मस्तिष्क के ऊतकों में मापन कोशिकी आयन के संकेतों के लिए डबल बैरल और गाढ़ा Microelectrodes

Summary

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Abstract

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called “concentric” ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K⁺]_o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na⁺]_o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

Introduction

Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions ¹. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na⁺]_o) ². The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures ³. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K⁺]_o) in the low mM range ^4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH ^6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K⁺]_o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium ⁸. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression ¹.

Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue ⁹. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct ¹⁰.

In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K⁺]_o or [Na⁺]_o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.

Protocol

इस अध्ययन सख्त हेनरिक हेन विश्वविद्यालय जर्मनी, डसेलडोर्फ संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार, साथ ही यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक (86/609 / ईईसी) में किया गया। (: O52 / 05 संस्थागत अधिनियम संख्या) सभी प्रयोगों हेनरिक हेन विश्वविद्यालय जर्मनी, डसेलडोर्फ पशु देखभाल और उपयोग की सुविधा में पशु कल्याण कार्यालय द्वारा लिए भेजी और अनुमोदित किया गया। जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार (Tierschutzgesetz, लेख 4 और 7), मस्तिष्क के ऊतकों का पोस्टमार्टम को हटाने के लिए कोई औपचारिक अतिरिक्त अनुमोदन जरूरी हो गया था। दोनाली आयन चयनात्मक Microelectrodes की 1. तैयारी रेशा के साथ दो borosilicate ग्लास केशिकाओं तैयार: 7.5 सेमी की लंबाई और 1.5 मिमी बाहरी व्यास के साथ एक 6.5 सेमी की लंबाई और बाद के लिए 1.0 मिमी बाहरी व्यास के साथ आयन के प्रति संवेदनशील प्रति बैरल के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक होने के लिए संदर्भ बैरल। Capil साफ उसके बाद 12 घंटे के लिए और एसीटोन में laries पेट के साथ कई बार कुल्ला। इथेनॉल और उन्हें सूखी। इलेक्ट्रोड अब Desiccator में संग्रहित किया जा सकता है। दोनों सिरों पर एक साथ एक लंबी और एक छोटी केशिका ठीक करने के लिए दो घटक गोंद या एल्यूमीनियम पन्नी की एक छोटी पट्टी का प्रयोग करें। 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक भट्ठी में डबल केशिका हीट। इस इलाज की प्रक्रिया को तेज करता। Desiccator में अब इलेक्ट्रोड स्टोर। एक revolvable चक के साथ एक ऊर्ध्वाधर खींचने में डबल केशिका केंद्र। कांच 180 डिग्री से revolvable चक के एक क्षैतिज रोटेशन अनुमति देने के लिए काफी नरम है जब तक धीरे कुंडल गर्मी। इस चरण के दौरान, चक के तहत एक ठसाठस साथ केशिका के बढ़ाव को रोकने के। ठंडा करने के बाद, यांत्रिक ब्रेक को हटाने और दो ​​तेज, दोनाली केशिकाओं (चित्रा 1) में जिसके परिणामस्वरूप, केशिका बाहर खींचने के लिए एक दूसरे हीटिंग प्रोटोकॉल लागू होते हैं। एक डबल-केशिका की नोक व्यास 1 माइक्रोन के करीब होना चाहिए। ve_content "> चित्रा आयन चयनात्मक microelectrodes के 1. वास्तुकला। एक दोनाली microelectrode के (ए) तस्वीर। चित्रण प्रयोजनों और बेहतर दृश्यता के लिए, संदर्भ प्रति बैरल के अंदर तरल रंगा हुआ था। एक गाढ़ा microelectrode और इसी संदर्भ इलेक्ट्रोड (बी) तस्वीर। गाढ़ा microelectrode की नोक अपनी बाईं पर बढ़े हुए दिखाया गया है। (ए) और (बी) में, pipettes के सुझावों में आयन संवेदक द्वारा कब्जे में अंतरिक्ष के बाद रंग का है। तल में, दोनों इलेक्ट्रोड प्रकार की नोक व्यवस्था रेखाचित्र के रूप में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। Revolvable चक के साथ एक ऊर्ध्वाधर खींचने उपलब्ध नहीं है, तो एक दोनाली आयन selec तैयारथीटा कांच का उपयोग कर एक क्षैतिज खींचने में सक्रिय microelectrode। यह अंत करने के लिए, थीटा कांच बाहर दो बैरल से प्रत्येक के साथ दो इलेक्ट्रोड में परिणाम के लिए (1.5 मिमी, लंबाई 7.5 सेमी की बाहरी व्यास) खींच। उनमें से मार्क एक भविष्य में संदर्भ बैरल के रूप में काम करने के लिए। भविष्य आयन चयनात्मक बैरल के रूप में काम करने के लिए नीचे वर्णित प्रक्रिया के लिए इसी तरह की अन्य silanized। नोट: दोनाली थीटा ग्लास इलेक्ट्रोड की तैयारी मुड़ दोनाली इलेक्ट्रोड की तैयारी कहीं आसान है जबकि उन दोनों के बीच पतली अलग कांच की दीवार में झरझरा हो जाता है, तब तक वे दोनों बैरल के बीच पार कार्रवाई से ग्रस्त हैं उनके अत्यंत टिप। नोट: सेंसर कॉकटेल (देखें नीचे) हाइड्रोफोबिक है, क्योंकि बाद में आयन के प्रति संवेदनशील बैरल की अंदरूनी सतह silanization नामक एक प्रक्रिया द्वारा के रूप में अच्छी तरह से हाइड्रोफोबिक प्रदान किया जाना चाहिए। अगले कदम के रूप में वर्णित इस के लिए, hexamethyldisilazane (HMDS) (चित्रा 2) का इस्तेमाल किया जाता है। <img alt= "चित्रा 2" src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 53,058 / 53058fig2.jpg" /> चित्रा 2. pipettes के silanization। (ए) Hexamethyldisilazane (HMDS) भीतरी सतह गिलास के सी-ओह समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है और हाइड्रोफोबिक यह प्रदान करता है। (बी) के बाईं फोटोग्राफ पूरे silanization इकाई से पता चलता है। HMDS युक्त एक चौड़े मुंह की बोतल 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्म थाली के शीर्ष पर रखा गया है। बोतल के शीर्ष पर, केशिकाओं (कैप) ले जाने के लिए एक धारक (पीएच) मुहिम शुरू की है। सही फोटोग्राफ केशिकाओं (कैप) ले जाने पिपेट धारक (पीएच) की वृद्धि से पता चलता है। (सी) एक चौड़े मुंह की बोतल पर घुड़सवार के रूप में डबल बैरल (बाएं) या गाढ़ा (दाएं) केशिकाओं (कैप) के लिए कस्टम बनाया पिपेट धारकों (पीएच) के योजनाबद्ध ओर देखें। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा। बस पु पहलेlling इलेक्ट्रोड, लगभग भरें। एक चौड़े मुंह की बोतल में 20 मिलीलीटर HMDS। ध्यान दें: HMDS केवल एक धूआं हुड में उपयोग के लिए है, वाष्प स्वास्थ्य के लिए खतरनाक होते हैं! बोतल बंद और 40 डिग्री सेल्सियस के लिए, एक गर्म थाली पर पूर्व निर्धारित डाल दिया। 200 डिग्री सेल्सियस के ऊपर, के रूप में अच्छी तरह से हुड के नीचे रखा एक भट्ठी, पहले से गरम। निम्न प्रक्रिया के दौरान अपने silanization को रोकने के लिए आसुत जल से अपनी टिप के संदर्भ बैरल भरें। एक विशेष, कस्टम बनाया धारक (चित्रा 2 बी, 2 सी) पर अपनी टिप के साथ दोनाली केशिका रखो। कुंद खुले अंत धारक (चित्रा -2 सी, बाएं) के नीचे के माध्यम से स्वतंत्र रूप से पहुँचना होगा। बाद में, 70 मिनट के लिए पूर्व गर्म HMDS युक्त चौड़े मुंह की बोतल पर इस धारक जगह है। नोट: HMDS वाष्प स्वतंत्र रूप से केशिकाओं के माध्यम से प्रवाह कर सकते हैं कि सुनिश्चित करें। एक silanization प्रक्रिया के दौरान, HMDS के 20 मिलीलीटर पूरी तरह से लुप्त हो जाना नहीं है, और बोतल इस प्रकार कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है। युद्ध के बादडी एस, दो बजे तक के लिए preheated भट्ठी एक धातु खड़ा करने के लिए और में केशिकाओं हस्तांतरण। यह दोनों बैरल सूख जाएगा। Silanization के बाद, उपयोग करें जब तक सूखी केशिकाओं रहते हैं। पूर्व प्रक्रिया में कुल लगभग 3.5 घंटे की आवश्यकता है, इलेक्ट्रोड अब कई हफ्तों के लिए एक desiccator में संग्रहित किया जा सकता है। उनके प्रयोगात्मक उपयोग के दिन, आयन चयनात्मक सेंसर (चित्रा 1 ए) के 1-2 μl साथ silanized बैरल की नोक भरने से आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड तैयार करते हैं। पोटेशियम के प्रति संवेदनशील microelectrodes के लिए, वाहक valinomycin का उपयोग करें; और सोडियम के प्रति संवेदनशील microelectrodes के लिए, वाहक के रूप में ETH 157 का उपयोग करें। टिप ठीक से भरने के लिए आयन चयनात्मक सेंसर यह मुश्किल बना काफी चिपचिपा है कि ध्यान से देखें। HEPES बफर खारा के साथ संदर्भ बैरल भरें (देखें नीचे)। नोट: अन्य, अधिक सरल आईएसओ आसमाटिक खारा के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है, हम एक नमकीन का उपयोग करना पसंद करते हैं, जिनमें से रचना करने के लिए अनिवार्य रूप से समान हैछिड़काव खारा (ACSF, 3.6 देखें।), यह बाहर रिसाव और प्रयोगों के दौरान ऊतक में घुसना सकता है। इसलिए, यह इस खारा आयन के एक उच्च एकाग्रता इस्तेमाल किया ACSF से निर्धारित किया जाना शामिल नहीं है कि यह भी आवश्यक है। आयन के एक उच्च एकाग्रता पता लगाया जा करने में शामिल है कि नमक के साथ सेंसर backfill। इस प्रकार, (सोडियम के प्रति संवेदनशील microelectrodes के लिए) 100 मिमी NaCl खारा या (पोटेशियम के प्रति संवेदनशील microelectrodes के लिए) 100 मिमी KCl के साथ सेंसर backfill। इस प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त हवा के बुलबुले डालने के लिए नहीं भूलें। Silanization सफल रहा था और सेंसर ठीक से भर जाता है, backfill (चित्रा 1 ए) के खिलाफ एक स्पष्ट रूप से दिखाई अवतल सतह के रूप में सेंसर सतह निरीक्षण करते हैं। अन्यथा, सेंसर केशिका दीवार से मुकर गया है हो सकता है और टिप नहीं भरा जाएगा। इस तरह इलेक्ट्रोड कार्य नहीं किया जाएगा। (दोनों बैरल में क्लोरीनयुक्त चांदी के तारों डालें सेन को छूने के लिए नहीं सावधान रहना होगासोर) और) दंत मोम (चित्रा 1 ए के साथ प्रत्येक बैरल सील। 2. गाढ़ा की तैयारी आयन चयनात्मक Microelectrodes बाहरी बैरल के लिए, रेशा (बाहरी व्यास 2.0 मिमी) और 7.5 सेमी की लंबाई के साथ पतली दीवारों कांच केशिकाओं का उपयोग करें। भीतरी बैरल के लिए, रेशा के साथ 1.2 मिमी बाहरी व्यास और 10 सेमी की लंबाई पतली दीवारों केशिकाओं ले। 12 बजे तक के लिए एसीटोन में केशिकाओं साफ करें। और फिर पेट के साथ कई बार कुल्ला। इथेनॉल और उन्हें सूखी। इलेक्ट्रोड अब Desiccator में संग्रहित किया जा सकता है। लगभग भरें। एक चौड़े मुंह की बोतल में 20 मिलीलीटर HMDS। चेतावनी! HMDS केवल एक धूआं हुड में उपयोग के लिए है, वाष्प स्वास्थ्य के लिए खतरनाक हैं। बोतल बंद और 40 डिग्री सेल्सियस के लिए, एक गर्म थाली पर पूर्व निर्धारित डाल दिया। 200 डिग्री सेल्सियस के ऊपर, के रूप में अच्छी तरह से हुड के नीचे रखा एक भट्ठी, पहले से गरम। एक क्षैतिज खींचने में 2.0 मिमी केशिका डालें और कम tapers और एक टिप diame साथ केशिकाओं में परिणाम के लिए इसे बाहर खींच~ 4 माइक्रोन (चित्रा 1 बी) के आतंकवाद। एक कस्टम बनाया, विशेष धारक (चित्रा 2 बी, चित्रा -2) अपनी कुंद अंत (सही, चित्रा -2) बोतल के गुहा के लिए खुलता है, ताकि पर अपनी टिप के साथ खींचा-बाहर 2.0 मिमी केशिका रखो। इसके बाद 70 मिनट के लिए पूर्व गर्म HMDS युक्त चौड़े मुंह की बोतल पर इस धारक जगह है। HMDS वाष्प सभी केशिकाओं के माध्यम से प्रवाह कर सकते हैं कि सुनिश्चित करें। बाद में, दो बजे तक के लिए preheated भट्ठी एक धातु खड़ा करने के लिए और में केशिकाओं हस्तांतरण। Silanization के बाद, उपयोग करें जब तक सूखी केशिकाओं रहते हैं। पूर्व प्रक्रिया में कुल लगभग 3.5 घंटे की आवश्यकता है, अब कई हफ्तों के लिए एक desiccator में इलेक्ट्रोड की दुकान। बस का उपयोग करने से पहले, silanized केशिका (चित्रा 1 बी) में सेंसर (0.2 μl) की एक छोटी राशि भरें। भीतरी केशिका तैयार करने के लिए, खींचने में एक छोटे व्यास केशिका डालने और दो में परिणाम के लिए बाहर खींचलंबे tapers और तेज टिप्स (चित्रा 1 बी) के साथ केशिकाओं। 100 मिमी NaCl (सोडियम के प्रति संवेदनशील microelectrodes) या 100 मिमी KCl (पोटेशियम के प्रति संवेदनशील microelectrodes) खारा के साथ भरें। सेंसर से भरे और coverslips से बने एक कस्टम निर्माण डाट पर एक दूसरे के साथ लाइन में सीधे खारा से भरे केशिका रखें। बड़ा केशिका में छोटे केशिका एक छोटा रास्ता डालें। , क्ले मॉडलिंग का उपयोग करते हुए एक और coverslip पर केशिकाओं फिक्स एक खुर्दबीन के मंच को हस्तांतरण और 100x बढ़ाई का उपयोग कल्पना। उनके सुझावों के बीच की दूरी लगभग 5 माइक्रोन (चित्रा 1 बी) है, जब तक एक micromanipulator पर और माइक्रोस्कोप के मंच के ठीक ड्राइव मोड़ से मुहिम शुरू की है कि एक गिलास छड़ी की मदद से, धीरे धीरे भीतरी केशिका से अधिक बाहरी केशिका अग्रिम। दंत मोम का उपयोग आंतरिक केशिका पर बाहरी केशिका के खुले अंत ठीक करें। वैकल्पिक रूप से, cyanoacrylate की एक छोटी सी बूंद (पागल गोंद) भारतीय नौसेना पोत लागूमोम की tead। नोट: पानी की एक छोटी छोटी बूंद के अलावा गोंद भाजन और जगह में इलेक्ट्रोड को ठीक कर देंगे। भीतरी बैरल में एक क्लोरीनयुक्त चांदी के तार डालने और दंत मोम (चित्रा 1 बी) के साथ इसे सील। संदर्भ इलेक्ट्रोड तैयार करने के लिए, रेशा के साथ एक 7.5 सेमी लंबे केशिका और 1.5 मिमी बाहरी व्यास लेने के लिए और एक ऊर्ध्वाधर खींचने के साथ बाहर खींच। सुझावों के अपेक्षाकृत लंबा है, लेकिन (टिप व्यास ~ 1 माइक्रोन) नहीं भी तेज कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। ऊपरी पिपेट त्यागें कम चक खोलने के लिए और के बारे में 5 मिमी से कम पिपेट उठा। फिर चक बंद करो और हीटिंग का तार ऊपर 5 मिमी के बारे में तैनात है कम इलेक्ट्रोड की नोक तक इसे उठा। कुंडल गर्मी और के बारे में 45 डिग्री की ओर करने से टिप मोड़ करने के लिए संदंश का उपयोग करें। लोअर पिपेट के बारे में 1-2 मिमी। बेंड फिर से के बारे में -45 डिग्री से मुख्य शाफ्ट (चित्रा 1 बी) के लिए वापस समानांतर में टिप निर्देशित करने के लिए। यह प्रक्रिया refere की नोक के करीब स्थिति को सक्षम करने के लिए आवश्यक हैगाढ़ा इलेक्ट्रोड के लिए nce इलेक्ट्रोड। HEPES बफर खारा (देखें नीचे) के साथ संदर्भ बैरल भरें, एक क्लोरीनयुक्त चांदी के तार डालने और दंत मोम (चित्रा 1 बी) के साथ बैरल सील। 3. Salines 100 मिमी KCl से बना पोटेशियम के प्रति संवेदनशील इलेक्ट्रोड (1.15 देखें।) की backfill के लिए खारा तैयार करें। Sodium- संवेदनशील इलेक्ट्रोड के backfill के लिए खारा 100 मिमी NaCl से बना है। 125 सोडियम क्लोराइड, 2.5 KCl, 2 2 CaCl, 2 MgSO 4, 1.25 नः 2 4 पीओ, और 25 HEPES titrated: (। 1.16 देखते हैं, HEPES बफर खारा) संदर्भ बैरल के backfill के लिए खारा तैयार (मिमी) से बना है NaOH के साथ 7.4 के पीएच में परिणाम के लिए। 25 मिमी HEPES से बना रहे हैं पोटेशियम के प्रति संवेदनशील इलेक्ट्रोड की जांच के लिए और 150 मिमी NaCl और KCl की कुल के लिए खारा तैयार करें, पीएच nmdg ओह (एन मिथाइल-डी-glucamine) के साथ 7.4 करने के लिए समायोजित। इधर, अंशांकन Salines 1, 2, 4 या 10 मिमी युक्त के साथ प्रदर्शन किया गया थाKCl; ACSF 2.5 मिमी KCl (चित्रा 5) निहित। सोडियम के प्रति संवेदनशील इलेक्ट्रोड के रूप में निम्न की जांच के लिए खारा तैयार करें; 25 HEPES, 3 KCl, nmdg-ओह के साथ 7.4 करने के लिए समायोजित 160 NaCl और nmdg सीएल, पीएच की कुल (मिमी)। 70, 100, 130 या 160 सोडियम क्लोराइड (मिमी) युक्त नमक के साथ अंशांकन प्रदर्शन; ACSF 152 सोडियम क्लोराइड (चित्रा 6) निहित। अन्य आयनों के साथ सेंसर, के पार प्रतिक्रिया के निर्धारण के लिए उदाहरण के लिए।, पीएच, निश्चित आयन सांद्रता के साथ अतिरिक्त अंशांकन Salines, लेकिन अलग-अलग पीएच तैयार करते हैं। नोट: इस प्रक्रिया वर्तमान अध्ययन में प्रदर्शन नहीं कर रहा है, वहीं इस मुद्दे (जैसे 11,12) को संबोधित पहले काम करने का उल्लेख करना चाहिए कृपया। 95% ओ 2 और 5 के साथ bubbled, 125 सोडियम क्लोराइड, 2.5 KCl, 0.5 2 CaCl, 6 2 MgCl, 1.25 नः 2 पीओ 4, 26 3 NaHCO, और 20 ग्लूकोज: (मिमी) से बना खारा में तीव्र मस्तिष्क ऊतक स्लाइस तैयार की एक पीएच में जिसके परिणामस्वरूप% सीओ 2,7.4। 125 सोडियम क्लोराइड, 2.5 KCl, 2 CaCl 2, 1 2 MgCl, 1.25 नः 2 पीओ 4, 26 3 NaHCO, और 20 ग्लूकोज, 95 के साथ bubbled: (मिमी) से बना कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) में मस्तिष्क के स्लाइस में प्रयोगों प्रदर्शन 7.4 की एक पीएच में जिसके परिणामस्वरूप% ओ 2 और 5% सीओ 2,। न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए, ACSF में भंग 0.2, 0.3, 0.4 या 0.5 मिमी ग्लूटामेट या 10 मिमी एल aspartate युक्त समाधान तैयार करते हैं। दबाव आवेदन के लिए, HEPES बफर खारा में 10 मिमी ग्लूटामेट भंग। दबाव के आवेदन के लिए आवेदन पिपेट तैयार करें। रेशा (बाहरी व्यास 2.0 मिमी) और क्षैतिज खींचने में 7.5 सेमी की लंबाई के साथ पतली दीवारों कांच केशिकाओं डालें और ~ 1 माइक्रोन की टिप व्यास में परिणाम के लिए बाहर खींच। Epileptiform गतिविधि के शामिल करने के लिए, 10 माइक्रोन bicuculline methiodide युक्त मैग्नीशियम मुक्त ACSF तैयार करते हैं। कार्रवाई क्षमता की पीढ़ी को बाधित करने के लिए, एक 10 मिमी स्टॉक solut तैयारtetrodotoxin के आयन आसुत जल में (TTX)। प्रयोगों के दौरान, TTX सीधे 0.5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में परिणाम की ACSF में जोड़ा जाता है। AMPA रिसेप्टर्स की सक्रियता को रोकने के लिए, cyano-nitroquinoxaline-Dione डाइमिथाइल sulfoxide में (CNQX) (DMSO) के एक 50 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है। प्रयोगों के दौरान, इस सीधे 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में परिणाम की ACSF में जोड़ा जाता है। NMDA रिसेप्टर्स की सक्रियता को ब्लॉक करने के लिए, 70 मिमी 3 NaHCO में एमिनो phosphonopentanoate (APV) के एक 50 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है। प्रयोगों के दौरान, इस सीधे 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में परिणाम की ACSF में जोड़ा जाता है। आयन चयनात्मक Microelectrodes 4. कैलिब्रेशन सीधे से पहले और एक प्रयोग के बाद आयन चयनात्मक microelectrode जांचना। (Micromanipulators के लिए इलेक्ट्रोड देते हैं और एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे रखा एक ACSF-भरकर रखा प्रायोगिक कक्ष, में उन्हें सम्मिलित चित्रा 3 </stron जी>, 4)। पूर्व चैम्बर (चित्रा -4 ए, बी) में संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें। स्नान छिड़काव पर स्विच, प्रवाह के बारे में 2 मिलीग्राम / मिनट है कि यह सुनिश्चित करने। चित्रा 3. प्रयोगात्मक काम करने की जगह। रिकॉर्डिंग रिग प्रयोगात्मक स्नान, micromanipulators, और उच्च गुणवत्ता प्रकाशिकी के साथ एक stereomicroscope साथ एक्स / y-translational मंच ले जाने के एक कंपन से damped तालिका के होते हैं। स्टीरियो माइक्रोस्कोप भी प्रलेखन प्रयोजनों के लिए एक सीसीडी कैमरा से लैस है। इसके अलावा, फोकल दवा आवेदन के लिए एक दबाव आवेदन डिवाइस का इस्तेमाल किया जाता है। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक अंतर एम्पलीफायर को सिर चरण के माध्यम से मिलकर कर रहे हैं। डिजीटल डेटा (ए / डी कनवर्टर) एक कंप्यूटर के साथ दर्ज की गई है। स्नान छिड़काव एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला सूक्ष्म पंप से पता चला है () नहीं दिखाया।> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर ए / डी कनवर्टर, अंतर एम्पलीफायर, और कंप्यूटर पर स्विच, और शुरू (चित्रा 3, 4)। आयन के प्रति संवेदनशील बैरल के प्रतिरोध बहुत अधिक है क्योंकि (10-20 GΩ, नीचे देखें), उच्च इनपुट प्रतिबाधा के साथ एक विशेष विद्युतमापी एम्पलीफायर का उपयोग करें (= 10 TΩ में आर) और एक छोटे से पूर्वाग्रह वर्तमान (मैं पूर्वाग्रह = 50 एफए – 1 देहात)। चित्रा 4. इलेक्ट्रॉनिक और सेट अप प्रयोगात्मक के स्थानिक डिजाइन। (ए) रिकॉर्डिंग व्यवस्था के योजनाबद्ध दृश्य। एक दोनाली microelectrode (नीला) और एक गाढ़ा microelectrode (लाल) के सुझावों खारा से भरा एक प्रयोगात्मक स्नान में व्यवस्थित कर रहे हैं। स्नान संदर्भ इलेक्ट्रोड रेखाचित्र के रूप में संकेत दिया है। poten संदर्भ बैरल जबकि वी (2) केवल वी रेफरी का पता लगाने, आयन चयनात्मक बैरल (वी 1) विद्युत क्षेत्र की क्षमता (वी रेफरी) और आयन संभावित (वी आयन) से बना है के द्वारा पता लगाया Tial। वी आयन को अलग-थलग करने के लिए, वी रेफरी एक अंतर एम्पलीफायर (डीए) के माध्यम से वी 1 से घटाया जाता है। जगह में एक गाढ़ा microelectrode साथ प्रायोगिक चरण का (बी) स्थलाकृति। प्रायोगिक चरण के केंद्र टुकड़ा तैयारी युक्त प्रयोगात्मक स्नान के होते हैं। स्नान भूमि पर, संदर्भ स्नान इलेक्ट्रोड भी छिड़काव इनलेट मेजबान जो पूर्व चैम्बर में डूबे हुए है। मंच अपने आप में एक अलग जमीन कनेक्टर द्वारा आधारित है। गाढ़ा microelectrode और उसके संदर्भ इलेक्ट्रोड micromanipulators द्वारा संचालित अलग पिपेट धारकों द्वारा किया जाता है। Microelectrode और संदर्भ इलेक्ट्रोड को इलेक्ट्रॉनिक एम्पलीफायर के सिर चरण के लिए मिलकर कर रहे हैं।e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। अंतर एम्पलीफायर (चित्रा 4) के प्रमुख के मंच से संबंधित सूचनाओं के लिए क्लोरीनयुक्त चांदी के तारों कनेक्ट करें। इलेक्ट्रोड प्रतिरोध का निर्धारण करते हैं। संदर्भ प्रति बैरल के प्रतिरोध 30-100 MΩ और आयन के प्रति संवेदनशील प्रति बैरल के प्रतिरोध 10-20 GΩ के बीच है के बीच है कि सुनिश्चित करें। शून्य करने के लिए वोल्टेज संकेतों को समायोजित करें और रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं। संदर्भ बैरल जबकि आयन चयनात्मक बैरल (वी 1) विद्युत क्षेत्र की क्षमता (वी रेफरी) से बना है और आयन संभावित (वी आयन) द्वारा पता लगाया क्षमता, (वी 2) केवल वी रेफरी का पता लगाने कि ध्यान दें। वी आयन को अलग-थलग करने के लिए, वी रेफरी एक अंतर एम्पलीफायर (डीए) (चित्रा 4 ए) के माध्यम से वी 1 से घटाया जाता है। एक स्थिर आधारभूत प्राप्त करने के बाद,आयन की परिभाषित सांद्रता वाले अंशांकन Salines के लिए स्विच मापा जाएगा। नोट: चित्रा 5 ए एक दोनाली पोटेशियम के प्रति संवेदनशील microelectrode की अंशांकन से पता चलता है। चित्रा 6A, की जांच के दोनों में एक दोनाली के रूप में अच्छी तरह से एक गाढ़ा ना + संवेदनशील microelectrode दिखाया गया है। हम यहाँ प्रक्रिया का वर्णन नहीं है, जबकि अन्य आयनों के साथ संभव हस्तक्षेप एक विशिष्ट ionophore उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए ध्यान दें कि (भी 3.4 देखें।)। चित्रा 5. दोनाली पोटेशियम चयनात्मक microelectrodes के कैलिब्रेशन। (ए) संदर्भ बैरल (वी रेफरी) की वोल्टेज में परिवर्तन और जवाब में कश्मीर + -potential (वि + K) का स्नान + K एकाग्रता में परिवर्तन करने के लिए ( [+ K] ख) संकेत के रूप में। (ख) आधावी + K बनाम बी [+ K] की -logarithmic साजिश है। डेटा की एक रैखिक साजिश के बारे में 56 एम वी के ढलान का पता चलता है। चित्रण प्रयोजनों के लिए, निशान एक Sawitzky-Golay फिल्टर (चौड़ाई 20) के साथ smoothed रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। आयन एकाग्रता में एक ज्ञात परिवर्तन के जवाब में आयन चयनात्मक बैरल की वोल्टेज प्रतिक्रिया का निर्धारण करें। प्लॉट एक भी लघुगणक साजिश में डेटा (चित्रा 5 ब, 6B) और ढलान का निर्धारण। एक आदर्श सेंसर नर्न्स्ट समीकरण द्वारा वर्णित एक रिश्ता इस प्रकार है (जैसे 13 देखें): वी: इलेक्ट्रोड संभावित मापा; वी 0: मानक इलेक्ट्रोड पोटेंशियल, एक AgCl-तार के लिए जैसे 298.15 कश्मीर के एक तापमान और 101.325 किलो पास्कल का आंशिक दबाव में (पूर्ण) <br/> आर: गैस निरंतर (8.314 जूल / डिग्री केल्विन / तिल) टी: (केल्विन में) पूर्ण तापमान Z: आयन पर चार्ज (+ 1 पोटेशियम और सोडियम के लिए) एफ: फैराडे निरंतर (96.500 Coulombs) ग ': बाह्य आयन एकाग्रता ग '': इंट्रासेल्युलर आयन एकाग्रता व्यावहारिक उद्देश्यों, और प्राकृतिक लघुगणक के लिए एक दिया आयन और तापमान के लिए तो वैध है जो नर्न्स्ट ढलान एस के लिए परिवर्तित कर रहे हैं: नोट: पोटेशियम और सोडियम इलेक्ट्रोड के लिए, सेंसर का एक आदर्श वोल्टेज प्रतिक्रिया इस प्रकार आरटी पर के बारे में -58 एम वी के एक रेखीय ढाल दर्शाती है। इस के कुछ विचलन (चित्रा 5 ब, 6B) को स्वीकार किया जा सकता है। यह एक दिया इलेक्ट्रोड की प्रतिक्रिया विशेषताओं से पहले और एक प्रयोग के बाद (10 से अधिक% द्वारा, नीचे देखें) काफी बदल नहीं है, तथापि, कि आवश्यक है। <img alt="चित्रा 6" srग = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 53,058 / 53058fig6.jpg" /> । चित्रा 6 सोडियम चयनात्मक microelectrodes और (ए) शीर्ष निशान दोनाली गाढ़ा इलेक्ट्रोड के साथ की तुलना की कैलिब्रेशन: एक दोनाली इलेक्ट्रोड के संदर्भ बैरल (वी रेफरी) की वोल्टेज में परिवर्तन (काला बिंदीदार ट्रेस) और एक स्नान ना + एकाग्रता में बदलाव के जवाब में गाढ़ा इलेक्ट्रोड (ग्रे ट्रेस) ([ना +] ख) संकेत के रूप में। दोनों इलेक्ट्रोड की वोल्टेज की प्रतिक्रियाएं लगभग समान हैं कि ध्यान दें। नीचे निशान: एक दोनाली इलेक्ट्रोड (काला ट्रेस) और [ना +] बी में बदलाव के जवाब में एक गाढ़ा इलेक्ट्रोड (ग्रे ट्रेस) की ना + -potential (वी ना +) की वोल्टेज में परिवर्तन। दोनों इलेक्ट्रोड के वी ना + बनाम बी (बी) [ना +] के आधा-लघुगणक भूखंडों। डेटा के रैखिक भूखंडों दोनों इलेक्ट्रोड के लिए के बारे में 48 एम वी के एक ढलान प्रकट करते हैं।70 मिमी के लिए 152 मिमी से ख एक दोनाली (काला ट्रेस) के वी ना + (सी) प्रतिक्रिया और [ना +] में एक तेजी से परिवर्तन के लिए एक गाढ़ा इलेक्ट्रोड (ग्रे ट्रेस)। गाढ़ा इलेक्ट्रोड की प्रतिक्रिया समय में काफी तेज है कि ध्यान दें। चित्रण प्रयोजनों के लिए, निशान एक Sawitzky-Golay फिल्टर (चौड़ाई 20) के साथ smoothed रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। इलेक्ट्रोड टिप में सेंसर चरण की मोटाई पर है, साथ ही टिप व्यास पर टिप के रूप निर्भर करता है जो इलेक्ट्रोड की प्रतिक्रिया समय निर्धारित करते हैं। नोट: इस प्रयोगात्मक में स्थापित और (500 मिसे के भीतर इलेक्ट्रोड की नोक पर पूरा विनिमय) अलग छिड़काव Salines के बीच तेजी से बदल रोजगार, दोनाली सोडियम के प्रति संवेदनशील microelectrodes 9.7 ± 4.5 सेकंड जब भीतर एक स्थिर क्षमता तक पहुँच152 मिमी से 70 मिमी [ना +] के लिए स्विचन (एन = 6)। एक ही सेटिंग के भीतर, गाढ़ा सोडियम के प्रति संवेदनशील microelectrodes केवल 0.8 ± 0.3 सेकंड (एन = 6) (चित्रा 6C) के भीतर एक स्थिर संभावित पहुंच गया। इस दोनाली microelectrodes की तुलना में गाढ़ा का बेहतर समय संकल्प पर जोर दिया। ऊतक के 5. विच्छेदन प्रायोगिक पशुओं की इच्छामृत्यु, लक्जमबर्ग: तीव्र स्लाइस की पीढ़ी के लिए, में प्रकाशित (decapitated यूरोपीय आयोग की सिफारिश के बाद जल्दी से सीओ 2 के साथ प्रसव के बाद दिन 16-20 का चूहों बेहोश करना और यूरोपीय समुदाय, 1997 के सरकारी प्रकाशनों के लिए कार्यालय, ISBN 92-827-9694-9)। एक मानक प्रक्रिया है (देखें उदाहरण के लिए 14) निम्नलिखित हिप्पोकैम्पस ऊतक स्लाइस (मोटाई 250 माइक्रोन), तैयार करें। 6. प्रायोगिक प्रक्रिया प्रायोगिक कक्ष में एक टुकड़ा हस्तांतरण और एक साथ इसे ठीकग्रिड। टुकड़ा सतह पर calibrated आयन चयनात्मक microelectrode के निचले हिस्से और के बारे में 50 माइक्रोन इलेक्ट्रोड के साथ की गहराई तक सीए 1 क्षेत्र की परत radiatum कोंचना। नोट: microelectrode साथ टुकड़ा सतह मार्मिक आयन के प्रति संवेदनशील बैरल में विशेषता के उतार-चढ़ाव होता है। इसके अलावा, ऊतक के कोंचना के दौरान कोशिकाओं को नुकसान के रूप में अच्छी तरह से उतार चढ़ाव का कारण बनता है। आधारभूत स्थिर हो गया है जब तक प्रतीक्षा करें। ट्रांसमीटर agonists के दबाव आवेदन के लिए, यौगिक (जैसे 0.5 मिमी ग्लूटामेट) के साथ एक आवेदन पिपेट भरें। एक दबाव आवेदन डिवाइस के लिए एक micromanipulator और कुछ इसे करने के लिए पिपेट संलग्न। ध्यान से कम आवेदन के ऊतकों में पिपेट और आयन चयनात्मक microelectrode (~ 20-40 माइक्रोन) की नोक की निकटता में जगह है। दबाव आवेदन (जैसे 10 सेकंड, 40 मिलीबार) और आयन चयनात्मक microelectrode द्वारा निगरानी के रूप में रिकॉर्ड वोल्टेज परिवर्तन की शुरुआत करें। दवाओं के स्नान आवेदन के लिए, दपएक निर्धारित अवधि के लिए अलग छिड़काव Salines के बीच खुजली। प्रयोग को समाप्त करने के लिए, ध्यान से ऊतक से आयन चयनात्मक microelectrode वापस लेने और लंबे समय तक रिकॉर्डिंग की अवधि के दौरान हुआ हो सकता है कि मूल शून्य मान से उच्च क्षमता में किसी भी बहाव रिकॉर्ड है। स्नान से टुकड़ा तैयारी निकालें और आयन चयनात्मक microelectrode के एक दूसरे अंशांकन प्रदर्शन करते हैं। नोट: इलेक्ट्रोड टिप ऊतकों के माध्यम से अपने आंदोलन के दौरान रुकावट पैदा हो सकता है, क्योंकि यह आवश्यक है। इस प्रकार, यह इलेक्ट्रोड अभी भी आयन सांद्रता में परिवर्तन करने के लिए ठीक से प्रतिक्रिया करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। आयन एकाग्रता में दस गुना परिवर्तन करने के लिए इलेक्ट्रोड की प्रतिक्रिया 10% से अधिक की गिरावट आ चुकी है, तो प्रयोगों को खारिज कर दिया जाना चाहिए। खैर से काम कर रहे इलेक्ट्रोड सिद्धांत में कई प्रयोगों में फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी कई दिनों के लिए पिछले कर सकते हैं जो गाढ़ा इलेक्ट्रोड, के लिए विशेष रूप से सच है। यह आवश्यक है, तथापि, कि अंशांकन प्रक्रियाओं फिर से कर रहे हैंइलेक्ट्रोड के समुचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए पहले और प्रत्येक एकल प्रयोग के बाद peated। 7. डेटा विश्लेषण बाह्य आयन एकाग्रता में परिवर्तन करने के लिए आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड का वोल्टेज प्रतिक्रिया में परिवर्तित करने के लिए, पहली बार कश्मीर + संवेदनशील इलेक्ट्रोड के लिए यहां प्रदर्शन संभावित ΔV आयन (एम वी) के रूप में (में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए 2 समीकरण बदल सकते हैं, अनुरूप प्रक्रिया के लिए लागू होता है ना) के प्रति संवेदनशील इलेक्ट्रोड +: वी + K: valinomycin बैरल की क्षमता में परिवर्तन (एम वी) एस: नर्न्स्ट ढलान + K] बी: पोटेशियम की आधारभूत एकाग्रता (हमारे मामले में 2.5 मिमी + K) + K] ओ [+ K] में परिवर्तन ओ प्रयोग के दौरान एकल लघुगणक भूखंडों से निकाली गई ढलानों के अंकगणित औसत की गणना ओपहले और प्रयोग के बाद अंशांकन च; "एस" को पुन: प्राप्त करने के लिए (सीएफ चित्रा 5 ब, 6B बिंदु 4.8 देखें)। [+ K] ओ (मिमी में Δ [+ K] ओ), के लिए 3 समीकरण को पुनर्व्यवस्थित परिवर्तन की गणना करने के लिए:

Representative Results

निगरानी करने के लिए [+ K] ओ और परिवर्तन उसमें उत्तेजक गतिविधि के जवाब में, एक दोनाली पोटेशियम चयनात्मक microelectrode सीए 1 क्षेत्र की परत radiatum में डाला गया था। कुछ मिनट कोंचना के बाद, इलेक्ट्रोड के आयन चयनात्मक बैरल के बारे में 2.8 मिमी, इस्तेमाल ACSF की [+ K] के करीब एक मूल्य (ओ एक [+ K], इसी लिए एक स्थिर आधारभूत (चित्रा 7A) पर पहुंच गया 2.5 मिमी)। 10 सेकंड के लिए 0.5 मिमी ग्लूटामेट का स्नान आवेदन ~ 0.7 मिमी (चित्रा 7A) की राशि आधारभूत नीचे एक अंडरशूट द्वारा पीछा किया, के बारे में 4 मिमी से ओ [+ K] में एक प्रतिवर्ती वृद्धि प्रेरित किया। 0.4, 0.3 ग्लूटामेट एकाग्रता कम है, और 0.2 मिमी क्षणिक वृद्धि और [+ K] ओ (चित्रा 7A) में undershoot दोनों के आयाम में एक इसी कमी के कारण होता है। oad / 53,058 / 53058fig7.jpg "/> चित्रा उत्तेजक गतिविधि के जवाब में 7. कोशिकी पोटेशियम यात्रियों। (ए) [+ K] ओ यात्रियों, संकेत के रूप में 10 सेकंड के लिए ग्लूटामेट के विभिन्न सांद्रता के स्नान आवेदन से प्रेरित आधारभूत नीचे एक अंडरशूट द्वारा पीछा वृद्धि हुई है, से मिलकर। (बी) ग्लूटामेट रिसेप्टर ब्लॉकर्स के साथ एक छिड़काव के प्रभाव (CNQX, 100 माइक्रोन; APV, 100 माइक्रोन) और tetrodotoxin (TTX; 0.5 माइक्रोन) [+ K] ओ यात्रियों पर 10 सेकंड के लिए 0.5 मिमी ग्लूटामेट का स्नान आवेदन द्वारा प्रेरित किया। 0Mg 2 + / बीआईसी की उपस्थिति में (सी) स्वतःस्फूर्त [+ K] ओ यात्रियों। एसी में दिखाया गया प्रयोगों दोनाली इलेक्ट्रोड का उपयोग किया गया था। चित्रण प्रयोजनों के लिए, निशान एक Sawitzky-Golay फिल्टर (चौड़ाई 20) के साथ smoothed थे। सीएल करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ Ick। इससे पहले प्रयोगों ऐसे ग्लूटामेट प्रेरित [+ K] ओ संकेतों काफी TTX के आवेदन के दौरान बदल नहीं कर रहे हैं कि दिखाया गया है, और इस तरह वोल्टेज gated सोडियम चैनल और neuronal संभावित कार्रवाई पीढ़ी 15,16 के उद्घाटन के अवसर पर काफी हद तक स्वतंत्र हैं। ग्लूटामेट के जवाब में मनाया [+ K] ओ परिवर्तन अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हम ग्लूटामेट रिसेप्टर ब्लॉकर्स, अर्थात् CNQX (100 माइक्रोन; AMPA रिसेप्टर्स की अवरोधक) लागू किया गया और APV (100 माइक्रोन; NMDA रिसेप्टर्स के अवरोधक) की उपस्थिति में TTX (0.5 माइक्रोन)। (चित्रा 7B जैसे 17) इन ब्लॉकर्स के साथ स्नान छिड़काव करने पर, ग्लूटामेट प्रेरित [+ K] परिवर्तन ओ से पहले रिपोर्ट के रूप में ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर चैनलों के उद्घाटन के अवसर पर उनकी निर्भरता की पुष्टि, लगभग समाप्त कर दिया गया। आगे टी प्रदर्शित करने के लिएबाह्य की पीढ़ी के लिए ग्लूटामेटरगिक उत्तेजना का वह प्रासंगिकता [+ K] का संकेत है, स्लाइस नाममात्र मिलीग्राम 2 + मुक्त खारा 10 माइक्रोन bicuculline methiodide (0Mg 2 + / बीआईसी) युक्त के साथ भरकर रखा गया था। इस NMDA रिसेप्टर्स की वोल्टेज पर निर्भर 2 मिलीग्राम + -block राहत मिलती है और (जैसे 18,19) नेटवर्क में सहज आवर्तक epileptiform गतिविधि है, जिससे गाबा एक रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करके निषेध dampens। जैसी कि उम्मीद थी, 20, सहज, आवर्तक [+ K] ओ यात्रियों, के बारे में 1.5 मिमी की राशि 0Mg 2 + / बीआईसी खारा (चित्रा 7 सी) में पाया गया। के बारे में 0.2 का एक मतलब आयाम के साथ इन प्रतिक्रियाओं के बीच, छोटे [+ K] ओ यात्रियों में मिमी (चित्रा 7C) हुआ। प्रयोगों की एक दूसरे सेट में, हम के आवेदन के द्वारा पैदा की [ना +] ओ परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए [ना +] के प्रति संवेदनशील microelectrodes इस्तेमाल कियाग्लूटामेट एगोनिस्ट। यहाँ, हम भी दो अलग-अलग आवेदन मानदंड रोजगार डबल बैरल और गाढ़ा microelectrodes के प्रतिक्रिया विशेषताओं की तुलना में। [ना +] के प्रति संवेदनशील microelectrodes के बारे में 50 माइक्रोन की गहराई पर परत radiatum में तैनात थे। एक स्थिर आधारभूत प्राप्त किया गया था के बाद, ग्लूटामेट एगोनिस्ट एल aspartate (2.5 मिलीग्राम / मिनट पर 10 मिमी, 120 सेकंड, स्नान छिड़काव) स्नान छिड़काव प्रति लागू किया गया था। इससे पहले 21 के रूप में मनाया, aspartate के आवेदन के बारे में 5 मिनट तक चली और उसके बाद आधारभूत वापस करने के लिए (चित्रा 8A) ठीक करने के लिए शुरू कर दिया है, जो मोटे तौर पर 15 मिमी, से ओ [ना +] में एक धीमी गति से कमी का कारण बना। दोनों इलेक्ट्रोड के द्वारा निर्धारित [ना +] ओ संकेतों के शिखर आयाम और कैनेटीक्स इन शर्तों के तहत लगभग समान थे, जबकि विशेष रूप से, गाढ़ा इलेक्ट्रोड एक अधिक स्थिर आधारभूत और एक कम शोर स्तर (चित्रा 8A) का प्रदर्शन किया। आर परीक्षण करने के लिए एक और अधिक तेजी आवेदन प्रतिमान के तहत अलग इलेक्ट्रोड की विशेषताओं esponse, हम आयन चयनात्मक microelectrode की नोक से 20-40 माइक्रोन की दूरी पर परत radiatum में तैनात एक ठीक गिलास पिपेट के माध्यम से ग्लूटामेट लागू दबाव। 21 जैसी कि उम्मीद थी, 200 एमएस के लिए ग्लूटामेट के आवेदन (10 मिमी) [ना +] ओ (चित्रा 8B) में एक बूंद के कारण होता है। [ना +] ओ कमी के शिखर आयाम इलेक्ट्रोड के दोनों प्रकार के लिए एक ही रेंज में थे (:;: 19.1 मिमी, एन = 15 – – 2.0 गाढ़ा 13.5 मिमी, एन = 14 4.5 डबल बैरल)। हालांकि, धीमी गति से स्नान छिड़काव (ऊपर देखें), संकेत करने वाली शोर अनुपात, लेकिन यह भी इलेक्ट्रोड के दो प्रकार के द्वारा पता लगाया [ना +] ओ संकेतों के समय के पाठ्यक्रम के साथ न केवल प्राप्त परिणामों के विपरीत काफी मतभेद था। पीक करने के लिए औसत समय गाढ़ा microelectrodes के लिए बैरल-डबल और केवल 1.3 सेकंड के लिए 3.5 सेकंड था। ve_content "> इस प्रकार, इन परिणामों का प्रदर्शन और बनाम गाढ़ा दोनाली ना + -selective microelectrodes के तेजी से प्रतिक्रिया कैनेटीक्स की पुष्टि, (सीएफ चित्रा 6C और 8 बी) ​​के रूप में भी सीए के लिए विख्यात था 2+ और पीएच-चयनात्मक समकक्षों 10 । लघु फट अन्तर्ग्रथनी उत्तेजना तेजी से synaptically प्रेरित आयन यात्रियों पैदा करने के लिए प्रदर्शन किया गया था जिसमें पूर्व अध्ययन के विपरीत, केवल एक प्रवृत्ति है, लेकिन हमारे आवेदन के साथ गाढ़ा और दोनाली इलेक्ट्रोड के बीच का मतलब शिखर आयाम में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था प्रतिमान। इस तथ्य के कारण शायद था कि फलस्वरूप दो (20-40 माइक्रोन) का एक पहलू से अलग किया आयन चयनात्मक microelectrode की नोक, और से आवेदन पिपेट की दूरी, कि लक्ष्य क्षेत्र में अधिक से अधिक ग्लूटामेट एकाग्रता शिखर आयाम में किसी भी मौजूदा अंतर में बाधा डालने, विभिन्न प्रयोगों में ही नहीं था। (ए) शीर्ष निशान: वोल्टा में बदलेंएक दोनाली इलेक्ट्रोड (काला बिंदीदार ट्रेस) और स्नान ना + एकाग्रता में बदलाव के जवाब में एक गाढ़ा इलेक्ट्रोड (ग्रे ट्रेस) के संदर्भ बैरल (वी रेफरी) के जीई ([ना +] ख) संकेत के रूप में। दोनों इलेक्ट्रोड की वोल्टेज की प्रतिक्रियाएं लगभग समान हैं कि ध्यान दें। नीचे निशान: एक दोनाली इलेक्ट्रोड (काला ट्रेस) और [ना +] बी में बदलाव के जवाब में एक गाढ़ा इलेक्ट्रोड (ग्रे ट्रेस) की ना + -potential (वी ना +) की वोल्टेज में परिवर्तन। दोनों इलेक्ट्रोड के वी ना + बनाम बी (बी) [ना +] के आधा-लघुगणक भूखंडों। डेटा के रैखिक भूखंडों दोनों इलेक्ट्रोड के लिए के बारे में 48 एम वी के एक ढलान प्रकट करते हैं। 70 मिमी के लिए 152 मिमी से ख एक दोनाली (काला ट्रेस) के वी ना + (सी) प्रतिक्रिया और [ना +] में एक तेजी से परिवर्तन के लिए एक गाढ़ा इलेक्ट्रोड (ग्रे ट्रेस)। गाढ़ा इलेक्ट्रोड की प्रतिक्रिया समय काफी एफएएस है कि नोटआतंकवाद। चित्रण प्रयोजनों के लिए, निशान एक Sawitzky-Golay फिल्टर के साथ smoothed थे (चौड़ाई 20)। 8 चित्रा: डबल बैरल और गाढ़ा इलेक्ट्रोड के द्वारा पता चला के रूप में कोशिकी सोडियम यात्रियों। (ए) क्षणिक वी रेफरी में परिवर्तन और [ना +] पट्टी द्वारा संकेत के रूप में ओ 120 सेकंड के लिए 10 मिमी aspartate के साथ स्नान छिड़काव द्वारा प्रेरित किया। ऊपरी निशान एक दोनाली इलेक्ट्रोड के साथ प्रदर्शन एक रिकॉर्डिंग, कम निशान एक गाढ़ा इलेक्ट्रोड का उपयोग कर दर्ज किया गया था। (बी) नोक से संकेत के रूप में 0.2 सेकंड के लिए 10 मिमी ग्लूटामेट के साथ स्थानीय दबाव आवेदन से प्रेरित ओ वी रेफरी और [ना +] में क्षणिक परिवर्तन। ऊपरी निशान एक दोनाली इलेक्ट्रोड के साथ प्रदर्शन एक रिकॉर्डिंग, कम निशान एक गाढ़ा इलेक्ट्रोड का उपयोग कर दर्ज किया गया था।बिंदीदार लाल लाइनों इसकी अधिकतम करने के लिए संकेत के शुरू होने के बीच की अवधि के रेखीय फिट बैठता है प्रतिनिधित्व करते हैं। गाढ़ा इलेक्ट्रोड की प्रतिक्रिया समय इस शर्त के तहत काफी तेज है कि ध्यान दें। चित्रण प्रयोजनों के लिए, निशान एक Sawitzky-Golay फिल्टर (चौड़ाई 20) के साथ smoothed रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

तरल-वाहक आधारित, आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड सफलतापूर्वक दशकों के लिए और कई आयनों के लिए नियोजित किया गया है, अति विशिष्ट सेंसर ^22-26 उपलब्ध हैं। ईसीएस की चौड़ाई केवल लगभग 20-50 एनएम, चयनात्मक आयन का व्यास है, जबकि: कशेरुकी मस्तिष्क की तैयारियों के बाह्य अंतरिक्ष (ईसीएस) में प्रयोग किया जाता है, एक यह एक काफी आक्रामक तकनीक है, तथापि, कि दिमाग में रखना चाहिए microelectrodes के बारे में 1 माइक्रोन (दोनाली इलेक्ट्रोड) या बड़ा (गाढ़ा इलेक्ट्रोड) है। आयन चयनात्मक microelectrodes के सुझावों के इस प्रकार न केवल ऊतक के अपने कोंचना दौरान ऊतकों को नुकसान पहुंचा, लेकिन यह भी आयन यात्रियों का एक मूल्यवान समझना के पक्ष में, ईसीएस बढ़ाना होगा। इन कमियों के बावजूद, neuronal गतिविधि के जवाब में बाह्य आयन यात्रियों इस पद्धति की विश्वसनीयता के लिए attesting विभिन्न प्रयोगशालाओं ^7.8 के बीच उल्लेखनीय संगत कर रहे हैं।

आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड के प्रदर्शन और उपयुक्तताइस्तेमाल सेंसर कॉकटेल '(तरल झिल्ली ionophore') द्वारा परिभाषित किया गया है जो उनकी संवेदनशीलता और चयनात्मकता, पर निर्भर है। सेंसर कॉकटेल पोटेशियम ²⁷ के लिए एक उच्च चयनात्मकता दर्शाती है जो कश्मीर ⁺ -selective microelectrodes के लिए valinomycin उदाहरण के लिए एक विशेष वाहक अणु होते हैं। होते हुए भी, अन्य आयनों के साथ पार जेट हो सकता है और परीक्षण किया जाना चाहिए। Valinomycin परिणामों की व्याख्या करते समय विचार किया जाना है, जिसमें अमोनियम, के लिए एक महत्वपूर्ण पार जेट (जैसे ^11,12) दर्शाती है। Ionophores की वोल्टेज-प्रतिक्रिया एक Nernstian व्यवहार (सीएफ समीकरण 1) इस प्रकार है, क्योंकि इसके अलावा, संकेत करने वाली शोर अनुपात और पता लगाने की दहलीज मापा जा आयन की एकाग्रता पर निर्भर करते हैं। इस प्रकार, जबकि छोटे ^[+ K] _ओ यात्रियों यात्रियों को और अधिक कठिन हाय के खिलाफ पता लगाने के लिए कर रहे हैं _ओ कम आधारभूत ^[+ K] _ओ, छोटे [ना ^+] के खिलाफ बड़े वोल्टेज परिवर्तन आह्वानजीएच आधारभूत [ना ^+] _ओ (सीएफ चित्रा 5 और 6)।

आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड का प्रदर्शन भी काफी हद तक अपने बिजली के समय लगातार द्वारा नियंत्रित होता है, जो अस्थायी समाधान, द्वारा निर्धारित किया जाता है। उत्तरार्द्ध में मुख्य रूप से सेंसर का अक्षीय प्रतिरोध द्वारा निर्धारित किया है, और इसकी आंतरिक समाधान और बाहरी द्रव के बीच पिपेट की लंबाई के साथ वितरित समाई, द्वारा किया जाता है। दोनाली विन्यास में, प्रतिरोध backfilled आयन सेंसर की लंबी स्तंभ के कारण अधिक है। (इस मामले borosilicate ग्लास में) एक दिया इन्सुलेट अचालक के लिए, समाई अचालक मोटाई से नियंत्रित होता है। दोनाली इलेक्ट्रोड में, अचालक चौड़ाई पिपेट की कांच की दीवार के बराबर है। कांच टिप के करीब thins के रूप में, अचालक चौड़ाई गिर जाता है, और समाई बढ़ जाती है। इन कारकों में कई सौ मिसे से कई को लेकर है कि प्रतिक्रिया समय के साथ इलेक्ट्रोड का उत्पादन करने के लिए गठबंधनसेकंड, के रूप में इन कारकों को अलग कर रहे हैं।

गाढ़ा डिजाइन का एक प्रमुख लाभ अक्षीय प्रतिरोध और स्नान करने के लिए समाई दोनों बहुत कम हो जाता है। टिप से पहले पिछले कुछ माइक्रोमीटर में केवल एक अवशेष छोड़ने backfilled आयन एक्सचेंजर के प्रतिरोध का सबसे गाढ़ा पिपेट शंट,। इसके अलावा, गाढ़ा पिपेट भीतर भरने समाधान शारीरिक रूप से बहुत समाई को कम करने, दो कांच की दीवारों की मोटाई से अलग कर दिया, स्नान से दूर है। ¹⁰ पहले दिखाया गया है, कम प्रतिरोध और समाई के संयुक्त प्रभाव परिमाण के दो आदेशों का अस्थायी समाधान में एक सुधार है। गाढ़ा सीए ² और पीएच microelectrodes के मामले में, 90% प्रतिक्रिया समय के रूप में कम मिसे 10-20 के रूप में ¹⁰ थे। गाढ़ा डिजाइन के एक संबंधित लाभ कम शोर स्तर (सीएफ चित्रा 8) है। किसी भी Ambien से, बहुत कम प्रतिरोध करने के लिए वोल्टेज यात्रियों कारणटी शोर को कम से कम कर रहे हैं। इसके अलावा, इस तरह के यात्रियों से वसूली की वजह से तेजी से लगातार समय की तेजी है। इस तरह की कलाकृतियों इसलिए छोटे और तेज कर रहे हैं, और शारीरिक रिकॉर्डिंग (सीएफ 8 चित्रा) पर एक कम विघटनकारी प्रभाव है।

गाढ़ा तकनीक का नुकसान भी हैं। पहला, उनके विधानसभा अधिक जटिल है, और समय लेने वाली है। एक दूसरा नुकसान यह एक अलग micromanipulator या एक विशेष दोहरी जोड़तोड़ या तो का उपयोग entailing, इसकी टिप के साथ एक अलग संदर्भ microelectrode जगह की जरूरत है। अंत में, दोनाली microelectrodes गाढ़ा इलेक्ट्रोड के लिए संभव नहीं है, जो एक ही समय ^{में 28} पर दो अलग-अलग आयन प्रजातियों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, एक ट्रिपल बैरल डिजाइन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

सबसे आम नुकसान

अक्षम silanization।

कोई भी तरल-Sens के निर्माण में सबसे महत्वपूर्ण कदम है, और प्रिंसिपल बाधाया आधारित आयन चयनात्मक microelectrode silanization प्रक्रिया है। इलेक्ट्रोड विशिष्ट आयन एकाग्रता में परिवर्तन करने के लिए जवाब है, या एक उप Nernstian प्रतिक्रिया (दस गुना एकाग्रता अंतर प्रति यानी, अच्छी तरह से कम से कम 58 एम वी) के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए असफल हो, silanization के गरीब प्रभावकारिता आम तौर पर कारण है। वायुमंडलीय आर्द्रता गर्मी या सर्दी की ऊंचाई पर स्थिति की ठेठ, बहुत अधिक है, या बहुत कम है, तो हमारे अनुभव में, यह क्रमश: हो सकता है। यह कमरे में नमी पर कुछ नियंत्रण लागू करने के लिए संभव है, तो इन समस्याओं को दूर किया जा सकता है।

इलेक्ट्रोड प्रतिरोध बहुत अधिक है।

यदि आवश्यक हो, आयन के प्रति संवेदनशील प्रति बैरल के प्रतिरोध bevelling तक कम किया जा सकता है। यह अंत करने के लिए, सेकंड के एक जोड़े के लिए पानी में निलंबित एक अक्खड़ की एक मजबूत जेट को अपनी टिप बेनकाब। यह अपने अत्यंत टिप तोड़ने के लिए और वांछित मूल्य के लिए प्रतिरोध कम करने के लिए प्रेरित करेगा।

नमक पुलों।

नमकआयन और संदर्भ बैरल के बीच पुल खराब है या कोई भी जवाब इलेक्ट्रोड का परिणाम है और इस प्रकार भी बहुत अंशांकन में उनके प्रदर्शन को उलझाना कर सकते हैं। (बिंदु 1.6 देखें।) जैसा कि ऊपर कहा, इस दोनाली थीटा कांच चुना जाता है जब एक मुद्दा मुख्य रूप से है, लेकिन यहाँ वर्णित ऑफसेट, मुड़ बैरल तकनीक का उपयोग करते समय एक दुर्लभ घटना है।

मन में निर्माण की आसानी के साथ, लक्स ²⁹ की मूल दोनाली डिजाइन अक्सर लाभ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि को भी टिप के माध्यम से, आयन एक्सचेंजर के समावेश से निम्नलिखित, नमक समाधान, नोक से अपनी सक्शन और निष्कासन से एक silane समाधान करने के लिए एक तेजी से जोखिम के साथ आयन और संदर्भ बैरल के पूर्व भरने का इस्तेमाल ^(30,31 देखें) । ये इलेक्ट्रोड लगभग 10 मिनट में गढ़े, लेकिन उनके टिप आकार आमतौर पर 4 माइक्रोन या उससे अधिक है और वे एक प्रयोग के दौरान असफल होने का खतरा है किया जा सकता है। इसके विपरीत, कि silanization तरीकों silane वाष्प और गर्मी के संपर्क में शामिलआईएनजी छोटे दिनों तक कि टिप्स, और कभी कभी हफ्तों के साथ इलेक्ट्रोड का उत्पादन कर सकते हैं।

साथ में ले ली कई प्रोटोकॉल देखते हैं और आयन चयनात्मक microelectrodes तैयार करने के तरीके के बारे में दृष्टिकोण। यहाँ, हम बंद करने के लिए 100% की समग्र सफलता दर के साथ, हमारी प्रयोगशालाओं में अच्छी तरह से और मज़बूती से काम जो मुड़ बैरल डबल के साथ ही गाढ़ा microelectrodes के निर्माण के लिए दो मुख्य प्रक्रियाओं का वर्णन किया है। महत्वपूर्ण बात है, इन तकनीकों का पीएच या कैल्शियम सहित अन्य आयनों प्रजातियों की माप के लिए हस्तांतरणीय हो जाएगा, और भी सामान्य रूप में तरल पदार्थ से भरे गुहाओं या तरल पदार्थ सहित मस्तिष्क की तुलना में अन्य तैयारियों पर लागू हो जाएगा। पिछले नहीं बल्कि कम से कम, आयन चयनात्मक microelectrodes कोशिकाओं के अंदर आयन सांद्रता के निर्धारण अनुमति देते हैं। उनके अपेक्षाकृत बड़े टिप आकार (~ 1 माइक्रोन) की वजह से, यह है, तथापि, अकशेरुकी तैयारियों ^28,32 में पाया जैसे ही जैसे एक बड़े सेल शरीर के साथ कोशिकाओं में संभव हो सकता है।

Materials

Abrasive	MicroPolish	Buehler GmbH	Dissolved in A.dest
Borosilicate-glass capillaries	1405059	Hilgenberg	Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the sensor of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the reference of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-200TF-15	Science Products	Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-120TF-10	Science Products	Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Electrometer amplifier with headstage		Custom-made	Rin = 10TΩ and Ibias=50fA-1pA (commercially available  alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)
Experimental chamber		Custom-made	Commercially available from e.g.  Warner Instruments,USA;  Scientifica, UK
Furnace		Heraeus	Must stay constant at 200°C
Hard sticky wax / dental wax	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Hot plate		Custom-made	Must stay constant at 40°C
Microelectrodes holder made of plexiglas		Custom-made	Double-barreled: o.d.  capillaries 1.5 mm, concentric: o.d.  capillaries 2 mm
Micromanipulator		Leitz
Micromanipulator	MD4R	Leica
Stereo microscope	M205C	Leica
Objective	Plan 0.8xLWD	Leica
Pipette puller	Model PP-830	Narishige	Concentric microelectrodes
Pipette puller	Model P-97	Sutter Instruments	Sensor of concentric microelectrodes
Pneumatic drug ejection system	Picospritzter Type II	General Valve TM Corporation
Travel dovetail stage	DT 25/M	Thorlabs
Two-component glue	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together
Silverwire	99.9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Axon Instruments
Vertical puller	Type PE-2	Narishige Scientific Instruments	With a revolvable chuck for  double-barreled microelectrodes
x/y translational stage		Custom-made
Name of Compound	Company	Catalog Number	Comments/Description
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide	Sigma aldrich	14343	Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma aldrich	440191	CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin
L-Aspartic acid	Sigma aldrich	A9256	Activates NMDA and non-NMDA and EAATs
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma aldrich	G1626	Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),  mGluRs and EAATs
Potassium ionophore I – cocktail B	Fluka	60403	Based on valinomycin; CAUTION toxic
Sodium ionophore II – cocktail A	Fluka	71178	Based on ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic
Water, ultra pure	Sigma aldrich	W3500