Undersøgelser af ganen udvikling er motiveret af forekomsten af ganespalte, en misdannelse, der pålægger en enorm sundhed byrde og kan forlade varig vansiring. Vi demonstrerer her en teknik til kultur palatinalt hylder, som kan bruges til at studere forskellige signalveje der er involveret i udvikling og palatal fusion.
Læbe-ganespalte er blandt de mest almindelige af alle fosterskader. De sekundære ganen formularer fra mesenkymale hylder dækket med epitel, der klæber til at danne midterlinjen epitelial sømmen (MES). Teorierne tyder på, at MES celler følge en epitelial til mesenkymale overgang (EMT), apoptose og migration, hvilket gør en sammensmeltet ganen 1. Fuldstændig opløsning af MES er den sidste væsentlige fase af palatal sammenløb med omgivende mesenkymale celler. Vi tilvejebringe en fremgangsmåde til ganen organkultur. Den udviklede in vitro protokol tillader undersøgelse af de biologiske og molekylære processer i fusion. Anvendelserne af denne teknik er talrige, herunder evaluere svar på exogene, kemiske stoffer, virkningerne af regulerings- og vækstfaktorer og specifikke proteiner. Palatal organkultur har en række fordele, herunder manipulation på forskellige udviklingsstadier dette ikke er muligt ved hjælp af in vivo-undersøgelser.
Orofaciale kløfter er de mest fremherskende kraniofaciale fosterskader. Også, idet der i hensyn til alle mulige kraniofaciale defekter, disse er den næsthyppigste fødsel anomali hos nyfødte 2. Kløft ganer forekomme på cirka 1 ud af hver 700 fødsler i USA (US) hvert år, forekomsten af ganespalte er lig med 475 børn født med kløvede ganer om måneden eller 15 børn med kløfter per dag 3. Ca. 1% af børn født rundt om i verden hvert år udviser en form for kraniofacial dysmorfologi.
Kløfter af ganen og læben har brug for et meget dyrt og kompliceret procedure med livslang konsekvenser for patienter, der har denne anomali. De anslåede omkostninger for hver patient med oral kløft er ca $ 100,000 4. Behandlingen af en patient med læbe-ganespalte kræver et team af læger, herunder kraniofaciale kirurger, otolaryngologists, genetikere, narkoselæger,tale-sprog patologer, ernæringseksperter, odontologer, prosthodontists, psykologer, neurokirurger og øjenlæger.
I palatogenesis, opstår den sekundære ganen som parrede udvækster, der oprindeligt vokser lodret og undergår palatal hylde højde over tungens dorsum. Efter elevation, de parrede palatinalt hylderne vokser mod midterlinjen (ved E14.5 -E15 i mus og uge 9 i mennesker). Den mediale kant epitel (MEE), som dækker hylden spids klæber danner midterlinjen epithelial søm.
Dette efterfølges af epitelial til mesenkymale overgang og / eller apoptose at tillade mesenchymale konfluens. Vedhæftning af modsatrettede MEE er en vigtig begivenhed, hvis ændring forårsager ganespalte. Men kun få studier undersøgt den indledende vedhæftning af palatinalt hylder 5. Den hårde gane former af differentiering af mesenchymale celler i osteoblast. Den unormal udvikling af ganen kan producere nøglet ganer med eller uden inddragelse af læben.
Ganen orgel kultur teknikker havde været anvendt bredt til mange laboratorier i de seneste 30 år 6,7.
I denne protokol vi beskriver i detaljer en metode til palatal dissektion og statisk orgel kultur. Fordelen ved en ubevægelig organkultur er at det giver palatinalt hylder til at fusionere. Denne teknik er blevet anvendt med succes i vores laboratorium for mange fusion og signaler eksperimenter 8,9. Men omfanget af teknikken er enorme og kan bruges, når statisk orgel kultur-systemet er påkrævet, herunder evaluering af reaktioner på eksogene kemiske stoffer, virkningerne af regulatoriske vækstfaktorer i forskellige veje og specifikke proteiner.
Figur 1. Mus Palatogenesis. Udviklingsmæssige stadier af mus ganen. (BF) Scanning electron mikrografer (SEM) af den sekundære ganen på repræsentative udviklingsmæssige gange. Røde pile: viser den første del af palatal vedhæftning og fusion. Gule pile: punkt til rummet mellem de primære og sekundære ganer, som vil forsvinde efter fusion (genoptrykt fra Kaufman 11 med tilladelse fra PLoS ONE).
Protokollen i denne artikel giver en metode til at dissekere palatinalt hylder fra embryoner på embryonale dag 13.5. Palatal hylder fra musefostre blev dyrket i et serumfrit dyrkningsmedier i en atmosfære af 95% O 2 5% CO2 ved 37 ° C. Vellykket palatal dissektion er kritisk afhængig af flere faktorer på hvert trin i proceduren fra embryonale tidspunktet for aflivet mus til færdiggørelsen af kulturen. En af de vigtigste faktorer, der påvirker palatal fusion er den tid, det tager at starte orgel k…
The authors have nothing to disclose.
The authors do not have any acknowledgements.
BGJb | Invitrogen | ||
Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100x15mm |
Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60×15 mm |
Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made |
Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades |
Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made |
Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
Protector laboratory hood | Labconco | ||
Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
Series11 water Jacket | |||
Co2 incubator | |||
PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
Kim Wipes | VWR | 470173-504 | |