Summary
L'utilizzo di più angoli per tagliare il cervello di topo cucciolo, miglioriamo su una fetta cerebrale acuto precedentemente descritto, che cattura le connessioni tra le maggiori strutture mesencefalo e proencefalo uditive.
Introduction
Nel sistema uditivo, anche se vi è sostanziale elaborazione di informazioni tra la periferia sensoriale e collicolo inferiore, vi è una notevole ulteriore elaborazione prima che raggiunga la corteccia uditiva. Sappiamo molto poco su come che l'elaborazione è fatto e quindi poco su come queste trasformazioni permette al cervello di interpretare le informazioni sensoriali in entrata. Con l'eccezione dell'olfatto, ognuno dei sensi ha un'organizzazione molto simile con segnali periferici inizialmente inoltrato ad alta fedeltà che diminuisce all'aumentare del segnale di sale alla corteccia. La corteccia invia proiezioni alle strutture inferiori per modulare ulteriormente le informazioni in entrata. Questo complesso sistema è stato studiato in una varietà di modi in vivo così come in un certo numero di preparati in vitro. Nel primo caso, tutte le connessioni sono intatte, consentendo al ricercatore di sondare qualsiasi insieme di collegamenti, controllando l'input sensoriale e misurandouscita in una determinata area. Con questo approccio, non vi è poco o nessun controllo della grande varietà di altri fattori, inclusi altri input sensoriali, eccitazione, e attenzione, dando luogo ad una uscita intensamente complesso. In vitro, fettine cerebrali sono stati tagliati per catturare un singolo set di proiezioni, o due aree cerebrali connesse, che permettono ai ricercatori di stimolare e valutare afferenze o aree cerebrali diverse. Si tratta spesso di fette o talamocorticali o tectothalamic in cui o l'ingresso al talamo o il talamo e la sua uscita alla corteccia sono conservati 2-5. Queste preparazioni consentono un'ampia varietà di manipolazioni farmacologiche, elettrici, e optogenetic. Tuttavia con solo due regioni del cervello, essi sono principalmente valutano il trasferimento di informazioni e non hanno la capacità di valutare la trasformazione delle informazioni che passa attraverso il talamo. Anche la proiezione reticolo-talamo, che possono svolgere un ruolo nella modulazione attenzione 6-9 è prESENT in questa fetta. Qui mostriamo miglioramenti su nostra precedente preparazione 1, che permette il controllo investigatore di vari ingressi al talamo di dare una prospettiva unica di come le porte talamo e filtri informazioni. Abbiamo paio questo romanzo preparazione fetta con immagini flavoproteina autofluorescenza per valutare la connettività fetta e l'analisi di attivazione su larga scala, l'imaging calcio nel talamo per neuronale analisi di popolazione, e la registrazione singola cellula per misurare l'impatto dei vari ingressi su un livello di singola cellula.
Per aiutare a mantenere queste connessioni diffuse abbiamo anche sviluppato una serie di modifiche del normale ancoraggio fetta (alias "arpa") per la tenuta della fetta cervello in luogo e un ponte di elevare la fetta per una migliore perfusione. L'arpa è stato progettato in un ferro di cavallo modificata per circondare la fetta e consentire punti di fissaggio personalizzabili per le corde dell'arpa. Tre stringhe sonoallegata tale che i) uno si trova orizzontalmente lungo il bordo mediale della fetta, ii) uno estende dal bordo caudale del IC all'estremità caudale della CA e iii) uno estende diagonalmente dal bordo mediale della fetta un'area rostrale alla CA (vedere Figura 1A). Piccoli tacche del telaio per incollaggio (con colla cianoacrilato) dell'arpa stringhe permettono una ridotta quantità di pressione sulla fetta per aiutare a mantenere l'integrità fetta (vedere Figura 1B). Utilizzando stampa tridimensionale, possiamo arpe progettazione personalizzata alle nostre specifiche uniche, così come i ponti che consentono il flusso ideale di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) sopra e sotto il tessuto. Questo mantiene anche ampie aree per la luce di penetrare il tessuto per la patch clamp elettrofisiologia.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso la University of Illinois. Tutti gli animali sono stati alloggiati in strutture di cura degli animali approvato dalla Associazione Americana per l'accreditamento di cura degli animali da laboratorio. Ogni tentativo è stato fatto per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e di ridurre la sofferenza in tutte le fasi dello studio.
1. La preparazione e la rimozione di Brain Mouse affettare
- Prepararsi per la perfusione e la fetta di incubazione.
- Circa 30 minuti prima di tagliare, preparare ad alta soluzione di taglio di saccarosio e basso aCSF calcio per l'incubazione della fetta prima della registrazione o l'imaging.
- Disporre tutti gli strumenti necessari (grandi forbici spuntate finali, piccole forbici primavera, pinze anatomiche, grandi forbici o ghigliottina, iride forbici, pinze, gioiellerie 10 ml siringa con ago 27G x 1/2 pollice, piccolo pezzo di 1 cm di filtro x 2 cm carta, e un rotto punta pipetta Pasteur per sltrasferimento ghiaccio) per la perfusione e affettare, e preparare vassoio di perfusione.
- Istituito incubazione da camera con ossigenato aCSF in un bagno d'acqua C 32 o e un piatto di cultura piena di soluzione di taglio.
- Preparare fase di taglio per affettare.
- Tagliare un piccolo pezzo di 3% agar circa 1 cm 3 da utilizzare come arresto per il cervello e 1.5 cm x 1.5 mm x 3 mm per un urto da utilizzare per sostenere l'IC.
- Colla l'arresto sul palco con cianoacrilato nonché l'urto sul lato destro del blocco d'inversione tale da formare un angolo di 80 °.
- Rimuovere il cervello.
- Profondamente anestetizzare un p12-P20 (idealmente p14-18) mouse con ketamina 100 mg / kg e xylaxine 3 mg / kg (o comitato etico comparabili procedura approvata).
Nota: Verificare il corretto livello di anestesia con mancata risposta alla pizzico piedi. Poiché l'animale è sotto anestesia brevemente, pomata oftalmica è inutile. - Utilizzando smussatoterminare forbici, esporre la gabbia toracica dal processo xifoideo al collo.
- Trovare il processo xifoideo, e fare un taglio orizzontale di circa 1,5 centimetri.
- Fare due tagli verticali dalle estremità del precedente taglio orizzontale alle spalle, circa 1,5 cm ciascuno.
- Tagliare attraverso il diaframma e le giunzioni costocondrali per esporre il cuore.
- Con piccole forbici primavera, fare un piccolo, 2-5 tagliare nell'atrio destro mm, dal lato dorsale ventrale del cuore.
- Usando una siringa da 10 ml con un ago 27G x 1/2 pollice, iniettare il ventricolo sinistro e profumato rapidamente l'animale con alta soluzione di taglio saccarosio.
- Una volta che il sangue scorre chiaro, usare le forbici più grandi per rimuovere la testa.
Nota: Non abbiamo sistematicamente valutato l'utilità di perfusione. Tuttavia, nella nostra esperienza, transcardiac perfusione nei topi giovani questo può essere fatto con quasi il 100% di successo, e che hanno il vantaggio di eliminare bl rossoOOD cellule, che possono interferire con fluorescenza e di imaging. - Tagliare la pelle verso il basso la linea mediana per esporre il cranio.
- Utilizzando iris piegate forbici, tagliare il cranio in mezzo agli occhi, poi a partire dal taglio tra gli occhi, accuratamente tagliato da anteriore a posteriore lungo la linea mediana di sutura facendo attenzione a non danneggiare il cervello sotto.
Nota: La dura di solito viene fuori con il cranio. Se necessario, rimuovere la dura prima di rimuovere accuratamente il cervello. - Utilizzando gioiellerie pinze, leva aprire il cranio e rimuovere con attenzione il cervello, quindi inserire il cervello in soluzione di taglio. Fare attenzione a non danneggiare le cortecce.
- Profondamente anestetizzare un p12-P20 (idealmente p14-18) mouse con ketamina 100 mg / kg e xylaxine 3 mg / kg (o comitato etico comparabili procedura approvata).
2. Preparazione del cervello per affettare
- Preparazione del cervello per il montaggio su vibratome palco.
- Utilizzando una diapositiva segnato con due linee a 90 ° e una linea diagonale a 17 o dalla parte superiore sinistra a destra in basso, si intersecano in cui le due linee si incontrano, posizionare il lato dorsale del cervello fino, utilizzandouna lama di rasoio, rimuovere 2-4 mm del cervello fine rostrale creando una superficie piana.
- Posizionare il lato caudale del cervello sulla superficie piatta di nuova creazione, e allineare la superficie dorsale del cervello con l'orizzontale e la linea mediana del cervello con la linea verticale.
- Allineare la lama di rasoio con la linea 17 o, inclinare il rasoio in un angolo di 30 ° e di rimuovere circa 3 mm della corteccia destra in un doppio taglio diagonale (17 o dal piano orizzontale e 60 o dalla coronale).
- Cervello Montaggio su vibratome palco.
- Mettere un piccolo pezzo di carta da filtro 1 cm x 2 cm sul lato ventrale del cervello in modo che la dimensione lunga è perpendicolare alla linea mediana.
- Applicare delicatamente una piccola quantità di adesivo cianoacrilato alla zona di fronte al blocco d'inversione (ea sinistra del urto).
- Posizionare la doppia faccia del cervello in diagonale taglio al colla in modo che la parte caudale del cervello e romboencefalo sono propped sulla urto e il lato destro del cervello è contro l'arresto.
- Delicatamente premere sul cervello, garantendo che l'intera superficie è a contatto con la camera di affettatura.
3. Ottenere la Colliculo-thalamocortical Slice
- Prendere rapidamente la fase di taglio e posto nel vibratome, riempire il palco con la soluzione di taglio.
- Allineare la lama con la parte superiore (lato ventrale) del cervello.
- Rimuovere 1-1,5 mm dalla parte superiore del cervello, rimuovere 300-500 micron fette e valutare la profondità dopo la rimozione.
Nota: Quando l'IC, il MGB, e il nucleo genicolato laterale (LGN) sono tutte visibili, e il giro dentato costituisce una forma di 'C' prendere uno a due 600 micron fette. Vedere la Figura 3A. - Mettere le fette in camera riscaldata (32 ° C) che tiene.
4. Imaging del Slice
- Preparazione per l'imaging flavoproteina autofluorescenza.
- <li> Preparare aCSF per la perfusione di fetta in una camera di registrazione elettrofisiologica standard bolla aCSF con il 95% O 2/5% di CO 2.
- Tirare elettrodo di vetro per la stimolazione. Si noti che più elettrodi stimolanti diversi e configurazioni (vetro, tungsteno, fibra di carbonio, monopolare, bipolare) tutto il lavoro molto bene in congiunzione con l'imaging flavoproteina autofluorescenza.
- Accendere il computer, la macchina fotografica, micromanipolatore, fonte di luce, software stimolazione, software per immagini.
- Profumato camera di registrazione con ossigenato aCSF, posizionare il ponte personalizzato (disegno disponibile in Materiali Supplementari) per elevare fetta nella camera.
Nota: tasso di perfusione può variare con qualsiasi individuo istituito; 5-15 ml / min è usato qui. - Mettere fetta nella camera, abbassare il livello del liquido nella camera per evitare che la fetta da sollevare dal ponte mentre si posiziona arpa appositamente costruito su fetta, avendo cura di evitare di mettere corde dell'arpa su percorsi di interrelazioneest (Figura 1A). Aumentare il livello del liquido a circa 1-2 mm al di sopra fetta di mantenere il flusso aCSF sopra e sotto la fetta.
Nota: se riposizionamento è necessario, utilizzare l'estremità pipetta Pasteur rotto o consentire il livello aCSF a salire e utilizzare pinze con estrema cura. - Inserire l'elettrodo cloruro d'argento in elettrodo di vetro riempita con aCSF, inserire l'elettrodo di vetro in micromanipolatore e connettersi allo stimolo isolante, e posizionare con cura elettrodo di vetro in IC / sostanza bianca che porta al talamo (vedere Figura 1A).
- Raccogliere immagini a 4 Hz (utilizzando un 2X macro obiettivo infinito corretta (NA 0,13)) e una macchina fotografica per 105 secondi mentre elettricamente stimolante (ogni stimolazione è composto da 1 sec di 40 Hz 2 msec impulsi tessuto a 0,05 Hz cinque volte), mentre l'illuminazione il tessuto con luce blu 470-490 nm e catturare sopra 515 nm. Assicurarsi che l'immagine non è né dio scuro, né spente vedi figura 3 colonna sinistra per riferimento.
Nota: il tempo Collection, frequenza di raccolta, e la frequenza di stimolazione possono essere modificate per soddisfare l'esperimento, il programma personalizzato incluso nel materiale supplementare può essere modificata in quanto tale. - Esportare immagini da Matlab, e utilizzando il programma scritto personalizzato disponibile in materiali supplementari per analizzare spettrale di potenza delle immagini a 0,05 Hz. L'immagine risultante mostrerà percorsi collegati.
Nota: Il programma personalizzato utilizza una trasformata di Fourier dei valori dei pixel nella serie storica per produrre l'immagine.
- Preparare piccola camera di incubazione con un piatto di coltura 3 centimetri e la membrana cultura sollevato per consentire aCSF di raggiungere sia la parte superiore e inferiore della fetta, e posto su una piastra elettrica per mantenere la temperatura a circa 32 ° C.
- Riempire piccola camera di incubazione con aCSF caldo e lentamente la bolla con il 95% O2/5% di CO 2.
- Mescolare 2 ml di acido Pluronic F-127 e 50 microgrammi di Fura-02:00 sciolto in 48 ml di DMSO.
- Luogo fetta piccola camera di incubazione sulla membrana rialzato e con cura utilizzando una micropipetta aggiungere miscela colorazione direttamente sopra la MGB (o altra struttura di interesse).
- Coprite le fette per prevenire lo sbiancamento prima di imaging, e permettono fette di incubare per 45 minuti - 1 ora.
- Rimuovere le fette della camera di tenuta riscaldato per 10-15 minuti per lavare via il materiale in eccesso.
- Seguire i passaggi da 4.1.1 a 4.1.6 per la preparazione di stimolare e immagine la fetta colliculo-talamo-corticale.
- Raccogliere le immagini a 10 Hz (con un obiettivo ad immersione 20X acqua) per 25 sec stimolando elettricamente (ogni stimolazione è costituito da un impulso 2 msec) tessuto a 0,2 Hz cinque volte mentre illumina il tessuto con 365 luce nm e catturare la fluorescenza sopra 510 nm. Esportare immagini da Matlab e utilizzando il programma scritto personalizzato disponibile in materiali supplementari per analizzare spettrale di potenza delle immagini a 0.2 Hz. L'immagine risultante mostrerà cellule attive.
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Representative Results
Un esempio della fetta cervello di topo colliculo-talamocorticale ottenuta nel topo P15 è mostrata in figura 2. La fetta ideale conterrà i quattro principali strutture uditive mesencefalo e prosencefalo IC, MGB, TRN, e AC, che sono tutti attivati quando il circuito integrato è stimolata (Figura 2A). Utilizzando l'analisi di Fourier, la potenza spettrale viene misurato alla frequenza di stimolazione elettrica, con regioni cerebrali collegate mostrano attività che è periodica e trascinato alla frequenza di stimolazione 10. Questo protocollo permette studio del flusso ascendente di informazioni particolarmente nel talamo da nesso tra il mesencefalo e la corteccia. Mentre questo aiuti protocollo nella produzione della fetta colliculo-thalamocortical collegato, oltre a fornire un insieme più facilmente personalizzabile di hardware con l'incorporazione di stampa 3D, inclusi sono un esempio di una fetta non collegato dal talamo alla corteccia (Figura 2B ), un s nonché un modello connettività dove talamo non mostra attività con flavoproteina autofluorescenza immagini (Figura 2C). Ciò è probabilmente dovuto al collegamento essendo interna alla porzione tale che l'attivazione non è sulla superficie della fetta e quindi in grado di essere visto con imaging flavoproteina autofluorescenza. E 'possibile anche se improbabile che questo è l'attivazione antidromic. Non abbiamo visto attivazione antidromic quando stimolando la sostanza bianca delle proiezioni talamocorticali 11, e con questa stimolazione paradigma sinaptica blocco nel talamo provoca una eliminazione reversibile del segnale corticale 1. Usando questa fetta, è anche possibile osservare l'attività popolazione cellulare nel talamo con stimolazione elettrica del IC. Un esperimento campione calcium imaging mostra l'attività spiking di una piccola popolazione di neuroni del talamo in risposta ad uno stimolo mesencefalo (Figura 3).
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Figura 1. Rendering di materiali stampati 3D. (A) Immagine resa della fetta seduta sul ponte con l'arpa stampato in posto. La freccia indica il flusso di aCSF. (B) Immagine resa evidenziando scanalature per le corde dell'arpa consentono la fetta più spessa (cerchi).
Figura 2. Taglio del cervello per affettare. (A) di posizionamento Agar sulla fase di taglio. (B) Presentazione per il posizionamento del cervello. (C) Posizione del cervello per anteriori taglio. (D) Posizione del cervello e del rasoio per doppio taglio angolato. (E) il blocco finale del cervello per affettare .
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Figura 3. flavoproteina autofluorescenza imaging fetta cerebrale colliculo-talamo-corticale. (A) Connesso fetta cervello colliculo-talamo-corticale come confermato da flavoproteina autofluorescenza. La stimolazione elettrica a 0,05 Hz di IC ripreso a 4 Hz e di Fourier elaborato per mostrare il potere alla frequenza di stimolazione. Nota attivazione MGB, TRN e, CA e il corpo striato (CS). (B) Unconnected slice. La stimolazione elettrica di IC con sola attivazione di MGB. Tutto il percorso non è stato catturato probabilmente a causa di 17 o angolo di essere un po 'troppo ripida. (C) l'attivazione atipica di AC. La stimolazione elettrica di IC con l'attivazione di AC senza segnale visibile nel MGB o TRN. Pathway probabile tuttavia intatte le cellule attive della MGB sono suscettibili sull'altro lato del tessuto.
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Figura Raw 20X immagine della MGB 4. Imaging di calcio. (A) immagine grezza di esempio fetta illuminata per l'imaging del calcio. (B), punti luminosi sono cellule. Barra di scala 100μm. (C) Segnale di calcio con la stimolazione elettrica del circuito integrato. Trasformazione di Fourier mostra l'attivazione di entrambe le cellule frecce bianche e neuropil punta di freccia nera. Incasso, naturalmente tempo di segnale di media (riquadro barra della scala variazione dello 0,5% della fluorescenza, 1 sec).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100 x 15 mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35 x10 mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
References
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