Microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires Ion dans le tissu cérébral

Protocol

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les directives institutionnelles de l'Université Heinrich Heine de Düsseldorf, en Allemagne, ainsi que la directive européenne Conseil de la Communauté (86/609 / CEE). Toutes les expériences ont été communiquées à et approuvées par le Bureau de la protection des animaux à l'établissement de soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Heinrich Heine de Düsseldorf, Allemagne (numéro de loi organique: O52 / 05). Conformément à la Loi sur la protection des animaux allemand (Tierschutzgesetz, les articles 4 et 7), aucune approbation formelle supplémentaire pour l'enlèvement post-mortem des tissus cérébraux était nécessaire.

1. Préparation de microélectrodes sélectives aux ions à double canon

1. Préparer deux capillaires en verre de borosilicate avec filament: une avec une longueur de 7,5 cm et un diamètre extérieur de 1,5 mm à utiliser pour le cylindre sensible aux ions, et l'autre avec une longueur de 6,5 cm et un diamètre extérieur de 1,0 mm pour la plus tard le baril de référence.
2. Nettoyez le Capil capil- dans de l'acétone pendant 12 heures puis rincer plusieurs fois avec abs. éthanol et les laisser sécher. Les électrodes peuvent à présent être stockées dans un dessicateur.
3. Utilisez de la colle à deux composants ou une petite bande de papier d'aluminium pour fixer une longue et une courte capillaire ensemble aux deux extrémités. Chauffer le double capillaire dans un four à 60 ° C pendant 1 heure. Ceci accélère le processus de durcissement. Stocker les électrodes maintenant dans un dessiccateur.
4. Centrer le double capillaire dans un extracteur vertical avec un mandrin revolvable. Chauffer doucement jusqu'à ce que la bobine le verre est suffisamment souple pour permettre une rotation horizontale du mandrin revolvable de 180 °. Au cours de cette étape, empêcher l'allongement du capillaire avec une cale sous le mandrin.
5. Après refroidissement, retirez la pause mécanique et appliquer une deuxième protocole de chauffage pour sortir le capillaire, résultant en deux, les capillaires à deux coups tranchants (Figure 1). Le diamètre d'un double embout capillaire devrait être proche de 1 um.

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Figure 1. L'architecture de microélectrodes sélectives d'ions. (A) Photographie d'une micro-électrode à double canon. Pour des fins d'illustration et une meilleure visibilité, le liquide à l'intérieur du baril de référence a été teinté. (B) Photographie d'un micro-électrodes concentriques et l'électrode de référence correspondante. La pointe de microélectrodes concentrique est représenté agrandi à sa gauche. En (A) et (B), l'espace occupé par le capteur d'ions sous les pointes des pipettes est post-coloré. Au fond, la disposition de ces deux types d'électrodes de pointe est schématisé. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

6. Si un extracteur vertical avec Chuck revolvable ne sont pas disponibles, préparer un ion-Selec à double canonmicroélectrode tive en utilisant un extracteur horizontal thêta verre.
   1. A cet effet, tirer thêta verre (diamètre extérieur de 1,5 mm, longueur 7,5 cm) à se traduire par deux électrodes avec chacune deux barillets. Mark l'un d'eux pour servir l'avenir baril de référence. Silanisée l'autre similaire à la procédure décrite ci-dessous à l'avenir servir de canon à ions sélectif.
      REMARQUE: Alors que la préparation d'électrodes à deux coups thêta-verre est beaucoup plus facile que la préparation d'électrodes à deux coups tordus, ils sont plus enclins à action croisée entre les deux barils que la paroi de verre de séparation mince entre eux tend à être poreuse leur possible pointe.
      NOTE: Parce que le cocktail du capteur (voir ci-dessous) est hydrophobe, la surface intérieure du corps sensible aux ions tard doit être rendue hydrophobe ainsi par un processus appelé silanisation. Pour cela, l'hexaméthyldisilazane (HMDS) est utilisé (figure 2) comme décrit dans l'étape suivante.

Figure 2. La silanisation de pipettes. (A) hexaméthyldisilazane (HMDS) réagit avec les groupes Si-OH de la surface de verre intérieure et la rend hydrophobe. (B) La photographie de gauche montre l'unité de silanisation entier. Une bouteille à large bouche contenant du HMDS est placé sur le dessus d'une plaque chauffante réglée à 40 ° C. Sur le dessus de la bouteille, un support (PH) portant les capillaires (CAP) est monté. La photo de droite montre un agrandissement de la porte-pipette (PH) portant les capillaires (CAP). (C) de vue de côté schématique des détenteurs de pipette sur mesure (PH) pour (à droite) capillaires à deux coups (à gauche) ou concentriques (PAC) monté sur une bouteille à large ouverture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

7. Juste avant PUélectrodes de remplissage, remplir env. 20 ml HMDS dans une bouteille à large ouverture. Attention: HMDS est pour une utilisation dans une hotte seulement, les vapeurs sont dangereux pour la santé! Fermez la bouteille et mettez-la sur une plaque chauffante, préréglé à 40 ° C. Préchauffer un four, placé sous le capot ainsi, jusqu'à 200 ° C.
8. Remplissez le baril de référence jusqu'à sa pointe avec de l'eau distillée pour empêcher son silanisation pendant la procédure suivante.
9. Mettez capillaire à double canon avec sa pointe vers le haut sur ​​un support spécial sur mesure (figure 2B, 2C). L'extrémité ouverte émoussée doit atteindre librement à travers le fond du support (figure 2C, à gauche). Ensuite, placez ce support sur la bouteille de bouche contenant les HMDS préchauffées pendant 70 minutes.
   REMARQUE: Assurez-vous que la vapeur HMDS peut circuler à travers les capillaires librement. Pendant une procédure de silanisation, les 20 ml d'HMDS ne pas évaporer complètement, et la bouteille peuvent ainsi être utilisés plusieurs fois.
10. Afterwards, transférer les capillaires à un support en métal et dans le four préchauffé pendant deux heures. Ce sera sécher deux barils.
11. Après silanisation, garder les capillaires sec jusqu'à utilisation. Alors que la première procédure nécessite environ 3,5 heures au total, des électrodes peuvent à présent être stockées dans un dessiccateur pendant plusieurs semaines.
12. Le jour de leur utilisation expérimentale, de préparer des électrodes sélectives d'ions en remplissant l'extrémité du tube silanisé avec 2.1 ul de la sonde à sélectivité ionique (figure 1A). Pour microélectrodes de potassium sensibles, utilisez le valinomycine porteur; et pour des microélectrodes sensibles au sodium, utiliser ETH 157 en tant que support.
13. Remarquez que le capteur d'ions sélective est assez visqueuse qui rend difficile pour le conseil pour remplir correctement.
14. Remplissez le baril de référence avec une solution saline tamponnée HEPES (voir ci-dessous).
    REMARQUE: Alors que d'autres de plus simple solution saline, iso-osmotique pourrait être utilisé ainsi, nous préférons utiliser une solution saline dont la composition est essentiellement similaire àla solution saline de perfusion (ACSF, voir 3.6.), car elle risque de fuir et pénétrer dans le tissu au cours des expériences. Par conséquent, il est également essentiel que cette solution saline ne contient pas une concentration plus élevée de l'ion à déterminer que l'ACSF utilisé.
15. Remblayer la sonde avec une solution saline qui contient une forte concentration de l'ion à détecter. Ainsi, remblayer le capteur avec 100 mM de NaCl solution saline (pour des microélectrodes sensibles au sodium) ou KCl (pour des microélectrodes de potassium sensible) 100. Veillez à ne pas insérer des bulles d'air supplémentaires au cours de cette procédure.
16. Si la silanisation a réussi et que le capteur est correctement remplie, observer la surface du capteur former une surface concave clairement visible contre le remblai (figure 1A). Sinon, le capteur peut avoir rétractée de la paroi des capillaires et la pointe ne sera pas remplie. Ces électrodes seront pas fonctionnelles.
17. Insérer les fils d'argent chlorés dans les deux barils (attention à ne pas toucher le senDORS) et sceller chaque baril avec de la cire dentaire (figure 1A).

2. Préparation de Concentric Ion sélectif Microélectrodes

1. Pour le cylindre externe, utiliser des capillaires en verre à paroi mince avec filament (diamètre extérieur 2,0 mm) et une longueur de 7,5 cm. Pour le tube intérieur, prendre des capillaires à paroi mince avec filament, un diamètre extérieur de 1,2 mm et une longueur de 10 cm.
2. Nettoyez les capillaires dans l'acétone pendant 12 heures. puis rincer plusieurs fois avec abs. éthanol et les laisser sécher. Les électrodes peuvent à présent être stockées dans un dessicateur.
3. Remplissez env. 20 ml HMDS dans une bouteille à large ouverture. ATTENTION! HMDS est pour une utilisation dans une hotte seulement, les vapeurs sont dangereux pour la santé. Fermez la bouteille et mettez-la sur une plaque chauffante, préréglé à 40 ° C. Préchauffer un four, placé sous le capot ainsi, jusqu'à 200 ° C.
4. Insérez le 2.0 mm capillaire dans un extracteur horizontale et tirez pour entraîner capillaires avec cierges courtes et un Diame de pointe~ ter de 4 pm (figure 1B).
5. Mettez débrochées 2,0 mm capillaire avec sa pointe vers le haut sur ​​une mesure, support spécial (figure 2B, figure 2C) de sorte que son extrémité émoussée ouvre à la cavité de la bouteille (figure 2C, à droite). Ensuite placer ce support sur la bouteille de bouche contenant les HMDS préchauffées pendant 70 minutes. Assurez-vous que la vapeur HMDS peut circuler à travers tous les capillaires.
6. Ensuite, transférer les capillaires à un support en métal et dans le four préchauffé pendant deux heures.
7. Après silanisation, garder les capillaires sec jusqu'à utilisation. Alors que la première procédure nécessite environ 3,5 heures au total, stocker maintenant les électrodes dans un dessiccateur pendant plusieurs semaines.
8. Juste avant l'utilisation, remplir une petite quantité de capteur (0,2 pi) dans le capillaire silanisé (figure 1B).
9. Pour préparer le capillaire intérieure, insérez un capillaire de petit diamètre dans l'extracteur et tirez pour aboutir à deuxcapillaires avec de longs cierges et bouts pointus (figure 1B). Remplir avec 100 mM de NaCl (Les microélectrodes sensibles au sodium) ou KCl 100 mM (microélectrodes de potassium sensible) une solution saline.
10. Placez le capteur rempli et le capillaire directement en ligne avec l'autre rempli de solution saline sur un bouchon de compilation personnalisé fabriqué à partir de lamelles. Introduisez le plus petit capillaire sur une courte distance dans la plus grande capillaire.
11. Fixer les capillaires sur une autre lamelle à l'aide de pâte à modeler, transférer à la scène d'un microscope et de visualiser en utilisant un grossissement de 100x. Avec l'aide d'une tige de verre qui est monté sur un micromanipulateur et en tournant la commande fine de la scène du microscope, avancer lentement le capillaire externe sur le capillaire intérieur jusqu'à ce que la distance entre leurs conseils est d'environ 5 um (figure 1B).
12. Fixer l'extrémité ouverte du capillaire extérieur sur le capillaire intérieure avec de la cire dentaire. Alternativement, appliquer une petite goutte de cyanoacrylate (Crazy Glue) insTEAD de cire.
    REMARQUE: Ajout d'une petite goutte d'eau va polymériser la colle et fixer les électrodes en place. Insérez un fil d'argent chloré dans le corps interne et le sceller avec de la cire dentaire (figure 1B).
13. Pour préparer l'électrode de référence, prendre un 7,5 cm de long capillaire avec filament et un diamètre extérieur de 1,5 mm et sortir avec un extracteur vertical. Veiller à ce que les conseils sont relativement longue mais pas trop forte (pointe de diamètre ~ 1 um).
14. Jeter la pipette supérieure, ouvrir le mandrin inférieur et soulevez la pipette inférieure d'environ 5 mm. Fermez le mandrin à nouveau et soulevez-le jusqu'à ce que la pointe de l'électrode inférieure est positionnée à environ 5 mm au-dessus de la bobine de chauffage. Chauffer la bobine et utiliser une pince pour plier la pointe d'environ 45 ° sur le côté. Basse pipette environ 1-2 mm. Bend à nouveau d'environ -45 ° à diriger la pointe de retour en parallèle à l'arbre principal (figure 1B). Cette procédure est nécessaire pour permettre le positionnement à proximité de la pointe de la procédure de référénce électrode concentrique à l'électrode.
15. Remplissez le baril de référence avec une solution saline tamponnée HEPES (voir ci-dessous), insérer un fil d'argent chloré et sceller le baril avec de la cire dentaire (figure 1B).

3. Salines

1. Préparer une solution saline pour le remblayage des électrodes de potassium sensible (voir 1.15.) Composée de 100 mM de KCl. Saline pour le remblayage des électrodes sensibles au sodium est composé de 100 mM de NaCl.
2. Préparer une solution saline pour le remblayage de barils de référence (. Une solution saline tamponnée par HEPES, voir 1,16) est composée de (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _de CaCl2, 2 MgSO _4, 1,25 NaH _{2 PO} 4, et 25 HEPES, titrée avec NaOH pour donner lieu à un pH de 7,4.
3. Préparer une solution saline pour l'étalonnage d'électrodes de potassium sensible sont composés de 25 mM de HEPES et un total de KCl et NaCl 150, pH ajusté à 7,4 avec NMDG-OH (N-méthyl-D-glucamine). Ici, l'étalonnage a été effectué avec salines contenant 1, 2, 4 ou 10 mMKCl; ACSF contenait 2,5 mM de KCl (Figure 5).
4. Préparer une solution saline pour l'étalonnage des électrodes de sodium sensibles comme suit; (en mm) 25 HEPES, KCl 3, un total de 160 NaCl et NMDG-Cl, pH ajusté à 7,4 avec NMDG-OH. Effectuer le calibrage avec une solution saline contenant (en mM) 70, 100, 130 ou 160 de NaCl; ACSF contenait NaCl 152 (figure 6).
5. Pour la détermination de contre-réaction de la sonde avec d'autres ions, par exemple., Le pH, la préparation salines d'étalonnage supplémentaires avec des concentrations d'ions fixes, mais pH variable.
   REMARQUE: Bien que cette procédure ne soit pas démontré dans la présente étude, s'il vous plaît doivent se référer à des travaux antérieurs aborder cette question (par exemple ^11,12).
6. Préparer des coupes de tissu cérébral aigu dans une solution saline composée de (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 _CaCl2, 6 _MgCl2, 1,25 NaH _{2 PO} 4, 26 NaHCO _3, et 20 le glucose, le barbotage avec 95% O ₂ et 5 _% de CO 2, conduisant à un pH de7.4.
7. Réaliser des expériences dans des tranches de cerveau dans le liquide artificiel céphalo-rachidien (ACSF), composée de (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _de CaCl2, 1 _MgCl2, 1,25 NaH _{2 PO} 4, 26 NaHCO _3, et 20 le glucose, le barbotage avec 95 % O ₂ et 5% de CO2, ce qui entraîne un pH de 7,4.
8. Pour la stimulation des neurones et les cellules gliales, préparer des solutions contenant 0,2, 0,3, 0,4 ou 0,5 glutamate ou 10 mm L-aspartate dissous dans l'ACSF. Pour l'application de la pression, dissoudre 10 mM glutamate dans une solution saline tamponnée HEPES.
9. Préparation de la demande pipette pour l'application de la pression. Insérez capillaires en verre à paroi mince avec des filaments (diamètre extérieur 2,0 mm) et une longueur de 7,5 cm dans extracteur horizontale et tirez pour aboutir à un diamètre de ~ 1 uM de pointe.
10. Pour l'induction de l'activité épileptique, préparer ACSF sans magnésium contenant 10 uM bicuculline méthiodure.
11. Pour empêcher la génération de potentiels d'action, préparer un 10 mM solution de la tétrodotoxine (TTX) dans l'eau distillée. Au cours des expériences, TTX est directement ajouté à l'ACSF à obtenir une concentration finale de 0,5 uM.
12. Pour empêcher l'activation des récepteurs AMPA, préparer une solution stock de 50 mM de cyano-nitroquinoxaline-dione (CNQX) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Au cours des expériences, cela est directement ajouté à l'ACSF à entraîner une concentration finale de 100 uM.
13. Pour bloquer l'activation des récepteurs NMDA, préparer une solution stock de 50 mM d'amino-phosphonopentanoate (APV) dans 70 mM NaHCO _3. Au cours des expériences, cela est directement ajouté à l'ACSF à entraîner une concentration finale de 100 uM.

4. L'étalonnage de microélectrodes ioniques sélectives

1. Calibrer microélectrode sélective d'ions directement avant et après chaque expérience.
2. Fixez électrodes pour micromanipulateurs et les insérer dans une chambre expérimentale ACSF perfusé, placé sous un microscope stéréo (Figure 3 g>, 4). Placer l'électrode de référence dans la chambre de précombustion (figure 4A, B). Allumez bain perfusion, veiller à ce que l'écoulement est d'environ 2 ml / min.

Figure 3. L'espace de travail expérimental. La plate-forme d'enregistrement se compose d'une table de vibration amortie portant le stade x / y-traductionnelle avec le bain expérimentale, les micromanipulateurs, et un stéréomicroscope avec une optique de haute qualité. Le microscope stéréo est également équipé d'une caméra CCD pour la documentation. En outre, un dispositif d'application de pression pour l'application de médicaments focal est utilisé. Les électrodes d'enregistrement sont couplés par l'intermédiaire de l'étage de tête à un amplificateur différentiel. Les données numérisées (A / D converter) sont enregistrées avec un ordinateur. La perfusion du bain est réalisé par une micro pompe péristaltique (non représentée).> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Allumez le convertisseur A / D, l'amplificateur différentiel, et l'ordinateur, et lancez le logiciel d'enregistrement (Figure 3, 4). Parce que la résistance des barils sensibles aux ions est très élevé (10-20 GQ; voir ci-dessous), utiliser un amplificateur électromètre spécial avec haute impédance d'entrée (R _{in =} 10 TΩ) et un faible courant de polarisation _(I bias = 50 FA - 1 pA).

Figure 4. électronique et la conception spatiale de l'expérimental mis en place. (A) Vue schématique de l'arrangement d'enregistrement. Les conseils d'un microélectrodes à deux coups (bleu) et une micro-électrode concentrique (rouge) sont disposés dans un bain expérimentale remplie de sérum physiologique. L'électrode de référence du bain est indiqué schématiquement. Le poten TiAl détectée par les canons à sélectivité ionique (V ₁₎ est composé de potentiel du champ électrique _(V ref) et le potentiel ionique _(ion V), tandis que les canons de référence _(V 2) uniquement détecter _V ref. Pour isoler _ion V, _V ref est soustraite de V ₁ par l'intermédiaire d'un amplificateur différentiel (DA). (B) Topographie de la phase expérimentale avec un micro-électrodes concentriques en place. Le centre de la scène expérimentale consiste du bain expérimentale contenant la préparation de tranche. À la masse du bain, l'électrode de bain de référence est immergé dans la pré-chambre qui abrite également l'entrée de la perfusion. La scène elle-même est mise à la terre par un connecteur de terre séparé. Le microélectrodes concentrique et son électrode de référence sont effectuées par les détenteurs de pipettes séparées conduites par micromanipulateurs. Microélectrodes et l'électrode de référence sont couplés par voie électronique à l'étage de l'amplificateur de tête.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

4. Connecter des fils d'argent chlorés aux entrées respectives de l'étage de l'amplificateur différentiel (figure 4) de la tête. Déterminer les résistances d'électrodes. Assurez-vous que la résistance du corps de référence est comprise entre 30 à 100 MQ et la résistance du corps sensible aux ions est compris entre 20/10 GQ.
5. Réglez signaux de tension à zéro et commencer l'enregistrement.
6. A noter que le potentiel détecté par les canons à ions sélectif _(V 1) est composé du champ électrique de potentiel (V _ref) et le potentiel d'ions (V _ion), tandis que les canons de référence _(V 2) ne détecte _V ref. Pour isoler _ion V, _V ref est soustraite de V ₁ par l'intermédiaire d'un amplificateur différentiel (DA) (figure 4A).
7. Après l'obtention d'une ligne de base stable,interrupteur pour salines d'étalonnage contenant des concentrations définies de l'ion à mesurer.
   NOTE: La figure 5A montre l'étalonnage d'un microélectrodes à double canon potassium sensible. Sur la figure 6A, le calibrage de à la fois un double canon ainsi que d'un ^Na + microélectrode -sensible concentrique est disponible. Bien que nous ne décrivons pas la procédure ici, noter que les interférences possibles avec d'autres ions doivent être testés avant d'utiliser un ionophore spécifique (voir aussi 3.4.).

Figure 5. L'étalonnage de microélectrodes à deux coups potassium sélectif. (A) Variation de la tension du cylindre de référence _(V ref) et du ^K + -potential (V _{K +),} en réponse à des changements dans le bain ^{concentration} de K + ( [K ^+] _b) comme indiqué. (B) Demi--logarithmic parcelle de [K ^+] _b par rapport V _{K +.} Un tracé linéaire des données révèle une pente d'environ 56 mV. À titre d'illustration, des traces ont été lissées avec un filtre Sawitzky-Golay (largeur 20). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

8. Déterminer la réponse en tension du canon à ions sélectif en réponse à une variation connue de la concentration en ions. Données de parcelle dans un seul logarithmique (figure 5b, 6b) et déterminer la pente. Un capteur idéal suit une relation décrite par l'équation de Nernst (voir par exemple ^13):

V: potentiel mesuré de l'électrode;
V _0: potentiel d'électrode standard, par exemple pour un AgCl-fil à une température de 298,15 K et à une pression partielle de 101,325 kPa (absolue)
T: température absolue en Kelvin (K)
z: charge de l'ion (+ 1 pour le potassium et le sodium)
F: constante de Faraday (96.500 coulombs)
c ': concentration en ions extracellulaire
c '': concentration en ions intracellulaires

Pour des raisons pratiques, et le logarithme naturel sont convertis à la pente de Nernst s qui est alors valable pour une température donnée et ion:

NOTE: Pour potassium et de sodium électrodes, une réponse de tension idéale du capteur présente ainsi une pente linéaire d'environ -58 mV à la température ambiante. Certains écart de ce qui peut être accepté (figure 5B, 6B). Il est essentiel, cependant, que les caractéristiques d'une électrode donnée de réponse ne changent pas de façon significative (de plus de 10%, voir ci-dessous) avant et après l'expérience.

Figure 6. Calibrage de microélectrodes de sodium-sélectif et la comparaison des deux coups avec des électrodes concentriques (A) Haut retrace:. Evolution de la tension des barils de référence (V _ref) d'une électrode à double canon (trace noire pointillée) et un électrode concentrique (trace de gris) en réponse aux variations de la concentration ^de Na + bain ([Na ^+] _b) comme indiqué. A noter que les réponses de tension des deux électrodes sont pratiquement identiques. Traces de fond: Les changements dans la tension de (V ₊₎ de _Na ^Na + d'une électrode à double canon (trace noire) et une électrode concentrique (trace grise) en réponse à des changements dans [Na ^+] _b. Parcelles demi-logarithmiques de la [Na ^+] _(b) B par rapport à la V _{Na +} des deux électrodes. Terrain linéaire des données révèlent une pente d'environ 48 mV pour les deux électrodes.(C) Réponse du V _{Na +} d'un double canon (trace noire) et une électrode concentrique (trace grise) à un changement rapide dans le [Na ^+] _b à partir de 152 à 70 mm. A noter que le temps de l'électrode concentrique de réponse est beaucoup plus rapide. À titre d'illustration, des traces ont été lissées avec un filtre Sawitzky-Golay (largeur 20). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

9. Déterminer le temps de réponse des électrodes, qui dépend du diamètre de la pointe, la forme de la pointe, ainsi que sur l'épaisseur de la phase de détection de la pointe de l'électrode.
   REMARQUE: microélectrodes sensibles au sodium Dans ce dispositif expérimental mis en place et en employant un changement rapide entre les différents salines de perfusion (échange terminé à la pointe de l'électrode à l'intérieur de 500 msec), deux coups ont atteint un potentiel stable au sein de 9.7 ± 4.5 sec quandde commutation de 152 mM 70 mM de ^[Na +] (n = 6). Dans le même cadre, concentriques microélectrodes sensibles au sodium atteint un potentiel stable dans seulement 0,8 ± 0,3 s (n = 6) (Figure 6C). Cela souligne la résolution temporelle supérieure de concentrique par rapport à microélectrodes à deux coups.

5. Dissection de tissus

1. Pour la génération des tranches aiguës, anesthésier les souris de jours postnatales 16-20 _avec le CO 2 et rapidement décapité (suite à la recommandation de la Commission européenne publiée en: l'euthanasie des animaux de laboratoire, Luxembourg: Office des publications officielles des Communautés européennes, 1997; ISBN 92-827-9694-9).
2. Préparer des tranches de tissu de l'hippocampe (épaisseur 250 um), à la suite d'une procédure standard (voir par exemple ^14).

6. Les procédures expérimentales

1. Transférer une tranche dans la chambre expérimentale et le fixer avec unegrille.
2. Abaisser la microélectrode sélective d'ions calibré sur la surface de la tranche et empaler stratum radiatum de la région CA1 à une profondeur d'environ 50 um à l'électrode.
   REMARQUE: Toucher la surface de la tranche avec l'microélectrodes entraîne des fluctuations caractéristiques dans le canon sensible aux ions. En outre, des dommages aux cellules pendant empalement du tissu entraîne des fluctuations ainsi. Attendez jusqu'à ce que la ligne de base est stabilisé.
3. Pour l'application de la pression d'agonistes de l'émetteur, de remplir une pipette d'application avec le composé (par exemple le glutamate de 0,5 mm). Attacher la pipette à un micromanipulateur et le coupler à un dispositif d'application de pression.
4. Pipette inférieure de l'application dans le tissu et placez-le soigneusement à proximité de la pointe de la microélectrode sélective d'ions (~ 20-40 um). Démarrer l'application de la pression (par exemple de 10 sec, 40 mbar) et des variations de tension de fiche comme contrôlé par le micro-électrode à sélectivité ionique.
5. Pour l'application de bain de médicaments, SWdémangeaisons entre les différents salines de perfusion pour une durée définie.
6. Pour mettre fin à l'expérience, retirez soigneusement la microélectrode sélective d'ions à partir du tissu et d'enregistrer toute dérive dans les potentiels de la valeur originale de zéro qui pourrait s'être produite pendant les périodes d'enregistrement prolongées.
7. Retirer préparation de tranches du bain et effectuer un deuxième étalonnage de la microélectrode à sélectivité ionique.
   NOTE: Cela est nécessaire parce que la pointe de l'électrode peut se boucher pendant son mouvement à travers le tissu. Ainsi, il est essentiel de veiller à ce que l'électrode répond toujours correctement à des changements dans les concentrations d'ions. Des expériences devraient être rejetées si la réponse de l'électrode à un changement de dix fois de la concentration d'ions a diminué de plus de 10%. Bien-électrodes de travail peuvent en principe être réutilisés dans plusieurs expériences. Cela est particulièrement vrai pour les électrodes concentriques, qui peut même durer plusieurs jours. Il est essentiel, cependant, que les procédures d'étalonnage sont retourbé avant et après chaque expérience unique pour assurer le bon fonctionnement des électrodes.

Analyse des données 7.

1. Pour convertir la réponse en tension de l'électrode sélective d'ions à des changements dans la concentration en ions extracellulaire, première convertir équation 2 pour déterminer la variation de _l'ion AV potentiel (mV) de la manière suivante (montré ici pour K ⁺ Les électrodes -sensibles, procédure analogique applique pour ^Na + électrodes -sensibles):

V _{K +:} changements dans le potentiel du cylindre de la valinomycine (mV)

s: pente de Nernst

K ^+] _B: concentration de base de potassium (dans notre cas, 2,5 mM K ⁺⁾

K ^+] _o: changements dans [K ^+] _o cours de l'expérience

2. Calculer la moyenne arithmétique des pistes provenant des parcelles logarithmiques simples of le calibrage avant et après l'expérience (cf. figure 5b, 6b; voir point 4.8) pour récupérer "s".
3. Pour calculer les changements de la [K ^+] _o (Δ [K ^+] _o, en mM), réorganiser l'équation 3 à:

Representative Results

Pour surveiller [K ^+] _o et les changements qui y sont en réponse à l'activité excitatrice, une microélectrode double canon potassium sélective a été inséré dans le stratum radiatum de la zone CA1. Quelques minutes après empalement, le canon à ions sélectif de l'électrode atteint une ligne de base stable (figure 7A), ce qui correspond à un [K ^+] _o d'environ 2,8 mM, une valeur proche de la [K ^+] de l'ACSF utilisé ( 2,5 mM). L'application du bain de 0,5 mM de glutamate pendant 10 s induit une augmentation réversible de [K ^+] _o d'environ 4 mM, suivi d'un sous-dépassement en dessous de la ligne de base d'un montant de 0,7 mM ~ (figure 7A). L'abaissement de la concentration de glutamate à 0,4, 0,3, et 0,2 mM a provoqué une réduction correspondante de l'amplitude à la fois de l'augmentation transitoire et le sous-dépassement en [K ^+] _o (figure 7A).

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Figure 7. transitoires de potassium extracellulaires en réponse à l'activité excitatrice. (A) [K ^+] _o transitoires, constitué par une augmentation suivie d'un sous-dépassement en dessous de la ligne de base, induite par l'application du bain de différentes concentrations de glutamate pendant 10 secondes comme indiqué. (B) Influence d'une perfusion avec des bloqueurs de récepteurs de glutamate (CNQX, 100 uM; APV, 100 pM) et la tétrodotoxine (TTX; 0,5 uM) de [K ^+] _o transitoires induits par l'application du bain de 0,5 mM de glutamate pendant 10 s. (C) spontanée [K ^+] _o transitoires en présence de 0mg ²⁺ / BIC. Les expériences présentées dans AC ont été effectuées en utilisant des électrodes à double canon. À titre d'illustration, des traces ont été lissées avec un filtre Sawitzky-Golay (largeur 20). S'il vous plaît clabeurk ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Des expériences antérieures ont montré que ces [K ^+] _o signaux induite par le glutamate sont pas significativement modifiés lors de l'application de TTX, et sont donc largement indépendante sur l'ouverture des canaux sodiques voltage-dépendants et de l'action neuronale potentiel de production de ^15,16. Pour étudier les mécanismes sous-jacents les observées [K ^+] _o changements en réponse au glutamate, nous avons appliqué les bloqueurs des récepteurs de glutamate, à savoir CNQX (100 M; bloqueur des récepteurs AMPA) et APV (100 M; bloqueur des récepteurs NMDA), en présence de TTX (0,5 uM). Après perfusion de salle de bain avec ces bloqueurs, induite par le glutamate [K ^+] _o changements étaient pratiquement aboli, confirmant leur dépendance à l'ouverture de canaux de ionotropes récepteurs du glutamate tel que rapporté avant (par exemple ^17; figure 7B).

Pour démontrer davantage tIl pertinence de glutamatergique excitation pour la génération de extracellulaire [K ^+] signaux, les tranches ont été perfusés avec nominalement ^Mg 2+ solution saline exempt contenant 10 uM bicuculline méthiodure (0mg ²⁺ / BIC). Cela soulage tension dépendant ^de Mg2 + -bloc des récepteurs de NMDA et atténue l'inhibition par blocage des récepteurs _GABA A, ce qui provoque l'activité épileptiforme spontanée récurrent dans le réseau (par exemple ^18,19). Comme prévu ^20, spontanée, récurrente [K ^+] _o transitoires, un montant d'environ 1,5 mM ont été détectés dans 0mg ²⁺ / BIC solution saline (figure 7C). Entre ces réponses, plus petite [K ^+] _o transitoires avec une amplitude moyenne d'environ 0,2 mM a eu lieu (Figure 7C).

Dans une deuxième série d'expériences, nous avons utilisé [Na ^+] microélectrodes -sensibles pour déterminer [Na ^+] _o changements évoqués par application deagonistes du glutamate. Ici, nous avons également comparé les caractéristiques des microélectrodes à double canon et concentriques employant deux paradigmes d'application différents réponse. [Na ^+] des microélectrodes -sensibles été positionné dans le stratum radiatum à une profondeur d'environ 50 uM. Après une ligne de base stable a été atteint, le glutamate agoniste de L-aspartate a été appliqué par perfusion de bain (à 10 mM, 120 secondes, le bain perfusion à raison de 2,5 ml / min). Comme observé précédemment ^21, l'application de l'aspartate a provoqué une diminution lente dans [Na ^+] _o d'environ 15 mm, qui a duré environ 5 min, puis a commencé à recouvrer à la ligne de base (figure 8A). Notamment, tandis que les amplitudes des pics et cinétique des [Na ^+] _o signaux déterminés par les deux électrodes étaient pratiquement identiques dans ces conditions, électrodes concentriques présentaient une base plus stable et un niveau de bruit inférieur (figure 8A).

Pour tester la r EPONSE caractéristiques des différentes électrodes dans un paradigme d'application plus rapide, nous glutamate pression appliquée à travers une pipette en verre bien positionné dans le stratum radiatum à une distance de 20-40 um de la pointe de la microélectrode sélective d'ions. ²¹ Comme on s'y attendait, l'application de glutamate (10 mM) pendant 200 ms a provoqué une baisse de la _o (figure 8B) [Na ^+]. Les amplitudes de pointe de la [Na ^+] _o diminution étaient dans la même gamme pour les deux types d'électrodes (deux coups: de 4,5 à 13,5 mM, n = 14; concentriques: de 2,0 à 19,1 mM, n = 15). Cependant, contrairement aux résultats obtenus avec une lente perfusion de bain (voir ci-dessus), non seulement le rapport signal à bruit, mais également au cours du temps de la [Na ^+] _o signaux détectés par les deux types d'électrodes diffère de manière significative. Le délai moyen de pic était de 3,5 sec pour le double-canon et seulement 1,3 s pour les microélectrodes concentriques.

homologues ve_content "> Ainsi, ces résultats démontrent et confirment la cinétique de réponse plus rapides de Na ⁺ microélectrodes sélectifs deux coups concentriques contre, (cf. Figure 6C et 8B), a également été noté que pour le Ca ^{2+ et} pH-sélectifs ¹⁰ . Contrairement à la première étude, dans laquelle la stimulation synaptique à court éclater a été réalisée pour évoquer transitoires d'ions rapides synaptiquement-induites, il y avait seulement une tendance, mais aucune différence significative dans amplitudes maximales moyennes entre électrodes concentriques et deux coups avec notre application paradigme. Cela est probablement dû au fait que la distance de la pipette d'application de la pointe de la microélectrode sélective d'ions varie d'un facteur de deux (20 à 40 um) et, par conséquent, que la concentration de glutamate maximale à la région cible était pas le même dans les différentes expériences, obstruant toute différence existante dans amplitudes de pointe.

(A) Haut retrace: Variation de la Voltage des barils de référence (V _ref) d'une électrode à double canon (trace noire pointillée) et une électrode concentrique (trace grise) en réponse à des changements dans le bain Na ⁺ concentration ([Na ^+] _b) comme indiqué. A noter que les réponses de tension des deux électrodes sont pratiquement identiques. Traces de fond: Les changements dans la tension de (V ₊₎ de _Na ^Na + d'une électrode à double canon (trace noire) et une électrode concentrique (trace grise) en réponse à des changements dans [Na ^+] _b. Parcelles demi-logarithmiques de la [Na ^+] _(b) B par rapport à la V _{Na +} des deux électrodes. Terrain linéaire des données révèlent une pente d'environ 48 mV pour les deux électrodes. (C) Réponse du V _{Na +} d'un double canon (trace noire) et une électrode concentrique (trace grise) à un changement rapide dans le [Na ^+] _b à partir de 152 à 70 mm. A noter que le temps de l'électrode concentrique de réponse est considérablement faster. À titre d'illustration, des traces ont été lissées avec un filtre Sawitzky-Golay (largeur 20).

Figure 8: transitoires de sodium extracellulaires telles que détectées par des électrodes à double canon et concentriques.
(A) des changements transitoires de _V ref et [Na ^+] _o induite par la perfusion de bain avec 10 aspartate mM pendant 120 secondes, comme indiqué par la barre. Les tracés supérieurs montrent un enregistrement effectué avec une électrode à double canon, les traces faibles ont été enregistrés en utilisant une électrode concentrique. (B) Les variations transitoires dans V _{ref et} [Na ^+] _o induite par l'application de la pression locale avec 10 mM de glutamate pour 0.2 sec comme indiqué par la flèche. Les tracés supérieurs montrent un enregistrement effectué avec une électrode à double canon, les traces faibles ont été enregistrés en utilisant une électrode concentrique.Pointillés rouges représentent ajustements linéaires de la période entre le début du signal à son maximum. A noter que le temps de l'électrode concentrique de réponse est nettement plus rapide dans ces conditions. À titre d'illustration, des traces ont été lissées avec un filtre Sawitzky-Golay (largeur 20). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

À base de liquide transporteur, électrodes sélectives d'ions ont été utilisés avec succès depuis des décennies et pour de nombreux ions, des capteurs très spécifiques sont disponibles ^22-26. Lorsqu'il est utilisé dans l'espace extracellulaire (ECS) des préparations de cerveau des vertébrés, il faut cependant garder à l'esprit, que ce soit une technique très invasive: tandis que la largeur de l'ECS est seulement autour de 20-50 nm, le diamètre de l'ion-sélective microélectrodes est d'environ 1 pm (électrodes à deux coups) ou plus (électrodes concentriques). Les conseils de microélectrodes sélectives d'ions seront donc non seulement endommager les tissus pendant leur empalement du tissu, mais aussi agrandir l'ECS, favorisant une sous-estimation des transitoires d'ions. Malgré ces écueils, les transitoires d'ions extracellulaires en réponse à l'activité neuronale sont remarquablement cohérents entre les différents laboratoires ^7,8, attestant de la fiabilité de cette méthode.

La performance et la pertinence des électrodes sélectives d'ionsest fonction de leur sensibilité et de sélectivité, qui est défini par le cocktail de capteur ('ionophore à membrane liquide ") utilisé. Cocktails de capteurs contiennent une molécule porteuse spéciale, par exemple valinomycine K ⁺ microélectrodes sélectifs qui présente une haute sélectivité pour le potassium ^27. Nonobstant, la réactivité croisée avec d'autres ions peut se produire et doit être testé. Valinomycine présente une réactivité croisée significative pour l'ammonium, qui doit être considéré lors de l'interprétation des résultats (par exemple ^11,12). En outre, parce que la tension de réponse des ionophores en résulte un comportement de Nernst (cf. équation 1), le rapport signal sur bruit et seuil de détection dépend de la concentration de l'ion à mesurer. Ainsi, tandis que les petites [K ^+] _o transitoires évoquer de grandes variations de tension contre le faible niveau de référence [K ^+] _o, petite [Na ^+] _o transitoires sont beaucoup plus difficiles à détecter contre le salutgh référence [Na ^+] _o (cf. Figure 5 et 6).

La performance des électrodes sélectives d'ions est également déterminée par la résolution temporelle, qui est largement régi par la constante de temps électrique. Celle-ci est principalement déterminée par la résistance axiale du capteur, et par la capacité répartie le long de la longueur de la pipette, entre ses solutions interne et le fluide externe. Dans la configuration à deux coups, la résistance est élevée, en raison de la longue colonne de capteur d'ions remblayée. Pour un diélectrique isolante suivant (dans ce cas verre borosilicate), la capacité est régie par l'épaisseur diélectrique. Dans électrodes à deux coups, la largeur diélectrique revient à la paroi de verre de la pipette. Comme le verre amincit près de la pointe, la largeur diélectrique tombe, et la capacité augmente. Ces facteurs se combinent pour produire des électrodes avec des temps de réponse qui vont de plusieurs centaines de millisecondes à plusieurssecondes, que ces facteurs sont variés.

Un avantage majeur de la conception concentrique est que la résistance axiale et à la capacité du bain sont grandement diminuées. Les pipettes shunts concentriques plupart de la résistance de l'échangeur d'ions remblayé, laissant seulement un vestige dans les dernières micromètres avant la pointe. En outre, la solution de remplissage à l'intérieur de la pipette concentrique est physiquement éloignée de la baignoire, séparés par l'épaisseur de deux parois de verre, ce qui réduit considérablement la capacité. ¹⁰ Comme indiqué précédemment, l'effet combiné de la résistance et de la capacité réduite est une amélioration de la résolution temporelle de deux ordres de grandeur. Dans le cas de concentriques ^Ca2 + et de pH microélectrodes, les temps de réponse de 90% étaient aussi bas que 10-20 ms ^10. Un avantage connexe de la conception concentrique est le faible niveau de bruit (cf. Figure 8). En raison de la résistance considérablement réduit, les transitoires de tension de toute Ambient bruit sont minimisés. En outre, la récupération de ces transitoires est rapide, en raison de la constante de temps rapide. Ces artefacts sont donc petit et rapide, et ont un effet moins perturbateur sur les enregistrements physiologiques (cf. Figure 8).

Il ya aussi des inconvénients de la technique concentrique. Tout d'abord, leur assemblage est plus complexe et prend du temps. Un deuxième inconvénient est la nécessité de placer un micro-électrode de référence séparée avec sa pointe, entraînant l'utilisation soit d'un micromanipulateur séparé ou un double manipulateur spécialisé. Enfin, deux coups microélectrodes peuvent être étendus à une conception triple canon, ce qui permet la détection de deux espèces différentes d'ions en même temps ^28, ce qui est impossible pour des électrodes concentriques.

Pièges les plus courants

Silanisation inefficace.

L'étape la plus importante, et principal obstacle dans la fabrication de tout liquide-sensou microélectrode sélective d'ions à base de la procédure de silanisation. Lorsque les électrodes ne parviennent pas à répondre aux changements dans la concentration d'ions spécifiques, ou de répondre avec une réponse sous-nernstienne (bien au moins de 58 mV par différence de concentration dix fois), une mauvaise efficacité de silanisation est généralement la cause. Dans notre expérience, cela peut se produire si l'humidité atmosphérique est trop élevée ou trop faible, typique des conditions à la hauteur de l'été, ou en hiver, respectivement. Si il est possible d'exercer un certain contrôle sur l'humidité ambiante, ces problèmes peuvent être surmontés.

Résistance d'électrode est trop élevée.

Si nécessaire, la résistance du corps sensible aux ions peut être réduite par chanfreinage. À cette fin, exposer sa pointe à un puissant jet d'un abrasif en suspension dans l'eau pendant quelques secondes. Cela entraînera sa pointe de upmost à casser et à réduire la résistance à la valeur souhaitée.

Ponts sel.

Seldes ponts entre les barils d'ions et de référence entraînent électrodes mal ou aucun-réponse et peuvent donc aussi confondre grandement leur performance dans l'étalonnage. Comme mentionné ci-dessus (voir point 1.6.), Cela est principalement un problème lorsque deux coups de verre thêta est choisi, mais est un événement rare lorsque vous utilisez le, la technique du canon tordu décalage décrit ici.

Avec la facilité de fabrication à l'esprit, la conception à double canon original de Lux ²⁹ peut souvent être utilisé avec profit. Cette méthode utilise pré-remplissage des ions et de référence de barils avec des solutions salines, une exposition rapide à une solution de silane par son aspiration et l'expulsion de la pointe, à la suite par incorporation de l'échangeur d'ions, également par la pointe (voir ^30,31) . Ces électrodes peuvent être fabriquées dans environ 10 min, mais leur taille de la pointe est généralement 4 pm ou plus et ils sont plus enclins à l'échec lors d'une expérience. En revanche, les méthodes de silanisation qui impliquent l'exposition aux vapeurs de silane et de la chaleurING peut produire des électrodes avec de petits conseils qui derniers jours et parfois des semaines.

Pris dans leur ensemble, il existe plusieurs protocoles et des approches sur la façon de préparer des microélectrodes sélectives d'ions. Ici, nous avons décrit deux procédures principales pour la fabrication de microélectrodes à deux coups ainsi que concentriques torsadés qui fonctionnent bien et de manière fiable dans nos laboratoires, avec un taux de réussite global de près de 100%. Fait important, ces techniques pourront être transférés à la mesure d'autres espèces, y compris les ions calcium ou le pH, et sera également applicable à d'autres préparations que le cerveau, y compris des cavités ou des liquides remplis de liquide en général. Dernier point, mais non le moindre, microélectrodes sélectives d'ions permettent de déterminer les concentrations d'ions à l'intérieur des cellules. En raison de leur taille relativement grande de pointe (~ 1 pm), cette volonté, toutefois, être possible que dans les cellules avec un corps à grandes cellules, par exemple, comme on en trouve dans les préparations invertébrés ^28,32.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abrasive	MicroPolish	Buehler GmbH	Dissolved in A.dest
Borosilicate-glass capillaries	1405059	Hilgenberg	Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the sensor of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the reference of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-200TF-15	Science Products	Concentric, outer channel. O.D. 2.0 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-120TF-10	Science Products	Concentric, inner channel. O.D. 1.2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Electrometer amplifier with headstage		Custom-made	Rin = 10 TΩ and Ibias=50 fA-1pA (commercially available  alternatives: e.g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)
Experimental chamber		Custom-made	Commercially available from e.g.   Warner Instruments,USA;  Scientifica, UK
Furnace		Heraeus	Must stay constant at 200 °C
Hard sticky wax / dental wax	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Hot plate		Custom-made	Must stay constant at 40 °C
Microelectrodes holder made of plexiglas		Custom-made	Double-barreled: O.D.  capillaries 1.5 mm, concentric: O.D.  capillaries 2 mm
Micromanipulator		Leitz
Micromanipulator	MD4R	Leica
Stereo microscope	M205C	Leica
Objective	Plan 0.8xLWD	Leica
Pipette puller	Model PP-830	Narishige	Concentric microelectrodes
Pipette puller	Model P-97	Sutter Instruments	Sensor of concentric microelectrodes
Pneumatic drug ejection system	Picospritzter Type II	General Valve TM Corporation
Travel dovetail stage	DT 25/M	Thorlabs
Two-component glue	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together
Silverwire	99.9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Axon Instruments
Vertical puller	Type PE-2	Narishige Scientific Instruments	With a revolvable chuck for  double-barreled microelectrodes
x/y translational stage		Custom-made
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide	Sigma aldrich	14343	Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma aldrich	440191	CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin
L-Aspartic acid	Sigma aldrich	A9256	Activates NMDA and non-NMDA and EAATs
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma aldrich	G1626	Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),  mGluRs and EAATs
Potassium ionophore I - cocktail B	Fluka	60403	Based on valinomycin; CAUTION toxic
Sodium ionophore II - cocktail A	Fluka	71178	Based on ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic
Water, ultra pure	Sigma aldrich	W3500