Summary
Studier av ganen utvikling er motivert av forekomsten av ganespalte, en fødsel defekt som pålegger en enorm helsebelastning og kan forlate varig skjemmende. Vi viser her en teknikk for å kultur palatal hyller som kan brukes til å studere forskjellige signalbaner som er involvert i utvikling palatinal og fusjon.
Abstract
Leppe- og ganespalte er blant de vanligste av alle fødselsskader. De sekundære gane skjemaer fra mesenchymale hyller dekket med epitel som Ddatavernloven danne midtlinjen epitel søm (MES). De teorier antyder at MES celler følger en epitelial til mesenchymale overgang (EMT), apoptose og migrasjon, gjør en smeltet gane 1. Fullstendig oppløsning av MES er sluttfasen av avgjørende palatinal sammenløpet med omkringliggende mesenchymale celler. Vi tilveiebringe en fremgangsmåte for gane organkultur. Den utviklede in vitro-protokollen tillater studiet av de biologiske og molekylære prosesser ved smelting. Programmene for denne teknikken er mange, inkludert evaluering av respons på eksogene kjemiske midler, effekter av regulatoriske og vekstfaktorer og spesifikke proteiner. Palatal organkultur har en rekke fordeler, inkludert manipulasjon på ulike stadier av utvikling som ikke er mulig ved hjelp av in vivo studier.
Introduction
Orofacial kløfter er de mest dominerende kraniofaciale misdannelser. Også tar i betraktning alle mulige kraniofaciale defekter, disse er den nest vanligste fødsel anomali hos nyfødte 2. Ganespalter skje på ca 1 i hver 700 fødsler i hvert år i USA (US), er forekomsten av ganespalte lik 475 barn født med ganespalter per måned eller 15 barn med ganespalte per dag tre. Omtrent 1% av barn født rundt om i verden hvert år utstilling eller annen form for kraniofaciale dysmorphology.
Kløfter av ganen og leppen trenger et svært kostbart og komplisert prosedyre med livslang konsekvenser for pasienter som har dette avviket. De beregnede kostnadene for hver pasient med oral kløften er ca $ 100 000 4. Behandling av en pasient med leppe- og ganespalte krever et team av leger inkludert kraniofaciale kirurger, otolaryngologists, genetikere, anestesileger,tale-språk patologer, ernæringsfysiologer, kjeveortopeder, prosthodontists, psykologer, nevrokirurger, og øyeleger.
I palatogenesis, oppstår det sekundære ganen som parrede utvekster, som til å begynne vokser vertikalt, og gjennomgår palatinal hylle høyde over dorsum av tungen. Etter heving, sammenkoblede palatal hyllene vokse mot midtlinjen (på E14.5 -E15 hos mus og uke 9 hos mennesker). Den mediale kanten epitel (MEE) som dekker hyllen spissen fester danner midtlinjen epithelial søm.
Dette etterfølges av epithelial til mesenchymal overgang og / eller apoptose for å tillate mesenchymale konfluens. Vedheft av opposisjon MEE er en viktig begivenhet som endring fører ganespalte. Men bare noen få studier undersøkt den innledende vedheft av palatal hyller 5. Den harde ganen former ved differensiering av mesenchymale celler i osteoblast. Unormal utvikling av ganen kan produsere cleft ganer med eller uten involvering av leppen.
Gane orgel kultur teknikker hadde blitt brukt mye i mange laboratorier i løpet av de siste 30 årene 6,7.
I denne protokollen beskriver vi i detaljer en metode for palatal disseksjon og statisk organ kultur. Fordelen med en ubevegelig organ kultur er at det tillater palatal hyller til å smelte. Denne teknikken hadde blitt brukt med hell i vårt laboratorium for mange fusion og signale eksperimenter 8,9. Men omfanget av teknikken er stort, og kan brukes når det statiske organ kultursystem er nødvendig, herunder evaluering av svarene på eksogene kjemiske midler, effekten av regulatoriske vekstfaktorer i forskjellige reaksjonsveier og spesifikke proteiner.
Figur 1. Mouse Palatogenesis. Utviklings stadier av mus ganen. (BF) Scanning electron mikrobilder (SEM) av den sekundære ganen på representative utviklingstider. Røde piler: viser den første delen av palatal vedheft og fusion. Gule piler: peker på plassen mellom de primære og sekundære ganer som vil forsvinne etter fusjon (gjengitt fra Kaufman 11 med tillatelse fra PLoS ONE).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet må utføres i samsvar med de retningslinjer og regler for bruk av virveldyr, inkludert forhåndsgodkjenning av den lokale Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Utarbeidelse av dissekere Instrumenter og Kultur Media
- Forvask alle instrumenter som skal anvendes i disseksjon med 3% hydrogenperoksyd og deretter autoklav ved 121 ° C i 20 min. Filter BGJb media med antibiotika og antimykotisk løsning ved hjelp av en 0,22 mikrometer pore størrelse filter med vakuum sug i en hette.
2. Utarbeidelse av kultur utstyr
- Skjær polykarbonat membranfiltre som vil støtte de palatal organer i små trekanter, spray med 70% alkohol og la dem tørke. Forbered Senter Vel Organ Culture Dish (60x15 mm) ved å plassere et rent og sterilisert likesidet trekant-formet ledning grid (20 mm) over orgelet kultur plate. Deretter fyller godt med 1 ml av BGJB mediekultur media. MERK: Mediene bør være tilstrekkelig for å nå nivået av rutenettet uten å senke de ganer. Plasser membranfiltre, blanke siden ned, på toppen av rutenettet (3-4 membraner per rutenett) .Depending på eksperimentet, kan behandling (proteiner, antistoffer eller hemmere) legges til media
3. Mouse Embryo Collection og klargjøring for kultur
- For å få villtype mus embryoer, bruk timet 13,5 gravid CD-en mus genetisk bakgrunn belastning. Rengjør disseksjon området med 70% etanol.
MERK: Andre stammer av mus kan brukes. Vi foretrekker CD-1-mus på grunn av det større antall kullet. - Avlive drektige mus ved E13.5 DPC (dager etter samleie) med 5% isofluran fulgt av halsdislokasjon å sikre død med godkjente protokoller.
- Spray 70% etanol på ventral abdominal overflaten for å unngå at mage hår pinne til instrumentene. Deretter åpner bukhulen ventraltBruk en skarp-stump drifts saks og mikro-dissekere pinsett til å finne livmoren. Ved hjelp av pinsett, løfte hele livmoren og skille det fra kroppen ved å kutte på livmorkroppen og på tuppen av livmor horn med en lett drifts saks.
- Plasser livmoren på et rent papirhåndkle over is (i henhold til protokollen guide for pleie og bruk av forsøksdyr). Dekk livmoren med et annet rent papir håndkle for å hindre forurensning. Sterilisere instrumentene som bruker 70% etanol spray før videre bruk. Livmoren og embryoene kan bli transportert til laboratoriet på is.
- I en laminær panseret åpent, nøye lage en liten åpning i plommesekken ved hjelp av skarpe sløv drifts saks og mikro-dissekere tang. Gjøre åpningen bredere og deretter skyve den forsiktig til exteriorize embryo fra plommesekken.
- Overfør embryoene umiddelbart til en petriskål med kaldt fosfatbufret saltvann (1X PBS) pH 7,4. For å sikre riktig scenen, examin embryoet under et disseksjonsmikroskop for kroppen, hodet størrelse og lemmer morfologi.
MERK: embryoer som ikke er på riktig trinn i utviklingen er ikke vant til eksperimentet.
Figur 2. Limb Bud Morfologi. Forgrunnen og baklemmene er sjekket for graden av webbing innrykk mellom sifrene. På E13.5, alle tall kondensasjoner er fremtredende, med webbing og distale fordypninger mellom sifrene vises veldig tydelig. Hind sifrene er bak etter en halv dag 12 Øvre rad. Forbena, nedre rad: bakben.
4. Palate Dissection
- Plasser ett embryo på et tidspunkt i en petriskål med PBS under dissekere mikroskop. Ved hjelp av små disseksjonssaksen og pinsett adskille hodet fra kroppen av embryoene.
- Holder nøye musen kraniet over øyehøyde med pinsett (unngåoverkjevens prosessen) gjør to snitt på begge sider av leppen linjen. Deretter fjerner kjeven og tungen. Isolere maxillaris prosessen regionen ved å gjøre et kutt i øyehøyde og fjerne hjernen, øynene, nasal septum og tilstøtende vev.
Figur 3. Palate vev hentet fra 13,5 embryoer, når gane hyllene hadde forhøyede men ikke tatt kontakt. De palatal hyllene ble plassert i organkultur på et filter på luft media interface for 72 timer i den statiske modellen. (A) Nivå disseksjon på E13.5 embryo. (B) Blå stjerner avgrense områder for å holde vevet med pinsett under disseksjon. (C) Utsikt dissekert palatal hyller plassert på en trapes filter membran. (D) fra siden av kultur fatet etter plassering av dissekert ganer og tillegg av kultur media.
- Plasser palatal oral side opp og fjern nasal septum og vevet rundt det, holde den primære gane knyttet til å orientere den fra fremre til bakre. Bruk en skje slikkepott og veldig nøye overføre palatal hyller (nesesiden ned) til de preparerte filtre på nett i kultur retter. MERK: Juster volumet av media for å oppnå tilstrekkelig luft media grensesnitt.
- Under stereo mikroskop, dissekere den primære gane og bruke pinsett for å plassere palatal hyller nær hverandre. De palatal hyllene vil ikke smelte sammen hvis de ikke er plassert i kontakt. Skjær trekantede membranfilter hvor den fremre del av ganen er plassert. Den trapesform skal hjelpe til med å lokalisere den fremre del av ganen.
- Kultur de palatal hyller individuelt eller med to eller tre i samme organ dyrkningsskålen hjelp BGJb kultur media.
5. Dyrking Mouse palatal Hyller
- Inkuber tissues ved 37 ° C i en fuktet gassblanding (5% CO 2 og 95% luft) i 72 timer, og endre medium hver 24. time.
6. Palate Processing for histologisk analyse
- Fest ganer etter 72 timer i kultur med 4% formaldehyd / fosfat-bufret saltvann O / N ved 4 ° C. Deretter forsiktig med en pipette overføring vaske vevet i dyrkningsskålen med PBS. Pakk ganer i et stykke av laboratorie kluter og plass i innebygging kassetter.
MERK: Innpakning ganer i laboratorie våtservietter hindre deres tap i løpet av dehydrering prosessen. - Dehydrere vevet følgende 70%, 80% og opp til 100% etanolvask i 1 time, etterfulgt av den vanlige parafininnebygging prosedyre. For innebygging, plasserer den fremre delen av ganen vendt skuffen.
- Skjær Serial 6 mikrometer seksjoner i den koronale orientering fra fremre til bakre. En komplett seksjon gane vil gi 350-450 delen elons. Flekk seksjoner med hematoxylin og eosin (H & E). 10 Score hver 20. seksjonen hjelp av tidligere beskrevet Mean Fusion Score (MFS) skala (tabell 1). 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Teknikken kan brukes til forskjellige typer experiments.The følgende studie ble designet for å teste teratogen effekt av nikotin in vitro på palatinal fusjon. To stammer av mus ble brukt for dette eksperiment, ble CD1 og C57.Palatal vev behandlet med 0,06 og 6 mM konsentrasjoner av nikotin hemisulfat. Det ble observert at palatal fusjons mønstre og timing var forskjellige i de to forskjellige stammer. I CD1 mus, palatal hyller fra kontrollgruppen fortsatte sammensmelting i tidsavhengig måte. Men i den behandlede gruppe nikotin forsinket fusjons spesielt ved 6 mM nikotinkonsentrasjon (figur 4A). Histologiske deler av CD1 muse ganer viste total fusjon etter 72 timer i kontrollprøver. Ved lavere doser av nikotin i palatal hyllene holder men epitelcellene forblir etter 3 dager i kultur. Palatal hyller ruges ved høye doser av nikotin gjør ikke kontakt etter 72 timers inkubasjon.
(figur 4B). Histologiske deler av C57 mus ganer viste at i behandlingsgruppene en kontinuerlig epitel søm vedvarte i midtlinjen. Fusjon ble observert bare i kontrollgruppen ved 72 timer.
Vi observerte at palatal fusjon i begge typer mus er påvirket av høye doser av nikotin. Men ganer fra C57 var mer fornuftig å nikotin. I konklusjonen, våre resultater viser at genetisk bakgrunn av mus påvirker nikotin responser i palatal vev.
| Score | Kriterier |
| 1 | Non-fusion uten heft. |
| 2 | Non-fusjon med noen åpen vedheft. |
| 3 | Heft med noen oppløsningen av Mee lag og tydelig delvis mesenchymale samløpet. |
| 4 | Komplett fusjon med noen spor av Mee celler eller søm gjenstår. |
| 5 | Komplett fusjon uten tegn til Mee celler eller søm synlig. |
Tabell 1: Mean Fusion Score (MFS) skala (Kang og Svoboda, 2002). Beregne resultatet for hver gane for fremre (§§ 1-150), midtre (§§ 150-300) og posterior (avsnitt 300-450). 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen i denne artikkelen gir en metode for å dissekere palatal hyller fra embryoer på embryonale dag 13.5. Palatal hyller fra museembryoer ble dyrket i et serumfritt kulturmedium i en atmosfære med 95% O 2 5% CO2 ved 37 ° C. Vellykket palatalt disseksjon er kritisk avhengig av flere faktorer ved hvert trinn under prosedyren fra den embryoniske tidspunktet for avlives musene til gjennomføring av kulturen. En av de viktigste faktorene som påvirker palatinal fusjon er den tid det tar å starte organkultur; embryoer trenger å være på embryonale dag 13,5 som de sekundære gane hyllene er horisontale, men har ikke begynt å smelte (figur 1).
Et annet kritisk punkt under prosedyren er exteriorization av embryoer fra plommesekken. Dette trinnet krever stor forsiktighet for å hindre skade på ansiktsstrukturer. Når embryoet er fjernet fra sac, blir fjernet fra hodetlegemet og plassert i en petriskål for å bli sett med et stereomikroskop med fiberoptisk belysning fra begge sider. Kjeven og tungen blir fjernet, utsette ganen. Hjernen og restvevet blir fjernet i øyehøyde. På dette punktet er det viktig å vurdere epitellaget rundt hyllene. Det er nødvendig å manipulere vevet meget nøye for å holde integriteten av disse cellene. Epitelceller er ansvarlige for tilslutning og dannelse av MES.
Hver dissekert ganen er slått oral side ned for å rydde enhver brusk fra nasal septum. Dette vevet er på den fremre side av ganen og ser hvitere og mer kondensert. Palatal hyller frie for uønsket vev blir flyttet til en kulturskål og plassert på toppen av filtermembranen. Posisjonen av hyllene blir kontrollert igjen under stereo disseksjonsmikroskop. De må skyves sammen for å tillate tilslutning og videre palatal fusjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100 x15 mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60 x15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| CO2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 |
References
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Elsevier. (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).
