Summary
Met behulp van meerdere hoeken om de muis pup hersenen snijden, verbeteren we op een eerder beschreven acute hersenen slice, die de verbindingen tussen de meeste van de grote auditieve middenhersenen en de voorhersenen structuren vangt.
Introduction
In het gehoorsysteem, hoewel er een aanzienlijke verwerking van informatie tussen de sensorische periferie en de inferior colliculus, er aanzienlijke extra bewerkingen voordat de auditieve cortex bereikt. We weten heel weinig over hoe dat de verwerking wordt gedaan en dus weinig over hoe die transformatie kan de hersenen om binnenkomende zintuiglijke informatie te interpreteren. Met uitzondering van de reukzin elk van de betekenissen heeft een soortgelijke organisatie met perifere signalen aanvankelijk doorgifte met high fidelity die afneemt als het signaal stijgt naar de cortex. De cortex stuurt projecties lagere structuren om de binnenkomende gegevens verder te moduleren. Dit complex systeem werd bestudeerd op verschillende wijzen in vivo als in een aantal in vitro preparaten. In het eerste, alle verbindingen intact zijn, zodat de onderzoeker aan een set van verbindingen sonde, terwijl het beheersen van de zintuiglijke input en metenproductie in een bepaalde omgeving. Met deze benadering is er weinig tot geen controle over de grote verscheidenheid van andere inputs, waaronder andere sensorische inputs, opwinding en aandacht, hetgeen leidt tot een intens complex uitgang. In vitro, hebben hersenen plakjes gesneden tot een enkele set vangen projecties, of twee verbonden hersengebieden, die het mogelijk maken de onderzoekers te stimuleren en te evalueren diverse afferenten of hersengebieden. Deze zijn vaak ofwel thalamocorticale of tectothalamic segmenten wanneer hetzij de inbreng in de thalamus of de thalamus en de uitvoer naar de cortex bewaard 2-5. Deze preparaten maken een groot aantal farmacologische, elektrische en optogenetic manipulaties. Maar met slechts twee hersengebieden, zij hoofdzakelijk beoordeelt de informatieoverdracht en missen het vermogen om de transformatie van informatie te beoordelen als het door de thalamus passeert. Ook de reticulo-thalamische projectie, die een rol kunnen spelen in de aandacht modulatie 6-9 pr isESENT in dit stukje. Hier laten we verbeteringen bij onze voorafgaande conditionering 1, waarbij de onderzoeker controle van diverse input voor de thalamus toelaat een uniek perspectief hoe de thalamus poorten en filters informatie. Koppelen we deze roman slice voorbereiding met flavoproteïne autofluorescentie imaging voor het beoordelen van slice connectiviteit en grootschalige activering analyse, calcium beeldvorming in de thalamus voor neuronale populatie analyse en enkele cel opname om de impact van de verschillende ingangen op een enkele cel niveau te meten.
Om u te helpen bij het handhaven van deze wijdverspreide verbindingen hebben we ontwikkelde ook een aantal wijzigingen van de normale slice anker (aka "harp") voor het houden van de hersenen slice op zijn plaats en een brug naar de slice voor een betere doorbloeding te verheffen. De harp is ontworpen in een gewijzigde hoefijzervorm aan de slice omringen en zorgen voor aanpasbare bevestigingspunten voor de harp snaren. Drie snaren zijnverbonden zodanig dat i) een horizontaal ligt langs de mediale rand van de plak, ii) een zich vanaf de caudale kant van de IC aan de caudale kant van de AC en iii) een zich diagonaal uitstrekt vanaf de mediale rand van het segment naar een gebied rostraal van de AC (zie figuur 1A). Kleine inkepingen in het frame voor het verlijmen (met cyanoacrylaatlijm) van de harpsnaren zorgen voor een verlaagde hoeveelheid druk op het segment om slice integriteit te behouden (zie figuur 1B). Door driedimensionale afdrukken, kunnen wij aangepaste ontwerp harpen onze unieke specificaties en bruggen die het mogelijk maken ideale stroming van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) boven en onder het weefsel. Dit houdt ook grote gebieden voor licht aan het weefsel voor patch clamp elektrofysiologie dringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Illinois. Alle dieren werden ondergebracht in dierlijke zorginstellingen door de Amerikaanse Vereniging voor Accreditatie van Laboratory Animal Care goedgekeurd. Elke poging werd gedaan om het aantal gebruikte dieren zoveel mogelijk te beperken en om lijden te verminderen in alle fasen van het onderzoek.
1. Voorbereiding op en verwijdering van de hersenen van de muis te snijden
- Bereid je voor perfusie en slice incubatie.
- Ongeveer 30 minuten alvorens te snijden, bereiden hoge sucrose snijden oplossing en lage calcium aCSF voor incubatie van de slice voorafgaand aan de opname of beeldvorming.
- Lay-out van alle noodzakelijke instrumenten (grote stomp uiteinde schaar, kleine lente schaar, anatomische pincet, grote schaar of guillotine, iris schaar, juweliers tang, 10 ml spuit met 27G x 1/2 inch naald, klein stukje van 1 cm x 2 cm filter papier en een gebroken getipt Pasteur pipet voor slice transfer) voor perfusie en snijden, en voor te bereiden perfusie lade.
- Opgezet incubatie kamer met zuurstofrijk aCSF in een 32 ° C waterbad en een cultuur schotel gevuld met cutting-oplossing.
- Bereid snijden podium voor het onderuit.
- Snij een klein stukje 3% agar ongeveer 1 cm tot 3 als een vangnet voor de hersenen en 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm voor een bult te gebruiken om het faillissement van de IC.
- Lijm de terugloopblokkering op het podium met cyanoacrylaatlijm alsmede de bult aan de rechterzijde van de terugloopblokkering zodanig dat zij een 80 o hoek.
- Verwijder de hersenen.
- Diep verdoven een p12-p20 (idealiter p14-18) muis met ketamine 100 mg / kg en xylaxine 3 mg / kg (of vergelijkbare ethische commissie goedgekeurde procedure).
Opmerking: Bevestig de juiste anesthesie-niveau via het gebrek aan reactie op teen knijpen. Aangezien het dier onder narcose kort oogzalf overbodig. - Met behulp van stompeeinde schaar, de ribbenkast blootstellen van het zwaardvormig proces om de hals.
- Vind de zwaardvormig proces, en maak een horizontale snede van ongeveer 1,5 cm.
- Maak twee verticale delen uit de uiteinden van de vorige horizontale snede om de schouders, ongeveer 1,5 cm.
- Dwars door het middenrif en de costochondral knooppunten naar het hart bloot te leggen.
- Met spring schaar, een kleine, 2-5 mm gesneden in het rechter atrium, van de ventrale voor van het hart dorsale.
- Met behulp van een injectiespuit van 10 ml met een 27G x 1/2 inch naald, injecteren de linker hartkamer en snel perfuseren het dier met hoge sucrose snijden oplossing.
- Zodra het bloed helder is, gebruiken grotere schaar om het hoofd te verwijderen.
Let op: We hebben niet systematisch onderzocht het nut van perfusie. Echter, in onze ervaring, transcardiale perfusie in muizen deze jonge kan worden gedaan met bijna 100% succes, en heeft het voordeel van het elimineren van rode blood cellen, die fluoresceren en interfereren met beeldvorming. - Snijd de huid beneden de middellijn aan de schedel bloot te leggen.
- Met behulp van gebogen iris schaar, knip de schedel tussen de ogen, dan vanaf de snede tussen de ogen, zorgvuldig gesneden van anterior naar posterior over de middellijn hechting verzorgen niet naar de hersenen eronder beschadigen.
Opmerking: De dura komt meestal af met de schedel. Indien nodig, verwijder de dura voordat zorgvuldig verwijderen van de hersenen. - Met behulp van een tang juweliers, wrikken open de schedel en verwijder voorzichtig de hersenen, plaats dan de hersenen in het snijden oplossing. Zorg om beschadiging van de cortex.
- Diep verdoven een p12-p20 (idealiter p14-18) muis met ketamine 100 mg / kg en xylaxine 3 mg / kg (of vergelijkbare ethische commissie goedgekeurde procedure).
2. Voorbereiden Brain voor snijden
- Het voorbereiden van de hersenen voor montage op vibratome podium.
- Met behulp van een slide gemarkeerd met twee lijnen bij 90 ° en een diagonale lijn op 17 o van linksboven naar rechtsonder, waar de twee kruisende lijnen samenkomen, plaats de hersenen dorsale kant naar boven, viaeen scheermesje, verwijder 2-4 mm van de rostrale einde hersenen waardoor een vlakke ondergrond.
- Plaats de hersenen caudale kant naar boven op de nieuw gecreëerde plat oppervlak, en lijn het dorsale oppervlak van de hersenen met de horizontale en de middellijn van de hersenen met de verticale lijn.
- Lijn het scheermes met de 17 o lijn, tilt het scheermes in een hoek van 30 ° en verwijder ongeveer 3 mm van de rechter cortex in een dubbele diagonale snede (17 o van horizontale vlak en 60 ° van de coronale).
- Montage hersenen op vibratome podium.
- Leg een klein stukje filtreerpapier 1 cm x 2 cm aan de ventrale kant van de hersenen zodat de lengterichting loodrecht op de middellijn.
- Gelden voorzichtig een kleine hoeveelheid cyanoacrylaat lijm op het gebied voor de terugloopblokkering (en links van de bump).
- Plaats een dubbele schuin gesneden hersenen gezicht om de lijm, zodat het caudale deel van de hersenen en achterhersenen zijn prstatus krijgen op de bult en de rechterkant van de hersenen tegen de backstop.
- Fijn druk op het brein, zodat het gehele oppervlak in contact met het snijden kamer.
3. Het verkrijgen van de Colliculo-thalamocorticale Slice
- Neem snel de snij podium en plaats in de vibratome, vullen het podium met het snijden oplossing.
- Lijn het mes met de bovenkant (ventrale zijde) van de hersenen.
- Verwijder 1-1,5 mm vanaf de bovenkant van de hersenen, verwijder 300-500 urn plakjes en evalueren diepte na verwijdering.
Opmerking: Wanneer de IC, de MGB, en de laterale nucleus geniculate (LGN) zijn alle zichtbare, en de dentate gyrus vormt een 'C' vorm te krijgen 01:59 600 micrometer plakjes. Zie figuur 3A. - Plaats plakken in verwarmde (32 ° C) houden kamer.
4. Imaging van de Slice
- Voorbereiding voor flavoproteïne autofluorescentie imaging.
- <li> Bereid aCSF voor perfusie van segment in een standaard elektrofysiologische opname kamer, bubble aCSF met 95% O2 / 5% CO 2.
- Trek glas elektrode voor stimulatie. Merk op dat meerdere verschillende stimulerende elektroden en configuraties (glas, wolfraam, carbon fiber, monopolaire, bipolaire) Alle werken heel goed samen met flavoproteïne autofluorescentie imaging.
- Zet de computer, camera, micromanipulator, lichtbron, stimulatie software, image capture software.
- Perfuseren de opname kamer met zuurstofrijk aCSF, plaatst aangepaste brug (ontwerp beschikbaar in Aanvullende Materials) om slice te verheffen in de kamer.
Opmerking: perfusiesnelheid kan variëren met elke individuele opgericht; 5-15 ml / min wordt hier gebruikt. - Plaats slice in de kamer, hoe lager het vloeistofniveau in de kamer om te voorkomen dat de slice van het opheffen van de brug, terwijl het plaatsen van speciaal gebouwde harp dan slice, zorg om te voorkomen dat het plaatsen van harp snaren dan paden van interest (Figuur 1A). Verhoog vloeistofniveau tot ongeveer 1-2 mm boven slice te aCSF stroom boven en onder de plak te handhaven.
Opmerking: Als herpositionering nodig is, gebruik maken van de gebroken einde Pasteur pipet of laat de aCSF niveau te stijgen en een tang met uiterste zorg. - Plaats zilverchloride elektrode in glas elektrode gevuld met aCSF, plaatst het glas elektrode in micromanipulator en verbinding te isolator stimulus, en zorgvuldig plaats glazen elektrode in IC / witte stof leidt tot thalamus (zie figuur 1A).
- Verzamel beelden met 4 Hz (onder toepassing van een oneindig gecorrigeerde 2X macro objectief (NA 0,13)) en een camera 105 sec, terwijl het elektrisch stimuleren (elk stimulatiekanaal uit 1 sec van 40 Hz 2 msec pulsen weefsel bij 0,05 Hz vijfmaal) terwijl lichtdoorlatende het weefsel met blauw licht 470-490 nm en het vastleggen van boven 515 nm. Zorg ervoor dat het beeld is niet aano donker, noch geblazen zie figuur 3 linkerkolom voor referentie.
Opmerking: Collection tijd verzamelen frequentie en stimulatiefrequentie kan worden gewijzigd om het experiment aangepaste programma opgenomen in aanvullende materiaal kan worden gemodificeerd als zodanig aan te passen. - Afbeeldingen exporteren naar Matlab, en het gebruik van de op maat geschreven programma beschikbaar in aanvullende materialen om spectrale kracht van de beelden te analyseren op 0,05 Hz. Het resulterende beeld wordt aangesloten wegen tonen.
Opmerking: Het aangepaste programma gebruikt een snelle Fourier-transformatie van de pixelwaarden in de tijdreeks om het beeld te produceren.
- Bereid kleine incubatiekamer behulp van een 3 cm cultuur schotel en getogen cultuur membraan om aCSF aan zowel de boven- en onderkant van de slice en plaats te bereiken op een verwarmingselement om de temperatuur te handhaven op ongeveer 32 o C.
- Vul kleine incubatiekamer met warme aCSF en langzaam bel met 95% O2/5% CO 2.
- Meng 2 pl Pluronic F-127 zuur en 50 ug 02:00 Fura-opgelost in 48 pl DMSO.
- Plaats slice in kleine incubatiekamer op verhoogde membraan en voorzichtig met een micropipet toe kleuring mengsel direct boven de MGB (of een andere structuur van belang).
- Cover plakjes bleken voorkomen voorafgaand aan beeldvorming en laat plakken incuberen 45 minuten - 1 uur.
- Verwijder plakjes tot verhitte houden kamer voor 10-15 minuten te wassen overtollig materiaal.
- Volg de stappen 4.1.1 tot 4.1.6 voor de voorbereiding te stimuleren en het imago van de colliculo-thalamocorticale slice.
- Verzamel beelden bij 10 Hz (met behulp van een 20X water immersie objectief) voor 25 sec, terwijl het elektrisch stimuleren (elk stimulatie bestaat uit een 2 msec puls) weefsel op 0,2 Hz vijf keer terwijl het verlichten van het weefsel met 365 nm licht en het vastleggen van fluorescentie boven 510 nm. Afbeeldingen exporteren naar Matlab en het gebruik van de op maat geschreven programma beschikbaar in aanvullende materialen om spectrale kracht van de beelden te analyseren op 0,2 Hz. Het resulterende beeld zal actieve cellen vertonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van colliculo-thalamocorticale muizenhersenen slice verkregen P15 muizen wordt weergegeven in figuur 2. De ideale plak de vier grote middenhersenen en de voorhersenen auditieve structuren IC, MGB, TRN, en AC, die allemaal geactiveerd wanneer de IC wordt gestimuleerd bevatten (Figuur 2A). Met behulp van Fourier-analyse, wordt het spectrale vermogen gemeten op de elektrische stimulatie frequentie, verbonden met hersengebieden blijkt activiteit die periodiek en meegevoerd in de stimulatiefrequentie 10. Dit protocol maakt onderzoek naar de opwaartse stroom gegevens met name de thalamus een verband tussen de middenhersenen en de cortex. Hoewel dit protocol helpt bij de productie van de aangesloten colliculo-thalamocorticale segment alsmede het verschaffen van een gemakkelijker aanpasbaar reeks hardware met de opname van 3D printing, inbegrepen zijn een voorbeeld van een segment geen verbinding van de thalamus naar de cortex (figuur 2B ), een s evenals een connectiviteit patroon waarbij de thalamus niet activiteit flavoproteïne autofluorescentie imaging (figuur 2C) te tonen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de verbinding die intern in het segment zodanig dat de activering niet op het oppervlak van de plak en dus niet worden gezien met het flavoproteïne autofluorescentie imaging. Het kan echter onwaarschijnlijk dat dit antidromic activatie. We hebben niet gezien antidromic activering bij het stimuleren van de witte stof van de thalamocorticale projecties 11, en met deze stimulatie paradigma synaptische blokkade in de thalamus veroorzaakt een omkeerbare eliminatie van de corticale signaal 1. Met behulp van dit segment, is het ook mogelijk om te kijken naar celpopulatie activiteit in de thalamus met elektrische stimulatie van de IC. Een voorbeeld calcium imagingexperiment toont spiking activiteit van een kleine populatie van thalamus neuronen in reactie op een stimulus middenhersenen (figuur 3).
ent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 1. De weergave van 3D-gedrukte materialen. (A) Gesmolten beeld van de slice zit op de brug met de bedrukte harp op zijn plaats. Pijl geeft stroom van aCSF. (B) Gesmolten afbeelding benadrukken groeven voor de snaren van de harp waardoor de dikkere slice (cirkels).
Figuur 2. Het snijden van de hersenen voor het snijden. (A) Agar positionering op het scherpst van het podium. (B) Schuif voor de hersenen positionering. (C) positie van de hersenen voor anterieure cut. (D) Stand van de hersenen en scheermes voor dubbele schuine snede. (E) Definitieve blokkeren van de hersenen voor het snijden .
/ftp_upload/53067/53067fig3.jpg "/>
Figuur 3. flavoproteïne autofluorescentie imaging van colliculo-thalamocorticale hersenen slice. (A) Verbonden colliculo-thalamocorticale stukje hersenen zoals bevestigd door flavoproteïne autofluorescentie. Elektrische stimulatie 0.05 Hz IC afgebeeld bij 4 Hz en Fourier bewerkt om vermogen op stimulatie frequentie tonen. Opmerking activatie van MGB, en TRN, AC en het corpus striatum (CS). (B) Niet verbonden segment. Elektrische stimulatie van IC slechts activering van MGB. Gehele route werd niet meegenomen waarschijnlijk te wijten aan 17 o hoek wordt iets te steil. (C) Atypische activering van AC. Elektrische stimulatie van IC met activatie van AC zonder zichtbare signaal in de MGB of TRN. Pathway waarschijnlijk intact maar de actieve cellen in de MGB waarschijnlijk aan de andere kant van het weefsel.
ad / 53.067 / 53067fig4.jpg "/>
Figuur Raw 20X beeld van de MGB 4. Calcium beeldvorming. (A) Ruwe beeld van bijvoorbeeld slice verlicht calcium beeldvorming. (B), heldere punten zijn cellen. Schaalbalk 100 urn. (C) Calcium signaal met elektrische stimulatie van de IC. Fourier verwerking toont de activering van beide cellen witte pijlen en neuropil zwarte pijlpunt. Inzet, tijdsverloop van gemiddeld signaal (inzet schaal bar 0,5% verandering in fluorescentie, 1 sec).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100 x 15 mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35 x10 mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
References
- Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse. J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).
- Agmon, A., Connors, B. Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro. Neuro. 41, 365-379 (1991).
- Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro. J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).
- Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. PNAS. 107, 372-377 (2010).
- MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R.
- Crabtree, J. W., Isaac, J. T. New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus. J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).
- McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons. J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).
- Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat. J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).
- Zikopoulos, B., Barbas, H. Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms. J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).
- Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal. Neuron. 38, 529-545 (2003).
- Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus. J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).
- Ehret, G. Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning. Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).
- Mikaelian, D., Ruben, R. Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy. Acta. 59, 451-461 (1965).
