Summary

שיטה של ​​לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות

Published: September 19, 2015
doi:

Summary

מחקרים בהתפתחות חיך מונעים על ידי את השכיחות של חיך שסוע, מומים מולדים שמטיל נטל בריאותי עצום ויכולים להשאיר נמשך השחתה. אנו מדגימים כאן טכניקה למדפי חך התרבות שיכול לשמש כדי לחקור מסלולי איתות שונים מעורבים בפיתוח חיך והיתוך.

Abstract

שפה שסועה היא בין הנפוצים ביותר של כל המומים המולדים. הצורות המשניות החיך ממדפי mesenchymal מכוסה באפיתל ששומרות על צורת תפר אפיתל קו האמצע (MES). התיאוריות מציעות כי תאי MES מעקב אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), אפופטוזיס והגירה, מה שהופך את החיך התמזגו 1. התפוררות מוחלטת של MES היא השלב החיוני הסופי של מפגש חיך עם סובבי תאי mesenchymal. אנו מספקים שיטה לתרבות איבר החיך. פיתחו בפרוטוקול מבחנה מאפשר הלימוד של התהליכים הביולוגיים ומולקולריים במהלך היתוך. היישומים של טכניקה זו הם רבים, ובכלל זה תגובות הערכה לחומרים כימיים אקסוגני, השפעות של גורמים רגולטוריים וצמיחה וחלבונים ספציפיים. יש תרבות איבר חיך מספר היתרונות הכוללים מניפולציה בשלבים שונים של פיתוח, שאינו אפשרי באמצעות במחקרי vivo.

Introduction

בתרי Orofacial הם המומים המולדים craniofacial הדומיננטיים ביותר. כמו כן, לוקח בחשבון את כל פגמי craniofacial האפשריים, אלה הם האנומליה הלידה השנייה בשכיחותו בתינוקות 2. חיך שסוע להתרחש בכ -1 מכל 700 לידות בארצות הברית (ארה"ב) בכל שנה, את השכיחות של חיך שסוע היא שווה 475 ילדים שנולדו עם חיך שסוע לחודש או 15 ילדים עם שסעים ליום 3. כ -1% מילדים שנולדו ברחבי העולם כל שנה תערוכת צורה כלשהי של dysmorphology craniofacial.

בתרי החיך והשפה צריכים הליך מאוד יקר ומסובך עם השלכות לכל החיים לחולים שיש להם את האנומליה הזו. העלות המשוערת לכל מטופל עם שסוע פה היא כ -100,000 $ 4. הטיפול בחולה עם שפה שסועה דורשת צוות של רופאים, כולל רופאים, מומחי אוזן וגרון, גנטיקאים, מרדימים craniofacial,דיבור בשפת פתולוגים, תזונאים, orthodontists, prosthodontists, פסיכולוגים, נוירוכירורגים, ורופאי עיניים.

בpalatogenesis, החך המשני נשאלת צמחים לזווג, אשר בתחילה לגדול בצורה אנכית ולעבור גובה מדף חיך מעל dorsum של הלשון. בעקבות העלאה, מדפי החך לזווג לגדול לכיוון קו האמצע (בE14.5 -E15 בעכברים ובשבוע 9 בבני אדם). אפיתל המדיאלי הקצה (MEE) המכסה את קצה המדף שומר יוצר תפר אפיתל קו האמצע.

זה ואחריו אפיתל מעבר mesenchymal ו / או אפופטוזיס לאפשר מפגש mesenchymal. הידבקות של MEE המנוגדים היא אירוע חיוני שינוי שגורם לחיך שסוע. עם זאת, רק מעט מחקרים בחנו את ההידבקות הראשונית של מדפי חך 5. צורות החיך קשות על ידי התמיינות של תאי mesenchymal לתא עצם. ההתפתחות לא תקינה של החיך יכול לייצר מפתחלא חיך עם או בלי מעורבות של השפה.

טכניקות תרבות איבר החיך היו בשימוש נרחב למעבדות רבות במהלך 30 השנים האחרונות 6,7.

בפרוטוקול זה אנו מתארים בפרטי שיטה של ​​נתיחת חיך ותרבות איבר סטטי. היתרון של תרבות איבר חסרת תנועה הוא שהיא מאפשרת מדפי חך הפתיל. טכניקה זו הייתה בשימוש בהצלחה במעבדה שלנו לניסויי היתוך ואיתות רבים 8,9. עם זאת ההיקף של הטכניקה הוא עצום וניתן להשתמש בו בכל פעם שנדרשה מערכת תרבות איבר סטטי, כולל ההערכה של תגובות לחומרים כימיים אקסוגני, את ההשפעות של גורמי גדילת רגולציה במסלולים שונים וחלבונים ספציפיים.

איור 1
ele סריקת איור 1. העכבר Palatogenesis. שלבי התפתחות של חיך העכברים. (BF)micrographs ctron (SEM) של החיך המשני בזמנים התפתחותי נציג. חיצים אדומים: להראות את החלק הראשוני של הידבקות חיך והיתוך. צהובים חצים: נקודה למרחב שבין החיך הראשי והמשני שייעלם לאחר ההיתוך (נדפס מ -11 קאופמן באישור PLoS ONE).

Protocol

כל ההליכים המתוארים חייבים להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בבעלי חיים בעלי חוליות, כוללים אישור מראש על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש המקומית. 1. הכנת מכשירי הביתור ותרבות מדיה <li style=";text-al…

Representative Results

הטכניקה יכולה להיות מיושמת על סוגים שונים של המחקר הבא experiments.The שונים נועד לבחון את ההשפעה של ניקוטין טרטוגניות במבחנה על היתוך חיך. שני זנים של עכברים שמשו לניסוי זה, CD1 ורקמת C57.Palatal טופל ב0.06 ו -6 מ"מ ריכוזים של hemisulfate ניקוטין. היה נראה כי דפוסי היתוך חיך ועית?…

Discussion

הפרוטוקול במאמר זה מספק שיטה של ​​לנתח מדפי חך מעוברים ביום עוברי 13.5. מדפי חך מעוברי עכברים היו בתרבית בתקשורת ותרבות סרום ללא באווירה של 95% O CO 2 5% 2 על 37 מעלות צלזיוס. נתיחת חיך מוצלחת תלויה באופן קריטי על גורמים רבים בכל שלב במהלך ההליך מרגע העוברי של העכב…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors do not have any acknowledgements.

Materials


 

BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100x15mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60×15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
Co2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

References

  1. Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
  2. Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
  3. Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
  4. 4miloro, . principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
  5. Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
  6. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
  7. Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
  8. San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
  9. Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
  10. RD, L. . Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).
  11. Kaufman, M. H. . The Atlas of Mouse Development. , (1992).
  12. Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

View Video