एक Colliculo-thalamocortical माउस मस्तिष्क टुकड़ा के संशोधन, 3-डी चैंबर अवयव के मुद्रण और बहु पैमाने ऑप्टिकल इमेजिंग शामिल
Summary
कई कोण का उपयोग कर माउस पिल्ला मस्तिष्क में कटौती करने के लिए, हम प्रमुख श्रवण मध्यमस्तिष्क और अग्रमस्तिष्क संरचनाओं के अधिकांश के बीच कनेक्शन को दर्शाता है जो एक पहले से वर्णित तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा पर सुधार होगा।
Abstract
The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.
Introduction
संवेदी परिधि और अवर colliculus के बीच सूचना के पर्याप्त प्रसंस्करण है, हालांकि वहां यह श्रवण प्रांतस्था तक पहुंचने से पहले श्रवण प्रणाली में, काफी अतिरिक्त संसाधन नहीं है। हम जानते हैं कि प्रसंस्करण किया और कहा कि परिवर्तन मस्तिष्क भेजे गए संवेदी जानकारी की व्याख्या करने के लिए अनुमति देता है के बारे में कैसे इसलिए थोड़ा है के बारे में बहुत कम जानते हैं। महक के अपवाद के साथ, इंद्रियों में से प्रत्येक के शुरू में संकेत कोर्टेक्स के लिए ascends के रूप में गिरावट आती है, जो उच्च निष्ठा के साथ रिले किया जा रहा परिधीय संकेतों के साथ एक बहुत ही इसी संगठन है। कोर्टेक्स तो आगे आने वाली जानकारी को व्यवस्थित करना कम संरचनाओं के अनुमानों को भेजता है। इस जटिल प्रणाली vivo में के रूप में अच्छी तरह के रूप में इन विट्रो तैयारियों की संख्या में तरीकों की एक किस्म में अध्ययन किया गया है। पूर्व में, सभी कनेक्शनों संवेदी इनपुट को नियंत्रित करने और मापने, जबकि कनेक्शन के किसी सेट की जांच के लिए शोधकर्ता, सक्रिय करने बरकरार हैंकिसी भी क्षेत्र में उत्पादन। इस दृष्टिकोण के साथ, एक बेहद जटिल उत्पादन को जन्म दे रही है, अन्य संवेदी आदानों, उत्तेजना, और ध्यान देने सहित अन्य आदानों की बड़ी विविधता का कोई नियंत्रण नहीं करने के लिए कुछ नहीं है। इन विट्रो, मस्तिष्क के स्लाइस एक भी सेट या तो कब्जा करने की कटौती की गई है शोधकर्ताओं को प्रोत्साहित और afferents या मस्तिष्क क्षेत्रों विभिन्न मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देते हैं जो अनुमानों, या दो जुड़े मस्तिष्क क्षेत्रों की। ये अक्सर चेतक के लिए इनपुट या चेतक और कोर्टेक्स के लिए अपनी उत्पादन या तो 2-5 संरक्षित कर रहे हैं, जहां thalamocortical या tectothalamic या तो स्लाइस हैं। इन तैयारियों, औषधीय बिजली, और optogenetic जोड़तोड़ की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि केवल दो मस्तिष्क क्षेत्रों के साथ, वे मुख्य रूप से सूचना के हस्तांतरण का मूल्यांकन करें और यह चेतक के माध्यम से गुजरता के रूप में जानकारी के परिवर्तन का मूल्यांकन करने की क्षमता की कमी है। यह भी ध्यान देने मॉडुलन में एक भूमिका निभा सकता है जो reticulo-thalamic प्रक्षेपण, 6-9 पीआर हैइस टुकड़ा में ESENT। यहाँ हम कैसे चेतक फाटकों और फिल्टर जानकारी का एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य देने के लिए चेतक के लिए विभिन्न आदानों की अन्वेषक नियंत्रण की अनुमति देता है जो हमारे पिछले तैयारी 1, पर सुधार प्रदर्शित करता है। हम जोड़े को एक एकल कोशिका के स्तर पर विभिन्न आदानों के प्रभाव को मापने के लिए टुकड़ा कनेक्टिविटी और बड़े पैमाने पर सक्रियण विश्लेषण, न्यूरोनल आबादी के विश्लेषण के लिए चेतक में कैल्शियम इमेजिंग, और एकल कक्ष रिकॉर्डिंग का आकलन करने के लिए flavoprotein autofluorescence इमेजिंग के साथ इस उपन्यास टुकड़ा तैयारी।
इन बड़े पैमाने पर कनेक्शन को बनाए रखने में सहायता करने के लिए हम भी बढ़ाया छिड़काव के लिए टुकड़ा तरक्की के लिए जगह में मस्तिष्क टुकड़ा और एक पुल के आयोजन के लिए सामान्य टुकड़ा लंगर (उर्फ "वीणा") के संशोधनों के एक नंबर का विकास किया है। वीणा टुकड़ा चारों ओर और वीणा के तार के लिए अनुकूलन लगाव अंक के लिए अनुमति देने के लिए एक संशोधित घोड़े की नाल के आकार में बनाया गया है। तीन तार कर रहे हैंसंलग्न i) एक ii) एक एसी की दुम किनारे करने के लिए आईसी की दुम किनारे से फैली और iii) एक एक क्षेत्र के लिए टुकड़ा की औसत दर्जे किनारे से तिरछे फैली, टुकड़ा की औसत दर्जे बढ़त के साथ क्षैतिज निहित है कि इस तरह के एसी के लिए व्याख्यान चबूतरे (चित्रा 1 ए देखें)। तार टुकड़ा अखंडता को बनाए रखने में मदद करने के लिए टुकड़ा पर दबाव की एक कम राशि के लिए अनुमति देते हैं वीणा की (cyanoacrylate गोंद के साथ) gluing के लिए फ्रेम में छोटे indentations (चित्रा 1 बी देखें)। तीन आयामी मुद्रण का उपयोग करके, हम ऊतक के ऊपर और नीचे कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के आदर्श प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं जो हमारे अद्वितीय विशेषताओं के साथ-साथ पुलों के लिए कस्टम डिजाइन वीणा करने में सक्षम हैं। यह भी पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए ऊतक घुसना करने के लिए प्रकाश के लिए बड़े क्षेत्रों को बनाए रखता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.
Materials
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100x15mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35x10mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
References
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