrocellulose.
- לבצע חיסון כתמים באמצעות נוגדנים כדי לפקח על נציג חלבונים של כל אחד משברי cytosolic, גרעיניים, קרום, cytoskeletal וECM (ראה סעיף נציג תוצאות, לוח 2 ואיור 2).
3. עיכול ב- פתרון של חלבונים לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה
הערה: גלולה המתקבלת לאחר הליך decellularization וההסרה של SDS היא מועשרת בחלבוני ECM מסיסים לניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסת חלבונים אלה צריכים להיות מעוכלים לפפטידים. שים לב, כתוצאה מinsolubility חלבון ECM, לא ניתן בשלב זה כדי למדוד את ריכוז החלבון של המדגם. כך אנו מספקים כמויות של חומרים כימיים לעיכול ECM-enriדגימות CHED לפפטידים המבוססים על הגודל (מ"מ) או משקל יבש של גלולה מועשרת ECM (לוח 3). הפתרונות של אמוניום ביקרבונט, אוריאה, DTT, iodoacetamide וחומצת trifluoroacetic כל צריכים להיות מוכנים טרי.
- Resuspend המדגם מועשר ECM על ידי הוספת הנפח המתאים של 8 מ 'אוריאה לגלולה מועשרת ECM ולהוסיף DTT בריכוז סופי של 10mm (ראה טבלה 3). דגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל"ד 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
הערה: בשלב זה את חלבוני ECM לא יפורקו באופן מלא וחלקיקי חלבון גדולים בעליל לא צריכים להיות מושלכים על ידי צנטריפוגה או סינון. ההשעיה תנקה על deglycosylation ועיכול (ראה וידאו). - אלקילציה
- הכן את פתרון iodoacetamide במי HPLC כיתה. מגניב המדגם לRT ולהוסיף iodoacetamide לריכוז סופי של 25 מ"מ. לאלקילציה המלאה, DTT: יחס iodoacetamide צריך להיות בין 1: 2.5 ו 1: 3.
- דגירה בחושך במשך 30 דקות ב RT.
- Deglycosylation:
יש צורך deglycosylation להסיר שרשרות צד פחמימות שמפריעות לזיהוי של פפטידים שונה על ידי N -linked glycosylation: הערה.- לדלל 2 M אוריאה עם pH אמוניום ביקרבונט 100 מ"מ 8.0 ולהוסיף את הכמות המתאימה של PNGaseF (ראה טבלה 3). דגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל"ד 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- עיכול
- הוסף ליס-C ודגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל"ד 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס. הוסף את טריפסין ודגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל"ד O / N על 37 מעלות צלזיוס.
הערה: ההשעיה ECM-עשיר שהחלה מעונן עם הכינון מחדש ראשוני באוריאת 8M מופיעה ברורה לאחר O / N עיכול (ראה וידאו). - הוסף aliquot שני של טריפסין למדגם דגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל"ד 2 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס. </ Li>
- הוסף ליס-C ודגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל"ד 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס. הוסף את טריפסין ודגירה עם תסיסה מתמשכת ב1,400 סל"ד O / N על 37 מעלות צלזיוס.
- חִמוּץ
- עם השלמת העיכול, להשבית טריפסין על ידי acidifying המדגם עם חומצה מוכנה טרי 50% trifluoro-אצטית (TFA). המדגם צריך להגיע pH <2. אנו ממליצים להוסיף 1-1.5 μl של 50% TFA בזמן ושימוש 1 μl של פתרון פפטיד למדוד את ה- pH של התמיסה באמצעות נייר pH (ראה וידאו).
- צנטריפוגה מדגם acidified ב16,000 XG במשך 5 דקות על RT. לאסוף את supernatant בצינור נמוך שימור נקי. בשלב זה, פתרון פפטיד ניתן לאחסן ב -20 ° C.
- Desalting
הערה: שהצעד אחרון זה בדרך כלל נערך במתקן ספקטרוסקופיית מסות על פי השיטות המועדפות שלהם.- לפני ניתוח פרוטאומיקה, desalt הדגימות ופפטידים eluted עם אצטוניטריל מוכן טרי 60%, 0.1% חומצת trifluoroacetic, ואחריו ריכוז ברכז ואקום. Resuspend פפטידים בacetonitr 3% מוכנים טריאיל, 0.1% חומצת trifluoroacetic 8.
הערה: שלאחר desalting, הריכוז של פתרון פפטיד ניתן למדוד על ידי spectrophotometry (ראה סעיף תוצאות צפוי). - עכשיו לנתח את המדגם על ידי ספקטרומטריית מסה, שוב בהתאם לנהלים אופטימליים של מתקן ספקטרומטר המסה.
הערה: אנו מעודדים את החוקרים מעוניינים באפיון הרכב ECMS באמצעות ספקטרומטר מסה להתייחס לפרסומים האחרים שלנו 8-10 ואתר המספקים הסבר מפורט יותר, כוללים פרמטרים LC-MS / MS, חיפוש נתונים ספקטרומטר מסה לניתוח זיהוי חלבונים ונתונים באמצעות בסיליקון וmatrisome כלי ביאורנו פתח 8.
- לפני ניתוח פרוטאומיקה, desalt הדגימות ופפטידים eluted עם אצטוניטריל מוכן טרי 60%, 0.1% חומצת trifluoroacetic, ואחריו ריכוז ברכז ואקום. Resuspend פפטידים בacetonitr 3% מוכנים טריאיל, 0.1% חומצת trifluoroacetic 8.
Representative Results
בקרת איכות של הליך decellularization
היעילות של decellularization יכולה להיות במעקב על ידי ניתוח תוכן החלבון של כל חלק על ידי כתם מערבי. טבלה 2 חלבוני רשימות של ערך אבחון להעריך את איכותו של הליך decellularization. איור 2A מציג את המיצוי יעיל בשברי ביניים של cytosolic (GAPDH ), גרעיניים (ההיסטונים), קרום (integrin β1) וcytoskeletal (חלבונים אקטין), בעוד שלא חלבוני ECM (אני קולגן) מזוהה בשברים אלה (איור 2). בתורו, את הכדור האחרון הוא מועשר לחלבונים ECM והמדולדל במידה רבה של חלבונים תאיים (איור 2 א). איור 2 מציג דלדול חלבון תאיים משביע רצון (לא היסטון מזוהה בחלק ECM-עשיר), אם כי, אקטין עדיין יכול להיות מזוהים ב חלק ECM-עשיר ודלדול של קולגן אני monomeric- משקל מולקולרי לכאורה ~ 110 kDa, מוחזקים מתאים לקולגן unassembled אני - ניתן לצפות בחלק CS.
אנחנו גם לפקח באופן שגרתי חלבוני ECM נוספים כגון פיברונקטין וlaminin, אם כי, ברקמות מסוימות יכולים להיות solubilized רכיבים אלה באופן חלקי בשברים קודמים 8-10. לדוגמא, פיברונקטין מתרחש גם פיברונקטין פלזמה מסיס שכאינו משולב בECM. טפטוף של הרקמה לפני המיצוי מפחית ריכוז פיברונקטין פלזמה אבל לא תמיד לחסל אותו. בחלק מהרקמות, laminins נמצא קשור באופן רופף עם השטח פני התא או ECM ותמצית שבברי ביניים. במקרה זה ניתן לטפל זה על ידי שינוי תנאי חילוץ (ראה דיון).
שים לב שההעשרה של חלבוני ECM ודלדול נלווה של רכיבים תאיים מבוססת על מסיסותם היחסית של חלבונים במאגרים השונים. ההוא שונים בין רקמות שונות - ובמקרים מסוימים ההיסטונים ויקטינו בקלות רבה יותר מאשר בחילוץ אחר. כמו כן שימו לב שלמרות שההיסטונים צפויים להיות מופקים בחלק N (איור 2), לעתים קרובות אנו מתבוננים דלדול של ההיסטונים בM או חלק CS (איור 2 א 'וב') שלם יותר.
ריכוז הפפטיד אינדיקטיבי צפוי
הריכוז של פתרון פפטיד שהושג לאחר עיכול, החמצה וdesalting ניתן למדוד על ידי spectrophotometry או על ידי מדידת הספיגה של פתרון פפטיד באמצעות אורך הגל של 280 ננומטר המתאים לטריפטופן, טירוזין, או באמצעות אורך הגל 205 ננומטר המתאים לספיגה של פפטיד אגרות חוב.
מדדנו את הריכוז של פתרונות פפטיד התקבלו מdecellularization של שלוש דגימות עכברי ריאות (82 מ"ג, 100 מ"ג, 100 מ"ג ו, בהתאמה) prepaאדום במקביל ומתקבל מכל אחד: 424 ng / μl, 450 ng / μl, ו580 ng / μl של פפטידים בהתאמה.
זיהוי של פפטידים ECM על ידי ספקטרומטריית מסה
ניתוח ספקטרומטריה של ההרכב של דגימות חלבון מועשר ECM, הכינו כפי שתואר כאן, הראה כי> 70% מעוצמת האות מתאים לECM והחלבונים הקשורים ECM 8-10.
נפח הטבלה 1. של חומרים כימיים מערכה הממודרת הפקה לdecellularize 100 מ"ג (משקל רטוב) של רקמה או גידול. טבלה זו מפרטת את ההרכב ואת עוצמת הקול של כל מאגר המשמש לביצוע decellularization של רקמה או גידול של 100 מ"ג. קוקטייל של מעכבי פרוטאז מסופק כפתרון 50x וצריך להוסיף לכל חיץ 2.
| ריאגנטים מערכת חילוץ חלבון תא | נפח לרקמה 100 מ"ג | הרכב (המבוסס על # גליון הנתונים של חתול Millipore 2,145 1) |
| המאגר C | 500 μl | HEPES (pH 7.9 3), MgCl 2, KCl, 4 EDT, סוכרוז, גליצרול, נתרן Orthovanadate 5 |
| המאגר W | 400 μl | HEPES (pH 7.9), MgCl 2, KCl, EDTA, סוכרוז, גליצרול, נתרן Orthovanadate |
| המאגר N | 150 μl x 2 | HEPES (pH 7.9), MgCl 2, NaCl, EDTA, גליצרול, נתרן Orthovanadate |
| המאגר W | 400 μl | HEPES (pH 7.9), MgCl 2, KCl, EDTA, סוכרוז, גליצרול, נתרן Orthovanadate |
| המאגר M | 100 μl | HEPES (pH 7.9), MgCl 2, KCl, EDTA, סוכרוז, גליצרול, deoxycholate נתרן (DOC) 6, NP-40 6 |
| המאגר CS | 200 μl | צינורות (pH 6.8), MgCl 2, NaCl, EDTA, סוכרוז, נתרן Dodecyl סולפט (SDS) 7, נתרן Orthovanadate |
| המאגר C | 150 μl | HEPES (pH 7.9), MgCl 2, KCl, EDTA, סוכרוז, גליצרול, נתרן Orthovanadate |
| 1x PBS | 500 μl / לשטוף | - |
הערות:
1 מסיבות קניינית, שלא הצליחה להשיג את ההרכב המדויק של המאגרים מהספק של הערכה, אך אנו כוללים כאן כמה הערות על סמך הניסיון שלנו באמצעות מאגרי תוצרת בית לנהל עקירות דומות.
2 מעכב פרוטאז: רצוי כולל מגוון של מעכבים נגד ציסטאין, סרין ותראונין peptidases, esterases סרין, metalloproteinases קטיון תלוי דו ערכי וכו 'קוקטיילים מעכבי פרוטאז זמינים מסחרי רבים קיימים.
3 pH מעל 7.0 הוא מעכב יעיל של פרוטאזות lysosomal.
4 EDTA (משמש בדרך כלל ב2 מ"מ) הוא מעכב יעיל של פרוטאזות קטיון תלוי דו הערכית.
5 orthovanadate נתרן הוא מעכב phosphatase. ריכוז יעיל טיפוסי יהיה .5-5 מ"מ.
6 NP40 על 0.1% -0.5% מספיקים כדי solubilize שומני הקרום ביותר. השילוב של NP40 וDOC - משמש לעתים קרובות בריכוזים שווים (לדוגמא, 0.5% מכל אחד) - משמשים לעתים קרובות כמוצא מחמיר יותר שעדיין משאיר אינטראקציות בין חלבונים רבים בשלמותה.
7 SDS הוא חומר ניקוי יוני מחמיר יותר (0.1% CMC). גם זה יכול לשמש בשילוב עם שני חומרי ניקוי האחרים SDS / NP40 / DOC 0.1 / 0.5 / 0.5% כחיץ החמרת ביניים.
טבלה 2. חלבונים לאבחון ללפקח על איכות הליך decellularization. טבלה זו מפרטת דוגמאות של חלבונים כי הם מאפיינים של כל תא subcellular (cytosol, גרעין, קרום פלזמה, שלד תא וECM), שניתן להשתמש כדי לפקח על האיכות של הליך decellularization ואת היעילות של ECM-העשרה.
| תאיים תא | חלבונים אבחון |
| חלבוני cytosolic | דהידרוגנז glyceraldehyde 3-פוספט (GAPDH) |
| חלבונים גרעיניים | ההיסטונים, Lamins, Nucleoporin |
| חלבוני קרום | Integrins, transferrin קולטן |
| חלבוני cytoskeletal | אקטין, טובולין, vimentin |
| חלבוני ECM קרום במרתף | קולגן IV, Nidogens, Laminins |
| חלבוני ביניים ECM (ביניים) | קולגן אני, קולגן III, קולגן VI, פיברונקטין |
להמלצה על נוגדנים, לראות הפרסומים שלנו 8-10.
נפח הטבלה 3. של חומרים כימיים לעכל דגימות מועשרות ECM לפפטידים. טבלה זו מפרטת חומרים כימיים המשמשים לresuspend דגימות חלבון מועשר ECM ולהפחית, alkylate, deglycosylate ולעכל דגימות חלבונים לפפטידים לפני ניתוח ספקטרומטר מסה.
| ריאגנטים | הכנה | ריכוז / סכום סופי לגלולה 1 מ"מ בעובי (~ 5-10 משקל מ"ג יבש) | נפח לגלולה 1 מ"מ בעובי (~ 5-10 משקל מ"ג יבש) |
| אמוניום ביקרבונט (NH 4 HCO 3) | 100 פתרון מ"מ במי HPLC כיתה | - | - |
| אוריאה | 8 M פתרון ב100 אמוניום ביקרבונט מ"מ | 8 מ ' | 50 μl |
| Dithiothreitol | מחדש במי HPLC כיתה ב 500 מ"מ | 10 מ"מ | 1 μl |
| Iodoacetamide | מחדש במי HPLC כיתה ב 500 מ"מ | 25 מ"מ | 2.5 μl |
| Peptide- N -Glycosidase F (PNGaseF) | פתרון מסחרי ב 500 U / μl | 1,000 U | 2 μl |
| כיתה ספקטרומטריית Endoproteinase LysC, מסה | מחדש במי HPLC כיתה ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl | 1 מיקרוגרם | 2 μl |
| טריפסין, כיתה ספקטרומטר מסה (סיבוב 1) | פתרון מסחרי ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl | 3 מיקרוגרם | 6 μl |
| טריפסין, כיתה ספקטרומטר מסה (סיבוב 2) | פתרון מסחרי ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl | 1.5 מיקרוגרם | 3 μl |
| חומצה אצטית Trifluoro-(TFA) | פתרון של 50% במי HPLC כיתה | - | 2-5 μl |
| אצטוניטריל (elution) | פתרון 60% עם 0.1% TFA במי HPLC כיתה | - | 500 μl |
| אצטוניטריל (הכינון מחדש) | פתרון 3% עם 0.1% TFA במי HPLC כיתה | - | 100 μl |
תכנית איור 1. של ההליך ניסיוני. עבודה סכמטי של protocol לdecellularize רקמות (סעיף 1), לשלוט באיכות של decellularization ולהעריך את העשרת ECM (סעיף 2) ולעכל דגימות חלבון מועשר ECM לפפטידים לפני ניתוח המוני ספקטרומטריית (סעיף 3).
שליטת איור 2. איכות של הליך decellularization על ידי כתם מערבי כתמים מערביים בוצעו על ריאות עכברי () וxenograft החלב אנושי קרצינומה (ב) דגימות באמצעות הנוגדנים הבאים:. אנטי-אקטין ארנב (שיבוט 14-1) ואנטי ארנב -β1 integrin נוגדנים המיוצרים במעבדה שלנו; אני ארנב נגד קולגן, עכבר אנטי-GAPDH ונוגדני ארנב נגד פאן-ההיסטונים היו מMillipore. לאחר דגירה נוגדן ראשונית, הקרומים נשטפו וטופחו בנוכחות נגד ארנב HRP-מצומדות עז או עז אנטי-mouנוגדנים משני se ממעבדת ImmunoResearch ג'קסון. לבסוף, הקרומים נשטפו וטופחו במערב ברק ™ chemiluminescence מגיב (PerkinElmer LAS). * מציין זיהום היסטון שייר מינימאלי של חלק ECM-עשיר. ** מציין דלדול חלקי שלי monomeric (מוחזקי unassembled) קולגן בשבריר CS. *** מצביע זיהום אקטין שייר של חלק ECM-עשיר. למרוח מזוהה עם הנוגדן אנטי-קולגן מייצג רמות לאחר translational שינויים (למשל, cross-linking, glycosylation) שונות.
Discussion
שינויים
למרות שאנו מועסקים הליך מדויק זה להעשיר את ECM מעשר רקמות וסוגי גידולים 8 - 10, שינויים בפרוטוקול יש לשקול במקרים הבאים:
1) זיהוי של חלבוני ECM בשברי ביניים.
מטריצות תאי מרקמות שונות או סוגי גידולים עשויות להיות שונות בextractability / insolubility, כפי שפורטו לעיל לפיברונקטין וlaminins. לדוגמא, הוא חשב כי ECM של רקמות fibrotic או רקמות שיפוץ מתהפך מאוד דינמי ולכן אפשר להתבונן שיעור גבוה יותר של חלבוני ECM ברקמות אלה להיות יותר בקלות ניתן להפיק 12. בהתאם לחלק שבו חלבוני ECM מזוהים, אנו ממליצים להקטין את זמן הדגירה של הצעד שגרמו למיצוי של חלבוני ECM או השמטת צעד ש.
2) Detection של חלק משמעותי של רכיבים תאיים בגלולה מועשרת ECM. בחלק מרקמות או סוגי גידולי תאי יחס: ECM הוא (גידולים למשל, כבד, טחול, שאינה desmoplastic) גבוהים במיוחד. במקרה זה, זיהום משמעותי של החלק מועשר ECM על ידי חלבונים תאיים (בחלבונים מסוימים cytoskeletal ו / או ההיסטונים) ניתן לצפות. לרוקן את החלבונים תאיים ביעילות, אנו ממליצים לחזור פעמיים הדגירה במאגר M ו / או הצפת CS (שני חומרי הניקוי המכילים, בדרך כלל זה מכלה חלבונים תאיים בשפע). חלופה נוספת תהיה להשתמש מאגרים חלופיים עם ריכוזי אבקת גבוהים יותר, עם האזהרה כי זה עלול להוביל לדלדול של חלבוני ECM יחסית יותר מסיסים וכן (ראה הסעיף הבא).
3) אלטרנטיבי לשימוש בערכה מסחרית.
לא הצליחו, מסיבות קנייניות, כדי לקבל את ההרכב המדויק של המאגרים הלוך ושובמ 'הספק של ערכת חילוץ חלבון הממודרת. עם זאת, יש לנו כלל בטבלה 1 הערות על סמך הניסיון שלנו באמצעות מאגרי תוצרת בית עם חומר ניקוי מוגדר (NP-40, deoxycholate נתרן וSDS) ריכוזים לנהל עקירות דומות. מחקר שנערך לאחרונה גם הדגיש את חשיבותו של ה- pH של מאגרי decellularization לשמור חלבוני ECM 13.
מגבלות של הטכניקה
השיטה המוצגת כאן מסתמכת על העובדה שחלבוני ECM הם מהותי יותר מסיס מאשר רוב החלבונים תאיים. עם זאת, שיטת decellularization מתוארת כאן בהחלט תמציות מרכיבים מסיסים הנוכחיים בתוך ECM כגון כמה גורמי גדילה או אנזימי שיפוץ-ECM. למרות שהחלבונים הקשורים ECM ההדוק לחלבוני ECM אותרו על ידי פרוטאומיקה בדגימות מוכנות כפי שתוארו, שיטה זו עשויה להיות מחמירה מדי לפרופיל ההרכב מלא הקשורים matrisomeחלבונים.
משמעות של הטכניקה ביחס לשיטות אחרות
יתרונה של השיטה שהוצגה כאן על פני שיטות אחרות הוא שזה יכול להיות מותאם לאופי של ECM עניין: ניתן להשמיט צעדי ביניים או חוזר ונשנה, כדי למנוע האובדן של חלבוני ECM או להגדיל את הדלדול של זיהום חלבונים תאיים בהתאמה. שיטה זו משתמשת גם רק כמויות מזעריות של חומרי ניקוי ששטפו כדי למנוע ההפרעה שלהם עם הכנת פפטיד שלאחר מכן וספקטרומטר מסה. לבסוף, בשיטה המתוארת כאן כדי לעכל הכנות חלבון ECM-עשיר לפפטידים יש גם את היתרון של לא דורש חלבונים להיות מסיסים ויכולים להתנהל על שברים מועשרים ECM "גולמיים".
שיטות אלטרנטיביות decellularization ניצול chaotropes (כגון hydrochloride guanidine) ללמוד את ההרכב של ECMS ידי ספקטרומטריית מסה שbeen דווח בספרות (ביקורת ב -14) והיה בשימוש בשילוב עם ספקטרומטריית מסה לאפיין את הרכב ECM של סחוס 15,16, לב 17, בלוטת החלב 18 וכלי דם 19 ו -20 ממברנות מרתף גלומרולרי.
המלצות
אין להשתמש בשיטות decellularization העסקת טריפסין לעכל את תאים אם ECMS מועשר לפרוטאומיקה לאחר ניתוח, כtrypsinization יגרום עיכול ECM חלקי ואובדן חלבוני ECM ופפטידים. באופן דומה, אם עיכול collagenase היה לשמש כדי לסייע שיבוש רקמות, זה היה צריך להיות במעקב צמוד כפי שהוא גורם לעיכול ECM ואובדן חלבוני ECM ופפטידים.
לעומת עיכול בג'ל ב- פתרון? חלבוני ECM הם צולבים ומסיסים מאוד ו, גם כאשר resuspended במאגר 3x Laemmli (המכילים 6% SDS) ו100mm DTT, PO הנפרדאורלי על ג'לי SDS. כך ב- ג'ל עיכול הוא לא שיטה מועדפת.
יישומים עתידיים
ראוי לציין, כי בעוד לא נדון כאן, בהרכב של כל אחד משברי ביניים שנאספו במהלך decellularization יכול גם להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה. זה עשוי להיות יקר במיוחד כאשר לומדים מדגמים קטנים מאוד (כלומר, ביופסיות אנושיות) או כאשר מידע רצוי בשברים סלולריים אחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | |
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 |
References
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308 (2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
