Dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire Ion Signalen in hersenweefsel

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de institutionele richtlijnen van de Heinrich Heine Universiteit in Düsseldorf, Duitsland, evenals de Europese Gemeenschap richtlijn (86/609 / EEG) worden uitgevoerd. (: O52 / 05 institutionele act nummer) Alle experimenten werden bij de Animal Care en gebruik Facility van de Heinrich Heine Universiteit van Düsseldorf, Duitsland meegedeeld aan en goedgekeurd door de Animal Welfare Office. In overeenstemming met de Duitse Animal Welfare Act (Tierschutzgesetz de artikelen 4 en 7), geen formele aanvullende goedkeuring voor de post-mortem verwijdering van hersenweefsel nodig was.

1. Voorbereiding van de dubbelloops ion-selectieve micro-elektroden

1. Bereid twee borosilicaatglas capillairen met filament: een met een lengte van 7,5 cm en een buitendiameter van 1,5 mm te worden gebruikt voor de ion-gevoelige trommel, en een met een lengte van 6,5 cm en een buitendiameter van 1,0 mm voor de latere referentie vat.
2. Reinig de capil vin- den in aceton gedurende 12 uur en spoel meerdere malen met abs. ethanol en laat ze drogen. Elektroden kunnen nu worden opgeslagen in een exsiccator.
3. Gebruik twee-componenten lijm of een kleine strook van aluminiumfolie om een ​​lange en een korte capillaire samen op te lossen aan beide uiteinden. Verhit een dubbele-capillair in een oven bij 60 ° C gedurende 1 uur. Dit versnelt het uithardingsproces. Bewaar de elektroden nu in een exsiccator.
4. Centreer de dubbel-capillair in een verticale trekker met een draaibaar boorkop. Verwarm de spoel zachtjes tot het glas zacht genoeg om een ​​horizontale rotatie van de draaibare klauwplaat toe 180 °. Tijdens deze stap verhinderen verlenging van de capillair met een spie onder de boorkop.
5. Na het afkoelen, verwijder de mechanische breuk en een tweede verwarming protocol van toepassing te trekken uit de capillaire, resulterend in twee scherpe, dubbelloops capillairen (figuur 1). De tip diameter van een dubbel-capillair moet in de buurt van 1 urn.

ve_content ">
Figuur 1. Architectuur van ion-selectieve micro-elektroden. (A) Foto van een dubbelloops micro-elektrode. Ter illustratie en een betere zichtbaarheid, de vloeistof in de referentie vat werd gekleurd. (B) Foto van een concentrische micro-elektrode en de bijbehorende referentie-elektrode. De tip van concentrische micro-elektrode wordt vergroot weergegeven op zijn linkerzijde. In (A) en (B), de ruimte ingenomen door de ionen sensor in de uiteinden van de pipetten post-colored. Aan de onderkant, is het topje opstelling van beide types elektroden schematisch weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Als u een verticale puller met draaibare chuck niet beschikbaar is, bereiden een dubbelloops ion-Selectieve micro-elektrode in een horizontale trekker met theta glas.
   1. Daartoe trek theta glas (buitendiameter van 1,5 mm, lengte 7,5 cm) te resulteren in twee elektrodes met twee vaten per. Mark een van hen om te dienen als de toekomstige referentie vat. Gesilaniseerde andere zoals hieronder beschreven dienen als de toekomstige ion-selectieve barrel procedure.
      OPMERKING: Terwijl de voorbereiding van dubbelloops theta-glas elektroden is veel eenvoudiger dan het opstellen van twisted dubbelloops elektroden, zijn ze meer geneigd om cross-actie tussen beide vaten als de dunne scheidingswand glazen wand tussen hen neiging poreus te zijn het uiterste puntje.
      OPMERKING: Omdat de sensor cocktail (zie hieronder) hydrofoob is, moet het binnenoppervlak van de latere ionengevoelige barrel hydrofoob worden gemaakt en door een proces genaamd silanisatie. Hiervoor is hexamethyldisilazaan (HMDS) gebruikt (figuur 2) zoals beschreven in de volgende stap.

Figuur 2. silanisatie van pipetten. (A) hexamethyldisilazaan (HMDS) reageert met de Si-OH-groepen van het binnenste glasoppervlak en maakt het hydrofoob. (B) De linker foto toont de volledige silanisatie unit. Een brede mond fles met HMDS wordt geplaatst op een verwarmingsplaat ingesteld op 40 ° C. Bovenop de fles, wordt een houder (PH) die de capillairen (Cap) gemonteerd. De rechter foto toont een vergroting van de pipet houder (PH) die de capillairen (Cap). (C) Schematische zijaanzicht van de op maat gemaakte pipet houders (PH) voor dubbelloops (links) of concentrische (rechts) haarvaten (GLB) als gemonteerd op een brede mond fles. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit cijfer.

7. Net voordat puvulling elektroden, vul ong. 20 ml HMDS in een brede mond fles. Attentie: HMDS is uitsluitend voor gebruik in een zuurkast, dampen zijn schadelijk voor de gezondheid! Sluit de fles en zet het op een verwarmingsplaat, ingesteld op 40 ° C. Verwarm een ​​oven, onder de kap geplaatst en tot 200 ° C.
8. Vul het vat verwijzing naar de punt met gedestilleerd water om haar silanisatie tijdens de volgende procedure te voorkomen.
9. Zet dubbelloops capillair met de punt omhoog op een speciale, op maat gemaakte houder (Figuur 2B, 2C). De stompe open uiteinde moet vrij, via de bodem van de houder (figuur 2C, links). Daarna plaatst u deze houder op de brede mond fles met de voorverwarmde HMDS voor 70 min.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat HMDS damp vrij door haarvaten kan stromen. Tijdens een silaneren proces kan de 20 ml HMDS niet volledig verdampt en de fles aldus meerdere keren worden gebruikt.
10. Naoorlogseds, breng de capillairen een metalen standaard en in de voorverwarmde oven gedurende twee uur. Dit zal zowel de vaten drogen.
11. Na silanisatie, houdt de haarvaten droog tot gebruik. Terwijl de eerste procedure vereist ongeveer 3,5 uur in totaal elektroden kunnen nu in een exsiccator bewaard enkele weken.
12. Op de dag van hun experimenteel gebruik, bereiden ion-selectieve elektroden vult het uiteinde van de gesilaniseerde vat met 1-2 ul van de ion-selectieve sensor (Figuur 1A). Kalium-gevoelige micro-elektroden, gebruik maken van de vervoerder valinomycine; en voor natrium-gevoelige micro-elektroden, gebruik ETH 157 als drager.
13. Merk op dat de ion-selectieve sensor is heel viskeuze waardoor het moeilijk voor de tip om goed te vullen.
14. Vul het referentie vat met HEPES-gebufferde zoutoplossing (zie hieronder).
    OPMERKING: Terwijl andere, eenvoudigere iso-osmotisch zout ook kunnen worden gebruikt, geven wij de voorkeur een zoutoplossing met de samenstelling die in wezen vergelijkbaarde perfusie zoutoplossing (ACSF, zie 3.6.), omdat het kan lekken en dringen in het weefsel tijdens experimenten. Daarom is het essentieel dat dit zout een hogere concentratie van het ion te bepalen dan de ACSF gebruikte bevat.
15. Backfill de sensor met een zoutoplossing die een hoge concentratie van de ionen te detecteren. Aldus backfill de sensor met 100 mM NaCl zoutoplossing (voor natrium-gevoelige micro-elektroden) of 100 mM KCl (kalium-gevoelige micro-elektroden). Wees er zeker niet om extra luchtbellen plaatst tijdens deze procedure.
16. Als de silanisatie succesvol was en de sensor is goed gevuld, observeert de sensor oppervlak vormen een duidelijk zichtbare concaaf oppervlak tegen de opvulling (Figuur 1A). Anders kan de sensor zijn teruggetrokken uit de capillairwand en de punt zal worden vervuld. Dergelijke elektroden niet functioneel.
17. Plaats gechloreerde zilveren draden in beide vaten (let op de sen niet aan te rakensor) en sluit elk vat met tandheelkundige wax (Figuur 1A).

2. Voorbereiding van Concentric Ion-selectieve micro-elektroden

1. Voor de buitencilinder gebruikt dunwandige glazen capillairen met filament (buitendiameter 2,0 mm) en een lengte van 7,5 cm. Voor het binnenvat, neem dunwandige capillairen met filament, een buitendiameter van 1,2 mm en een lengte van 10 cm.
2. Reinig de capillairen in aceton gedurende 12 uur. en spoel meerdere malen met abs. ethanol en laat ze drogen. Elektroden kunnen nu worden opgeslagen in een exsiccator.
3. Vul ong. 20 ml HMDS in een brede mond fles. LET OP! HMDS is uitsluitend voor gebruik in een zuurkast, dampen zijn schadelijk voor de gezondheid. Sluit de fles en zet het op een verwarmingsplaat, ingesteld op 40 ° C. Verwarm een ​​oven, onder de kap geplaatst en tot 200 ° C.
4. Steek de 2,0 mm capillaire in een horizontale trekker en trek het uit te resulteren in haarvaten met korte kaarsen en een tip Diameter van ~ 4 micrometer (Figuur 1B).
5. Put uitgetrokken 2,0 mm capillair met zijn punt tot op een maat, speciale houder (Figuur 2B, Figuur 2C), zodat het stompe uiteinde opent naar de holte van de fles (figuur 2C, rechts). Daarna plaatst deze houder op de brede mond fles met de voorverwarmde HMDS voor 70 min. Zorg ervoor dat HMDS damp door alle haarvaten kan stromen.
6. Daarna dragen de capillairen een metalen standaard en in de voorverwarmde oven gedurende twee uur.
7. Na silanisatie, houdt de haarvaten droog tot gebruik. Terwijl de eerste procedure vereist ongeveer 3,5 uur in totaal nu de elektroden in een exsiccator enkele weken bewaard.
8. Net voor gebruik, vult een kleine hoeveelheid sensor (0,2 pl) in de gesilaniseerde capillair (Figuur 1B).
9. Aan de binnenste capillair te bereiden, plaatst u een kleine capillaire diameter in de trekker en trek om te resulteren in tweehaarvaten met lange kaarsen en scherpe tips (Figuur 1B). Vul met 100 mM NaCl (natrium-gevoelige micro-elektroden) of 100 mM KCl (kalium-gevoelige micro-elektroden) zoutoplossing.
10. Plaats de sensor gevulde en met zoutoplossing gevulde capillaire rechtstreeks in elkaars verlengde op een maatwerk stopper uit dekglaasjes. Steek de kleinere capillaire een korte weg naar de grotere capillaire.
11. Bevestig de haarvaten naar een ander dekglaasje met boetseerklei, transfer naar het stadium van een microscoop en visualiseren met 100x vergroting. Met behulp van een glazen staaf die op een micromanipulator en door de fijne schijf van het stadium van de microscoop is gemonteerd, langzaam vooruit de buitenste capillaire over de binnenste capillaire totdat de afstand tussen hun uiteinden is ongeveer 5 micrometer (Figuur 1B).
12. Bevestig het open uiteinde van de buitenste naar de binnenste capillair capillaire behulp dental wax. Als alternatief, breng een kleine druppel cyanoacrylaat (Crazy Glue) instead van was.
    NB: Toevoeging van een kleine druppel water zal de lijm polymeriseren en bevestig de elektroden op zijn plaats. Steek een gechloreerde zilveren draad in het binnenste vat en sluit deze af met tandheelkundige wax (Figuur 1B).
13. Om de referentie electrode te bereiden, neem een ​​7,5 cm lang capillair met filament en een buitendiameter van 1,5 mm en trek een verticale puller. Zorg ervoor dat de tips zijn relatief lang, maar niet te scherp (tip diameter ~ 1 micrometer).
14. Gooi de bovenste pipet, open de onderste boorkop en til de onderste pipet met ongeveer 5 mm. Sluit de boorkop steeds tillen totdat het uiteinde van de onderste elektrode is gepositioneerd ongeveer 5 mm boven het verwarmingselement. Verwarm de spoel en een tang om de punt te buigen over 45 ° naar opzij. Lagere pipet ongeveer 1-2 mm. Bend weer ongeveer -45 ° tot aan de punt weer parallel rechtstreeks van de hoofdas (Figuur 1B). Deze procedure is noodzakelijk om de nauwe plaatsing van de tip van de referentie mogelijknce elektrode naar de concentrische elektrode.
15. Vul het referentie vat met HEPES-gebufferde zoutoplossing (zie hieronder), plaats een gechloreerde zilverdraad en sluit het vat met tandheelkundige wax (Figuur 1B).

3. Salines

1. Bereid zoutoplossing voor opvulling van kalium-gevoelige elektroden (zie 1.15.), Bestaande uit 100 mM KCl. Saline voor opvulling van natrium- gevoelige elektroden bestaat uit 100 mM NaCl.
2. Bereid zoutoplossing opvulling referentie vaten (. HEPES-gebufferde zoutoplossing, zie 1,16) bestaat uit (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _CaCl2, 2 MgSO _4, 1,25 NaH ₂ PO ₄ en 25 HEPES, getitreerd met NaOH resulteert in een pH van 7,4.
3. Bereid zoutoplossing kalibratie van kalium-gevoelige elektroden zijn samengesteld uit 25 mM HEPES en een totaal van 150 mM NaCl en KCl, pH ingesteld op 7,4 met NMDG-OH (N-methyl-D-glucamine). Hier werd kalibratie uitgevoerd met zoutoplossingen bevattende 1, 2, 4 of 10 mMKCl; ACSF bevatte 2,5 mM KCl (figuur 5).
4. Bereid zoutoplossing kalibratie natrium-gevoelige elektroden als volgt; (in mM) 25 HEPES, 3 KCl, in totaal 160 NaCl en NMDG-Cl, pH ingesteld op 7,4 met NMDG-OH. Kalibratie uitvoeren met een zoutoplossing bevattende (in mM) 70, 100, 130 of 160 NaCl; ACSF NaCl bevatte 152 (figuur 6).
5. Voor de bepaling van kruisreactie van de sensor met andere ionen, bijv., PH, bereiden kalibratiepunten zoutoplossingen met vaste ionenconcentraties, maar variërende pH.
   OPMERKING: Hoewel deze procedure niet is aangetoond in de huidige studie, dan kunt u moet verwijzen naar eerdere werk de aanpak van dit probleem (bijvoorbeeld ^11,12).
6. Bereid acute hersenweefsel slices in zoutoplossing bestaande uit (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCI, 0,5 _CaCl2, 6 _MgCl2, 1,25 NaH _{2PO 4,} 26 NaHCO ₃ en 20 glucose, geborreld met 95% _O2 en 5 % CO _2, wat resulteert in een pH van7.4.
7. Voer experimenten in hersencoupes in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) bestaande uit (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 1,25 NaH _{2PO 4,} 26 NaHCO ₃ en 20 glucose, geborreld met 95 % _O2 en 5% CO2, wat resulteert in een pH van 7,4.
8. Voor stimulatie van neuronen en gliacellen, worden de oplossingen die 0,2, 0,3, 0,4 of 0,5 mM glutamaat en 10 mM L-aspartaat opgelost in ACSF. Voor druk applicatie, te ontbinden 10 mM glutamaat in HEPES-gebufferde zoutoplossing.
9. Bereid applicatie pipet voor druk applicatie. Plaats dunwandige glazen capillairen met filament (buitendiameter 2,0 mm) en een lengte van 7,5 cm in horizontale trekker en trek om te resulteren in een tip diameter van ~ 1 uM.
10. Voor de inductie van epileptische activiteit, voor te bereiden-magnesium vrije ACSF met 10 uM bicuculline methiodide.
11. Tot de generatie van actiepotentialen remmen, bereiden een 10 mM voorraad solutIon van tetrodotoxine (TTX) in gedestilleerd water. Tijdens experimenten wordt TTX direct toegevoegd aan de ACSF te resulteren in een eindconcentratie van 0,5 uM.
12. Activering van AMPA-receptoren te voorkomen, stelt een 50 mM voorraadoplossing van cyano-nitrochinoxaline-dion (CNQX) in dimethylsulfoxide (DMSO). Tijdens experimenten wordt dit direct toegevoegd aan de ACSF te resulteren in een eindconcentratie van 100 pM.
13. Activering van NMDA-receptoren te blokkeren, bereiden een 50 mM voorraad oplossing van amino-phosphonopentanoate (APV) in 70 mM _NaHCO3. Tijdens experimenten wordt dit direct toegevoegd aan de ACSF te resulteren in een eindconcentratie van 100 pM.

4. Kalibratie van Ion-selectieve micro-elektroden

1. Kalibreer ion-selectieve micro-elektrode direct voor en na elk experiment.
2. Hechten elektroden op micromanipulators en plaats ze in een-ACSF doorbloed experimentele ruimte, onder een stereo-microscoop geplaatst (figuur 3 g>, 4). Plaats de referentie-elektrode in de voorkamer (Figuur 4A, B). Schakel bad perfusie, ervoor zorgen dat de stroom is ongeveer 2 ml / min.

Figuur 3. Het experimentele werkruimte. De opname rig bestaat uit een trillingsvrije gedempte tabel die het x / y-translationele stadium met de experimentele bad, de micromanipulators en een stereomicroscoop met hoogwaardige optiek. De stereomicroscoop is ook uitgerust met een CCD camera voor documentatiedoeleinden. Daarnaast wordt een druk aanbrenginrichting voor focale drugtoepassing gebruikt. De registrerende elektroden zijn via de kop fase een differentiële versterker. De gedigitaliseerde data (A / D-omzetter) is opgenomen met een computer. Het bad perfusie wordt gerealiseerd door een peristaltische micro pomp (niet getoond).> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Schakel de A / D-omzetter, de verschilversterker en de computer, en start de opname software (figuur 3, 4). Door weerstand van de ion-gevoelige vaten zeer hoog (10-20 GQ zie hieronder), gebruiken een speciale electrometer versterker met hoge ingangsimpedantie _(R = 10 TΩ) en een kleine instelstroom (I _voorspanning = 50 fA - 1 PA).

Figuur 4. Elektronische en ruimtelijke vormgeving van de experimentele opstelling. (A) Schematische weergave van de optekeninrichting. De tips van een dubbelloops micro-elektrode (blauw) en een concentrische micro-elektrode (rood) zijn gerangschikt in een experimentele bad gevuld met een zoutoplossing. Het bad referentie-elektrode is schematisch aangegeven. De poten Tial gedetecteerd door de ion-selectieve barrels (V ₁₎ uit het elektrisch veld potentiaal _(Vref) en het ion potentiaal (V _ion), terwijl de referentie vaten (V ₂₎ Alleen detecteren _Vref. Om V _ion isoleren, wordt _Vref afgetrokken van V ₁ door middel van een verschilversterker (DA). (B) Topografie van de experimentele fase met een concentrische micro-elektrode op zijn plaats. Het centrum van de experimentele fase bestaat uit het experimentele bad dat het segment preparaat. Om het bad grond, wordt de verwijzing bad elektrode ondergedompeld in de voorkamer, die ook gastheer is van de perfusie inlaat. Het podium zelf is geaard door een aparte grond connector. De concentrische micro-elektrode en de referentie-elektrode worden gedragen door aparte pipet houders gedreven door micromanipulators. Micro-elektrode en de referentie-elektrode zijn elektronisch gekoppeld met het hoofd fase van de versterker.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Sluit gechloreerde zilverdraden de respectieve ingangen van de kop fase van de verschilversterker (figuur 4). Bepaal elektrode weerstanden. Ervoor zorgen dat de weerstand van de referentie vat tussen 30-100 MQ en de weerstand van de ion-gevoelige vat tussen 10-20 GQ.
5. Pas spanningssignalen op nul en de opname te starten.
6. Merk op dat het potentieel gedetecteerd door de ion-selectieve barrels (V ₁₎ uit het elektrisch veld potentiaal _(Vref) en het ion potentiaal (V _ion), terwijl de referentie vaten (V ₂₎ Alleen detecteren _Vref. Om V _ion isoleren, wordt _Vref afgetrokken van V ₁ door middel van een verschilversterker (DA) (Figuur 4A).
7. Na het verkrijgen van een stabiele basislijn,switch kalibratie zoutoplossingen bevattende vastgestelde concentraties van de ionen te meten.
   OPMERKING: Figuur 5A toont de kalibratie van een dubbelloops kalium-gevoelige micro-elektrode. In figuur 6A is de kalibratie van zowel een dubbelloops en een concentrische ^Na + -gevoelige micro-elektrode getoond. Hoewel we niet de procedure hier niet te beschrijven, er rekening mee dat eventuele storingen met andere ionen moeten worden getest voordat u een specifieke ionofoor (zie ook 3.4.).

Figuur 5. Kalibratie van dubbelloops kalium-selectieve micro-elektroden. (A) Verandering van de spanning van de referentie-loop _(Vref) en de K ⁺ -potentiële _{(K +} V) in reactie op veranderingen in het bad K ⁺ concentratie ( [K ^+] _b) zoals aangegeven. (B) Half-logarithmic perceel van [K ^+] _b versus V _{K +.} Een lineaire grafiek van de gegevens blijkt dat er een helling van ongeveer 56 mV. Ter illustratie, werden sporen glad met een Sawitzky-Golay filter (breedte 20). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Bepaal de spanningsrespons van de ion-selectieve vat in reactie op een bekende verandering in ionenconcentratie. Plotgegevens in één logaritmische grafiek (figuur 5B, 6B) en bepaal de helling. Een ideale sensor volgt een relatie beschreven door de Nernst-vergelijking (zie bv ^13):

V: gemeten elektrodepotentiaal;
V _0: standaard elektrodepotentiaal, bijvoorbeeld voor een AgCl-draad bij een temperatuur van 298,15 K en een partiële druk van 101,325 kPa (absoluut)
T: absolute temperatuur (in Kelvin)
Z: lading op de ionen (+ 1 voor kalium en natrium)
F: Faraday constante (96,500 coulombs)
c ': extracellulaire ion concentratie
c '': intracellulaire ionenconcentratie

Voor praktische doeleinden, en de natuurlijke logaritme worden omgezet in de Nernst helling s dat dan geldt voor een bepaald ion en temperatuur:

NB: Voor kalium en natrium elektroden, een ideale spanning reactie van de sensor vertoont dus een lineaire helling van ongeveer -58 mV bij RT. Enige afwijking van deze kan worden aanvaard (figuur 5B, 6B). Het is echter essentieel dat de respons-karakteristieken van een gegeven elektrode niet significant veranderen (met meer dan 10%, zie hieronder) voor en na een experiment.

Figuur 6. kalibratie van natrium-selectieve micro-elektroden en vergelijking van dubbelloops met concentrische elektroden (A) Top sporen. Verandering in de spanning van de referentie-vaten (V _ref) van een dubbelloops elektrode (zwarte gestippelde spoor) en een concentrische elektrode (grijze spoor) als reactie op veranderingen in het bad Na ⁺ concentratie ([Na ^+] _b) zoals aangegeven. Merk op dat de spanning responsen van beide elektroden zijn vrijwel identiek. Bottom sporen: Veranderingen in de spanning van de Na ⁺ -potentiële (V _{Na +)} van een dubbelloops elektrode (zwarte sporen) en een concentrische elektrode (grijze spoor) als reactie op veranderingen in [Na ^+] _b. (B) Half-logaritmische grafieken van de [Na ^+] _b ten opzichte van de V _{Na +} van beide elektroden. Lineaire percelen van de gegevens blijkt dat er een helling van ongeveer 48 mV voor beide elektroden.(C) Reactie van de V _{Na +} van een dubbelloops (zwart trace) en een concentrische elektrode (grijze spoor) om een snelle verandering in de [Na ^+] _b van 152 mm tot 70 mm. Merk op dat de reactietijd van de concentrische elektrode aanzienlijk sneller. Ter illustratie, werden sporen glad met een Sawitzky-Golay filter (breedte 20). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

9. Bepaal de reactietijd van de elektroden, die afhangt van de tip diameter, de vorm van het uiteinde en de dikte van de sensor fase in de elektrode.
   LET OP: In deze experimentele opstelling en het gebruik van een snelle verandering tussen verschillende perfusie Salines (uitwisseling afgerond tip van de elektrode binnen 500 msec), dubbelloops natrium-gevoelige micro-elektroden bereikte een stabiele potentieel binnen 9,7 ± 4,5 sec bijoverschakelen van 152 mM tot 70 mM [Na ^+] (n = 6). Binnen dezelfde instelling, concentrisch natrium-gevoelige micro-elektroden bereiken van stabiele potentiaal in slechts 0,8 ± 0,3 seconden (n = 6) (Figuur 6C). Dit benadrukt de superieure tijdsresolutie van concentrische vergeleken met dubbelloops micro-elektroden.

5. Dissectie van Tissue

1. Voor het genereren van acute plakjes, verdoven muizen van postnatale dagen 16-20 met CO _{2 en} snel onthoofd (naar aanleiding van de aanbeveling van de Europese Commissie gepubliceerd in: Euthanasie van proefdieren, Luxemburg: Bureau voor officiële publicaties van de Europese Gemeenschappen, 1997; ISBN 92-827-9694-9).
2. Bereid hippocampus weefsel schijfjes (dikte 250 pm), na een standaard procedure (zie bijvoorbeeld ^14).

6. Experimentele Procedures

1. Transfer een sneetje in de experimentele kamer en zet deze vast met eenraster.
2. Laat de gekalibreerde ion-selectieve micro-elektrode op de slice oppervlak spietsen het stratum radiatum van CA1 gebied tot een diepte van ongeveer 50 urn bij de elektrode.
   OPMERKING: Wat betreft de slice oppervlak van de micro-elektrode leidt kenmerkende schommelingen in de ion-gevoelige vat. Bovendien schade aan cellen tijdens spietsen van het weefsel heeft afwijkingen ook. Wacht tot de uitgangswaarde is gestabiliseerd.
3. Voor de toepassing van de druk zender agonisten, vult een applicatie pipet met verbinding (bijvoorbeeld 0,5 mM glutamaat). Bevestig de pipet om een ​​micromanipulator en koppel deze aan een druk applicatie-apparaat.
4. Lagere toepassing pipet in het weefsel en voorzichtig plaats deze in de nabijheid van het uiteinde van de ion-selectieve micro-elektrode (~ 20-40 pm). Start drukuitoefening (bijv 10 sec, 40 mbar) en opnemen spanningsvariaties wordt bewaakt door de ion-selectieve micro-elektrode.
5. Voor bath gebruik van drugs, swjeuk tussen verschillende perfusie Salines voor een bepaalde duur.
6. Om het experiment beëindigd voorzichtig terugtrekken van de ion-selectieve micro-elektrode uit het weefsel en noteer eventuele drift in potentialen van de oorspronkelijke waarde nul die bij langdurige opname zou kunnen optreden.
7. Verwijder slice voorbereiding van het bad en het uitvoeren van een tweede kalibratie van de ion-selectieve micro-elektrode.
   Opmerking: Dit is nodig omdat de elektrode kan verstopt raken tijdens zijn beweging door het weefsel. Het is dus essentieel dat de elektrode reageert nog goed op veranderingen in ion concentraties. Experimenten moeten worden afgewezen als de reactie van de elektrode naar een tienvoudige verandering in ion concentratie is gedaald met meer dan 10%. Goed werkende elektroden kunnen in principe worden hergebruikt in verschillende experimenten. Dit geldt vooral voor concentrische elektroden, die zelfs kan enkele dagen. Het is echter essentieel dat de kalibratie procedures reherhaalde vóór en na elke enkel experiment de goede werking van de elektrode te waarborgen.

7. Data Analysis

1. Om de spanningsrespons van de ion-selectieve electrode veranderingen in extracellulaire ionenconcentratie te zetten, eerst omzetten vergelijking 2 om de verandering in de potentiaal AV _ion (mV) als volgt (hier aangetoond voor K ⁺ -gevoelige elektroden bepalen analoge procedure geldt voor ^Na + -gevoelige elektroden):

V _{K +:} veranderingen in de potentiaal van de valinomycine cilinder (mV)

s: Nernst helling

K ^+] _B: basisconcentratie kalium (in ons geval 2,5 mM K ⁺⁾

K ^+] _o: veranderingen in [K ^+] _o tijdens experiment

2. Bereken het rekenkundig gemiddelde van de pistes is afgeleid van de enkele logaritmische plots of de ijking vóór en na het experiment (zie figuur 5B, 6B, zie punt 4,8) op "s" te halen.
3. Om wijzigingen van de [K ^+] _o (Δ [K ^+] _o, in mm), te herschikken vergelijking 3 te berekenen:

Representative Results

Voor het bewaken [K ^+] _o veranderingen daarvan in respons op stimulerende activiteit, een dubbelloops kalium-selectieve micro-elektrode werd in de stratum radiatum van CA1 gebied. Een paar minuten na impalement, de ion-selectieve vat van de elektrode tot een stabiele basislijn (figuur 7A), wat overeenkomt met een [K ^+] _o van ongeveer 2,8 mm, een waarde in de buurt van de [K ^+] van de ACSF gebruikt ( 2,5 mM). Bath toepassing van 0,5 mM glutamaat gedurende 10 seconden leidde tot een reversibele verhoging [K ^+] _o ongeveer 4 mM, gevolgd door een onderschrijding hieronder basislijn bedrage van ~ 0,7 mM (Figuur 7A). Verlaging van de glutamaat concentratie 0,4, 0,3 en 0,2 mM leidde tot een overeenkomstige vermindering van de amplitude van zowel de tijdelijke toename en undershoot in [K ^+] _o (Figuur 7A).

OAD / 53.058 / 53058fig7.jpg "/>
Figuur 7. Extracellulaire kalium transiënten in respons op stimulerende activiteit. (A) [K ^+] _o transiënten, bestaande uit een stijging gevolgd door een onderschrijding onder de basislijn, geïnduceerd door bath toepassing van verschillende concentraties van glutamaat voor 10 seconden aangegeven. (B) Invloed van een perfusie met glutamaat receptor blokkers (CNQX, 100 uM, APV, 100 pM) en tetrodotoxine (TTX; 0,5 uM) met [K ^+] _o transiënten opgewekt door bath toepassing van 0,5 mM glutamaat gedurende 10 sec. (C) Spontane [K ^+] _o transiënten in aanwezigheid van ^{2 +} 0 mg / BIC. Experimenten aangetoond in AC werden uitgevoerd met dubbelloops elektroden. Ter illustratie werden sporen glad gemaakt met een Sawitzky-Golay filter (breedte 20). Gelieve click hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Eerdere experimenten hebben aangetoond dat dergelijke glutamaat-geïnduceerde [K ^+] _o-signalen worden niet significant gewijzigd tijdens het aanbrengen van TTX, en zijn dus in hoge mate onafhankelijk van de opening van spanningsafhankelijke natriumkanalen en neuronale actiepotentiaal generatie ^15,16. Om de mechanismen achter de waargenomen [K ^+] _o verandert in reactie op glutamaat studie werd toegepast glutamaat receptor blokkers, namelijk CNQX (100 uM, blocker van AMPA receptoren) en APV (100 uM, blocker van NMDA-receptoren) in aanwezigheid van TTX (0,5 uM). Bij het ​​bad perfusie met deze blokkers, glutamaat-geïnduceerde [K ^+] _o veranderingen waren vrijwel afgeschaft, bevestigt hun afhankelijkheid van de opening van ionotrope glutamaat receptor kanalen zoals gerapporteerd vóór (bv ^17; Figuur 7B).

Om verder aan te tonen tHij relevantie van glutamaat excitatie voor het opwekken van extracellulair [K ^+] signalen werden segmenten geperfuseerd met nominaal ^Mg2 + -vrij zoutoplossing die 10 uM bicuculline methiodide ⁽²⁺ 0 mg / BIC). Dit ontlast spanningsafhankelijke ^Mg2 + -blok van NMDA receptoren en dempt remming door het blokkeren van _{GABAA-receptoren,} waardoor spontane terugkerende epileptische activiteit in het netwerk (bijvoorbeeld ^18,19). Zoals verwacht ^20, spontane, terugkerende [K ^+] _o transiënten, ten bedrage van ongeveer 1,5 mm werden in 0mg ²⁺ / BIC zoutoplossing (Figuur 7C) gedetecteerd. Tussen deze reacties kleiner [K ^+] _o transiënten met een gemiddelde amplitude van ongeveer 0,2 mM opgetreden (figuur 7C).

In een tweede reeks experimenten, gebruikten we [Na ^+] -gevoelige micro-elektroden op ^[Na +] _o veranderingen opgewekt door toepassing van vastglutamaat agonisten. Hier hebben we ook ten opzichte van de respons kenmerken van dubbelloops en concentrische micro-elektroden gebruik van twee verschillende toepassingsgebieden paradigma. [Na ^+] -gevoelige micro-elektroden werden geplaatst in de stratum radiatum op een diepte van ongeveer 50 uM. Na een stabiele basislijn was verkregen, werd de glutamaat agonist L-aspartaat toegepast per bad perfusie (10 mM, 120 sec, bad perfusie aan 2,5 ml / min). Zoals eerder ²¹ waargenomen, toepassing van aspartaat veroorzaakt een langzame daling van de [Na ^+] _o met ongeveer 15 mm, dat ongeveer 5 minuten duurde en begon terug te vorderen van de uitgangswaarde (figuur 8A). Met name, terwijl de piek amplitudes en kinetiek van [Na ^+] _o signalen bepaald door beide elektroden waren vrijwel identiek onder deze omstandigheden concentrische elektroden vertoonde een stabiele basislijn en een lager geluidsniveau (figuur 8A).

Om de r te testen esponse kenmerken van de verschillende elektroden onder een snellere toepassing paradigma we druk aangebracht glutamaat door een fijne glazen pipet gelegen in het stratum radiatum op een afstand van 20-40 urn van de punt van de ion-selectieve micro-elektrode. Zoals verwacht ²¹ toepassing van glutamaat (10 mM) gedurende 200 ms veroorzaakte een daling van de [Na ^+] _o (Figuur 8B). De piek amplitudes van [Na ^+] _o afname waren vergelijkbaar voor beide elektroden (dubbelloops: 4,5 - 13,5 mM, n = 14; concentrische: 2,0 - 19,1 mM, n = 15). In tegenstelling tot de met langzame bad perfusie (zie hierboven), niet alleen de signaal-ruisverhouding, maar ook het tijdsverloop van [Na ^+] _o signalen gedetecteerd door de twee typen elektroden resultaten aanzienlijk verschilden. De gemiddelde tijd om de piek was 3,5 sec voor de dubbelloops en slechts 1,3 sec voor de concentrische micro-elektroden.

ve_content "> Aldus tonen deze resultaten aan en bevestigen snellere reactie kinetiek concentrische vs. dubbelloops Na ⁺ selectieve micro-elektroden (zie figuur 6C en 8B), zoals werd opgemerkt voor ^Ca2 + en pH-selectieve tegenhangers ¹⁰ . In tegenstelling tot de vorige studie, waarin korte burst synaptische stimulatie werd uitgevoerd om snel synaptisch geïnduceerde ion transiënten roepen, was er slechts een tendens, maar geen significant verschil in gemiddelde piek amplitudes tussen concentrische en dubbelloops elektroden met onze applicatie paradigma. Dit was waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de afstand van de aanvraag pipet uit de punt van de ion-selectieve micro-elektrode variëren met een factor twee (20-40 pm), en derhalve de maximale glutamaat concentratie aan het doelgebied niet hetzelfde in verschillende experimenten, belemmeren bestaande verschil piekamplituden.

(A) Top sporen: Verandering in de voltage de verwijzing vaten _(Vref) van een dubbelloops elektrode (zwarte gestippelde spoor) en een concentrische elektrode (grijze spoor) als reactie op veranderingen in het bad Na ⁺ concentratie ([Na ^+] _b) zoals aangegeven. Merk op dat de spanning responsen van beide elektroden zijn vrijwel identiek. Bottom sporen: Veranderingen in de spanning van de Na ⁺ -potentiële (V _{Na +)} van een dubbelloops elektrode (zwarte sporen) en een concentrische elektrode (grijze spoor) als reactie op veranderingen in [Na ^+] _b. (B) Half-logaritmische grafieken van de [Na ^+] _b ten opzichte van de V _{Na +} van beide elektroden. Lineaire percelen van de gegevens blijkt dat er een helling van ongeveer 48 mV voor beide elektroden. (C) Reactie van de V _{Na +} van een dubbelloops (zwart trace) en een concentrische elektrode (grijze spoor) om een snelle verandering in de [Na ^+] _b van 152 mm tot 70 mm. Merk op dat de reactietijd van de concentrische elektrode significant faster. Ter illustratie werden sporen glad gemaakt met een Sawitzky-Golay filter (breedte 20).

Figuur 8: extracellulaire natrium transiënten zoals gedetecteerd door dubbelloops en concentrische elektroden.
(A) Tijdelijke veranderingen in _Vref en [Na ^+] _o geïnduceerd door bad perfusie met 10 mM aspartaat voor 120 sec zoals aangegeven door de balk. De bovenste sporen vertonen een opname uitgevoerd met een dubbelloops elektrode, werden de lagere sporen opgenomen met een concentrische elektrode. (B) Tijdelijke veranderingen in _Vref en [Na ^+] _o geïnduceerd door plaatselijke drukuitoefening met 10 mM glutamaat gedurende 0,2 seconde, zoals aangegeven door de pijlpunt. De bovenste sporen vertonen een opname uitgevoerd met een dubbelloops elektrode, werden de lagere sporen opgenomen met een concentrische elektrode.Gestippelde rode lijnen geven lineaire aanvallen van de periode tussen het begin van het signaal naar zijn maximum. Merk op dat de reactietijd van de concentrische elektrode aanzienlijk sneller onder deze voorwaarde. Ter illustratie, werden sporen glad met een Sawitzky-Golay filter (breedte 20). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Vloeistof-carrier based, ion-selectieve elektroden zijn met succes toegepast voor decennia vele ionen, zeer specifieke sensoren beschikbaar ^22-26. Bij gebruik in de extracellulaire ruimte (ECS) van gewervelde hersenen preparaten, moet men in gedachten houden, echter, dat dit een zeer invasieve techniek: terwijl de breedte van de ECS is slechts ongeveer 20-50 nm, de diameter van de ion-selectieve micro-elektroden is ongeveer 1 micrometer (dubbelloops elektroden) of groter (concentrische elektroden). De tips van de ion-selectieve microelectrodes zal dus niet alleen het weefsel beschadigen tijdens hun impalement van het weefsel, maar ook vergroting van de ECS, waarbij een onderschatting van ion transiënten. Ondanks deze valkuilen, extracellulaire ion transiënten in reactie op de neuronale activiteit zijn opmerkelijk consistent tussen de verschillende laboratoria ^7,8, waaruit blijkt dat de betrouwbaarheid van deze methode.

De prestaties en de geschiktheid van de ion-selectieve elektrodenis afhankelijk van hun gevoeligheid en selectiviteit, die wordt bepaald door de sensor cocktail (vloeibaar ionofoor membraan ") gebruikt. Sensor cocktails bevatten een speciale vervoerder molecuul, bijvoorbeeld valinomycine voor K ⁺ selectieve micro-elektroden die een hoge selectiviteit voor kalium ²⁷ vertoont. Niettegenstaande, kan cross-reactiviteit met andere ionen optreden en moeten worden getest. Valinomycin vertoont een significante kruisreactiviteit van ammonium, die moet worden gehouden bij het ​​interpreteren van resultaten (bijvoorbeeld ^11,12). Bovendien, omdat de spanning-respons van de ionoforen volgt een Nernstian gedrag (zie vergelijking 1), de signaal-ruisverhouding en detectiegrens afhankelijk van de concentratie van de ionen te meten. Dus, terwijl kleine [K ^+] _o transiënten roepen grote spanningsveranderingen tegen lage uitgangswaarde [K ^+] _o, small [Na ^+] _o transiënten veel moeilijker te detecteren tegen high basislijn [Na ^+] _o (zie figuur 5 en 6).

De prestaties van ion-selectieve elektroden wordt mede bepaald door de temporele resolutie, die grotendeels wordt bestuurd door de elektrische tijdconstante. Deze wordt vooral bepaald door de axiale weerstand van de sensor, en de verdeelde capaciteit over de lengte van de pipet tussen de interne oplossingen en de externe vloeistof. In de dubbelloops configuratie is de weerstand hoog, vanwege de lange kolom opgevuld ion sensor. Voor een gegeven isolerend diëlektricum (hier borosilicaatglas), wordt de capaciteit bepaald door de diëlektrische dikte. In dubbelloops elektroden, het diëlektricum breedte bedraagt ​​de glazen wand van de pipet. Als het glas verdunt dicht bij de tip, de diëlektrische breedte valt, en de capaciteit toeneemt. Deze factoren combineren om elektroden met reactietijden die variëren van enkele honderden milliseconden tot enkele producerenseconden, omdat deze factoren worden gevarieerd.

Een belangrijk voordeel van concentrisch is dat zowel de axiale weerstand en de capaciteit om het bad sterk wordt verminderd. De concentrische pipet shunts grootste deel van de weerstand van de opgevuld ionenwisselaar, waardoor er slechts een overblijfsel in de laatste paar micrometer voor de tip. Bovendien wordt de vuloplossing in de concentrische pipet fysiek op afstand van het bad, gescheiden door de dikte van twee glazen wanden, de capaciteit sterk verminderen. Zoals eerder ¹⁰ aangetoond, het gecombineerde effect van verminderde weerstand en capaciteit is een verbetering in tijdresolutie twee orden van grootte. Bij concentrische ^Ca2 + en pH microelectrodes, 90% responstijden was zo laag als ¹⁰ 10-20 msec. Een verwante voordeel van concentrisch is lager geluidsniveau (zie Figuur 8). Door de sterk verminderde weerstand, spanningspieken vanuit ambient ruis geminimaliseerd. Bovendien herstel van dergelijke overgangen is snel, vanwege de snelle tijdconstante. Dergelijke voorwerpen zijn derhalve klein en snel, en een minder verstorend effect op de fysiologische opnames (zie Figuur 8).

Er zijn ook nadelen van de concentrische techniek. Ten eerste, de montage nog complexer en tijdrovender. Een tweede nadeel is de noodzaak om een ​​afzonderlijke referentie micro-elektrode plaatst bij zijn punt, meebrengen gebruik van een afzonderlijke micromanipulator of gespecialiseerde dubbele manipulator. Tenslotte kan dubbelloops micro-elektroden worden uitgebreid met een triple-loop ontwerp, waardoor detectie van twee verschillende soorten ionen tegelijk ^28, hetgeen niet mogelijk concentrische elektroden.

De meest voorkomende valkuilen

Inefficiënt silanisatie.

De belangrijkste stap, en de belangrijkste hindernis in de fabricage van een vloeistof-sensof op basis ion-selectieve micro-elektrode is de silanisatie procedure. Wanneer elektroden niet reageren op veranderingen in de specifieke ion concentratie, of reageren met een sub-Nernstian respons (dwz, ook minder dan 58 mV per tienvoudige concentratie verschil), slechte werkzaamheid van silanisering is meestal de oorzaak. In onze ervaring, kan dit gebeuren als de luchtvochtigheid te hoog of te laag is, typisch voor omstandigheden op de hoogte van de zomer of winter, respectievelijk. Als het mogelijk is om enige controle over vochtigheid kamer uitoefenen, kunnen deze problemen worden overwonnen.

Elektrode weerstand te hoog is.

Indien nodig, kan de weerstand van de ion-gevoelige barrel worden verminderd door afschuining. Daartoe blootgesteld zijn uiteinde een sterke straal schuurmiddel gesuspendeerd in water gedurende enkele seconden. Hierdoor wordt het meest bovenste uiteinde te breken en laat de weerstand tegen de gewenste waarde.

Zoutbruggen.

Zoutbruggen tussen de ionen en referentie-vaten resulteren in een slecht of geen reagerende elektroden en kan dus ook sterk verwarren hun prestaties in de kalibratie. Zoals hierboven vermeld (zie punt 1.6.), Dit is vooral een probleem bij dubbelloops theta glas wordt gekozen, maar het is een zeldzame gebeurtenis bij gebruik van de offset, gedraaide barrel techniek hier beschreven.

Met gemak van fabricage in het achterhoofd, de oorspronkelijke dubbelloops ontwerp van Lux ²⁹ kunnen vaak winstgevend gebruikt. Deze methode maakt gebruik van pre-vulling van de ion en referentie vaten met zout oplossingen, een snelle blootstelling aan een silaanoplossing door de zuigkracht en de verwijdering van de punt, gevolgd door incorporatie van ionenwisselaar, ook via de punt (zie ^30,31) . Deze elektroden kunnen worden vervaardigd in ongeveer 10 minuten, maar het punt is gemiddeld 4 um of meer en zijn meer vatbaar voor falen tijdens een experiment. Daarentegen silanisering methoden omvatten blootstelling aan silaan damp en warmteING kan elektroden met kleinere tips die dagen duren, en soms weken te produceren.

Samengevat, er zijn verschillende protocollen en zal over het ion-selectieve microelectrodes bereiden. Hier hebben we twee belangrijke procedures beschreven voor de productie van twisted dubbelloops evenals concentrische micro-elektroden die goed en betrouwbaar werken in onze laboratoria, met een totale slagingspercentage van bijna 100%. Belangrijk is dat deze technieken overdraagbaar meting van andere ionen soorten, waaronder pH of calcium, en ook toepasbaar op andere preparaten dan de hersenen, waaronder vocht gevulde holten of vloeistoffen in het algemeen. Last, but not least, ion-selectieve micro-elektroden laten bepalen van ionenconcentraties in de cellen. Vanwege hun betrekkelijk grote spuitopeningen (~ 1 micrometer) zal evenwel alleen mogelijk in cellen met een groot cellichaam, bijvoorbeeld zoals gevonden in ongewervelde preparaten ^28,32.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abrasive	MicroPolish	Buehler GmbH	Dissolved in A.dest
Borosilicate-glass capillaries	1405059	Hilgenberg	Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the sensor of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the reference of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-200TF-15	Science Products	Concentric, outer channel. O.D. 2.0 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-120TF-10	Science Products	Concentric, inner channel. O.D. 1.2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Electrometer amplifier with headstage		Custom-made	Rin = 10 TΩ and Ibias=50 fA-1pA (commercially available  alternatives: e.g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)
Experimental chamber		Custom-made	Commercially available from e.g.   Warner Instruments,USA;  Scientifica, UK
Furnace		Heraeus	Must stay constant at 200 °C
Hard sticky wax / dental wax	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Hot plate		Custom-made	Must stay constant at 40 °C
Microelectrodes holder made of plexiglas		Custom-made	Double-barreled: O.D.  capillaries 1.5 mm, concentric: O.D.  capillaries 2 mm
Micromanipulator		Leitz
Micromanipulator	MD4R	Leica
Stereo microscope	M205C	Leica
Objective	Plan 0.8xLWD	Leica
Pipette puller	Model PP-830	Narishige	Concentric microelectrodes
Pipette puller	Model P-97	Sutter Instruments	Sensor of concentric microelectrodes
Pneumatic drug ejection system	Picospritzter Type II	General Valve TM Corporation
Travel dovetail stage	DT 25/M	Thorlabs
Two-component glue	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together
Silverwire	99.9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Axon Instruments
Vertical puller	Type PE-2	Narishige Scientific Instruments	With a revolvable chuck for  double-barreled microelectrodes
x/y translational stage		Custom-made
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide	Sigma aldrich	14343	Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma aldrich	440191	CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin
L-Aspartic acid	Sigma aldrich	A9256	Activates NMDA and non-NMDA and EAATs
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma aldrich	G1626	Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),  mGluRs and EAATs
Potassium ionophore I - cocktail B	Fluka	60403	Based on valinomycin; CAUTION toxic
Sodium ionophore II - cocktail A	Fluka	71178	Based on ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic
Water, ultra pure	Sigma aldrich	W3500