Summary
El uso de múltiples ángulos para cortar el cerebro pup ratón, mejoramos sobre una rebanada cerebral agudo descrito previamente-que captura las conexiones entre la mayoría de las principales estructuras del mesencéfalo y el prosencéfalo auditivas.
Introduction
En el sistema auditivo, aunque hay una transformación sustancial de información entre la periferia sensorial y el colículo inferior, hay una considerable procesamiento adicional antes de que alcance la corteza auditiva. Sabemos muy poco acerca de cómo ese proceso se hace y por lo tanto poco acerca de cómo esa transformación permite que el cerebro interpreta la información sensorial entrante. Con la excepción del olfato, cada uno de los sentidos tiene una organización muy similar con señales periféricas inicialmente siendo retransmitido con alta fidelidad que disminuye a medida que la señal asciende a la corteza. La corteza envía proyecciones a las estructuras inferiores para modular aún más la información entrante. Este complejo sistema ha sido estudiado en una variedad de maneras in vivo, así como en un número de preparaciones in vitro. En el primero, todas las conexiones están intactas, lo que permite al investigador para investigar cualquier conjunto de conexiones, mientras que el control de la entrada sensorial y la medición desalida en un área determinada. Con este enfoque, hay poco o ningún control de la gran variedad de otros insumos, incluyendo otros estímulos sensoriales, la excitación y la atención, dando lugar a una salida intensamente compleja. In vitro, rodajas de cerebro han sido cortadas para capturar ya sea un único conjunto de las proyecciones, o dos áreas cerebrales conectados, que permiten a los investigadores para estimular y evaluar los aferentes o áreas cerebrales diferentes. Estos son a menudo ya sea rebanadas thalamocortical o tectothalamic donde ya sea la entrada al tálamo o el tálamo y su salida a la corteza se conservan 2-5. Estas preparaciones permiten una amplia variedad de manipulaciones farmacológicas, eléctricas y optogenética. Sin embargo, con sólo dos regiones del cerebro, que evalúan principalmente la transferencia de información y carecen de la capacidad de evaluar la transformación de la información a medida que pasa a través del tálamo. También la proyección retículo-talámico, que puede desempeñar un papel en la modulación de la atención 6-9 es prESENT en este segmento. Aquí se demuestra mejoras sobre nuestra preparación previa 1, que permite el control investigador de varias entradas al tálamo para dar una perspectiva única de cómo las puertas tálamo y filtros de información. Nos pareja esta nueva preparación rebanada con imágenes de autofluorescencia flavoproteína para evaluar la conectividad rebanada y el análisis de activación a gran escala, imágenes de calcio en el tálamo para el análisis de la población neuronal, y la grabación de una sola célula para medir el impacto de las diversas entradas en un solo nivel celular.
Para ayudar en el mantenimiento de estas conexiones generalizadas también hemos desarrollado una serie de modificaciones del ancla rebanada normal (también conocido como "arpa") para la celebración de la corte de cerebro en su lugar y un puente para elevar la rebanada para mejorar la perfusión. El arpa está diseñado en forma de herradura modificada para rodear el corte y permitir puntos de fijación personalizables para las cuerdas del arpa. Tres cadenas sonadjunta de tal manera que i) se tiende horizontalmente a lo largo del borde medial de la rebanada, ii) Se extiende desde el extremo caudal del IC hasta el extremo caudal de la AC y iii) un extiende diagonalmente desde el borde medial de la rebanada a un área rostral a la AC (ver Figura 1 A). Muescas pequeñas en el marco de pegar (con pegamento de cianoacrilato) del arpa cadenas permiten una disminución en la cantidad de presión sobre el sector para ayudar a mantener la integridad de la rebanada (véase la Figura 1B). Mediante el uso de la impresión tridimensional, somos capaces de arpas de diseño personalizado a nuestras especificaciones únicas, así como los puentes que permiten el flujo ideal de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) encima y debajo del tejido. Esto también mantiene grandes áreas de luz para penetrar en el tejido de la electrofisiología de pinzamiento zonal.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Illinois. Todos los animales fueron alojados en las instalaciones de cuidado de los animales aprobados por la Asociación Americana para la Acreditación del Laboratorio Animal Care. Cada intento se hizo para reducir al mínimo el número de animales utilizados y reducir el sufrimiento en todas las etapas del estudio.
1. Preparación y Extracción de cerebro de ratón para rebanar
- Prepárese para la perfusión y la incubación rebanada.
- Aproximadamente 30 minutos antes de cortar, preparar alta solución de corte sacarosa y baja LCRa calcio para la incubación de la rebanada antes de la grabación o imágenes.
- Coloque todas las herramientas necesarias (grandes tijeras romas finales, pequeñas tijeras de primavera, pinzas anatómicas, grandes tijeras o guillotina, iris tijeras, joyeros fórceps, 10 jeringas ml con aguja 27G x 1/2 pulgadas, pequeña pieza de 1 cm x 2 cm de filtro papel, y una punta de pipeta de Pasteur roto por sltransferencia de hielo) para la perfusión y corte en rodajas, y preparar la bandeja de perfusión.
- Configurar la incubación de cámara con oxigenada LCRa en un baño de agua C 32 o y una placa de cultivo lleno de solución de corte.
- Preparar corte escenario para rebanar.
- Corte un pedazo pequeño de 3% de agar de aproximadamente 1 cm 3 para usar como respaldo para el cerebro y 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm para un bulto que se utilizará para apuntalar la IC.
- Pegue el tope en el escenario con el adhesivo de cianoacrilato, así como la protuberancia en el lado derecho del tope de tal manera que forman un ángulo de 80 °.
- Retire el cerebro.
- Profundamente anestesiar a-p20 p12 (idealmente p14-18) ratón con ketamina 100 mg / kg y xylaxine 3 mg / kg (o comité de ética comparables procedimiento aprobado).
Nota: Confirme el nivel de anestesia adecuado a través de la falta de respuesta a la pizca dedo del pie. Como el animal está bajo anestesia brevemente, pomada oftálmica es innecesaria. - Usando romoterminar tijeras, exponer la caja torácica de la apófisis xifoides hasta el cuello.
- Encuentra el proceso xifoides, y hacer un corte horizontal de aproximadamente 1,5 cm.
- Hacer dos cortes verticales de los extremos del corte horizontal anterior a los hombros, aproximadamente 1,5 cm cada uno.
- Cortar a través del diafragma y las uniones costocondrales para exponer el corazón.
- Con pequeñas tijeras de primavera, hacer un pequeño, 2-5 cortar en la aurícula derecha mm, desde el ventral a dorsal lado del corazón.
- Usando una jeringa de 10 ml con una aguja 27G x 1/2 pulgadas, inyectar el ventrículo izquierdo y perfundir rápidamente el animal con alta solución de corte sacarosa.
- Una vez que la sangre salga clara, utilizar tijeras grandes para quitar de la cabeza.
Nota: No hemos evaluado sistemáticamente la utilidad de la perfusión. Sin embargo, en nuestra experiencia, la perfusión transcardíaca en ratones jóvenes esta se puede hacer con casi el 100% de éxito, y no tienen el beneficio de eliminar bl rojaood células, que pueden emitir fluorescencia e interferir con las imágenes. - Cortar la piel hacia abajo de la línea media para exponer el cráneo.
- Usando iris dobladas tijeras, cortar el cráneo entre los ojos, y luego a partir de la corte entre los ojos, cuidadosamente cortado de anterior a posterior a lo largo de la línea media de la sutura con cuidado de no dañar el cerebro debajo.
Nota: La dura por lo general, se corre con el cráneo. Si es necesario, retire la duramadre antes de retirar cuidadosamente el cerebro. - Usando joyeros fórceps, palanca abrir el cráneo y retire con cuidado el cerebro, a continuación, coloque el cerebro en una solución de corte. Tenga cuidado de no dañar las cortezas.
- Profundamente anestesiar a-p20 p12 (idealmente p14-18) ratón con ketamina 100 mg / kg y xylaxine 3 mg / kg (o comité de ética comparables procedimiento aprobado).
2. Preparación del cerebro para rebanar
- Preparación del cerebro para el montaje en vibratome etapa.
- Usando una diapositiva marcado con dos líneas a 90 o y una línea diagonal a los 17 o desde la parte superior izquierda a la inferior derecha, intersección donde las dos líneas se encuentran, coloque la cara dorsal del cerebro hasta, utilizandouna hoja de afeitar, retire 2-4 mm del cerebro extremo rostral la creación de una superficie plana.
- Coloque el lado caudal del cerebro en la superficie plana de nueva creación, y alinear la superficie dorsal del cerebro con la horizontal y la línea media del cerebro con la línea vertical.
- Alinear la cuchilla de afeitar con la línea 17 o, incline la navaja en un ángulo de 30 ° y quite aproximadamente 3 mm de la corteza justo en un corte diagonal doble (17 o desde el plano horizontal y 60 ° de la corona).
- Montaje cerebro en vibratome etapa.
- Coloque un pequeño trozo de papel de filtro de 1 cm x 2 cm en la parte ventral del cerebro para que la dimensión larga es perpendicular a la línea media.
- Con cuidado aplique una pequeña cantidad de adhesivo de cianoacrilato a la zona delante del antirretorno (y a la izquierda de la protuberancia).
- Coloque el cerebro en diagonal de corte doble en el pegamento de manera que la parte caudal del cerebro y el rombencéfalo son prel op a la protuberancia y el lado derecho del cerebro está en contra del tope trasero.
- Delicadamente presione hacia abajo en el cerebro, lo que garantiza que toda la superficie está en contacto con la cámara de corte.
3. La obtención de la Colliculo-tálamo-cortical Slice
- Tomar rápidamente la etapa de corte y el lugar en el vibratome, llenar el escenario con una solución de corte.
- Alinear la cuchilla con la parte superior (lado ventral) del cerebro.
- Retire 1-1.5 mm de la parte superior del cerebro, retire 300-500 micras rodajas y evaluar a fondo después de la eliminación.
Nota: Cuando la IC, el MGB, y el núcleo geniculado lateral (LGN) son visibles, y el giro dentado forma una forma de 'C' tomar de una a dos 600 micras rodajas. Véase la Figura 3A. - Coloque las rebanadas en caliente (32 ° C) que sostiene la cámara.
4. Obtención de imágenes de la rebanada
- Preparación para la formación de imágenes autofluorescencia flavoproteína.
- <li> Prepare LCRa para la perfusión de la rebanada en una cámara estándar de registro electrofisiológico, LCRa burbuja con 95% de O2 / 5% de CO 2.
- Tire electrodo de vidrio para la estimulación. Tenga en cuenta que varios diferentes electrodos estimulantes y configuraciones (vidrio, tungsteno, fibra de carbono, monopolar, bipolar) todo el trabajo muy bien en conjunto con imágenes autofluorescencia flavoproteína.
- Encienda el ordenador, cámara, micromanipulador, fuente de luz, el software de estimulación, el software de captura de imágenes.
- Perfundir la cámara de grabación con oxigenada LCRa, coloque el puente personalizado (diseño disponible en Materiales Suplementarios) para elevar la rebanada en la cámara.
Nota: tasa de perfusión puede variar con cualquier individuo establecido; 5-15 ml / min se utiliza aquí. - Coloque la rebanada en la cámara, bajar el nivel de líquido en la cámara para evitar el corte de la elevación del puente mientras se coloca arpa especialmente construido sobre rebanada, teniendo cuidado de evitar la colocación de cuerdas del arpa sobre vías de interest (Figura 1A). Aumentar el nivel de líquido de aproximadamente 1-2 mm por encima de la rebanada para mantener el flujo LCRa encima y debajo de la rebanada.
Nota: Si el reposicionamiento es necesario, utilice el final pipeta Pasteur roto o permita que el nivel LCRa a subir y utilizar fórceps con extremo cuidado. - Inserte electrodo de cloruro de plata en el electrodo de vidrio lleno de LCRa, inserte el electrodo de vidrio en micromanipulador y conectarse a los estímulos del aislador, y coloque cuidadosamente electrodo de vidrio en IC / sustancia blanca que lleva a tálamo (ver Figura 1).
- Recoge imágenes a 4 Hz (utilizando un 2X macro objetivo infinito corregido (NA 0.13)) y una cámara de 105 seg, mientras que la estimulación eléctrica (cada estimulación consiste en 1 seg de 40 Hz 2 ms pulsos tejido en 0,05 Hz cinco veces), mientras que ilumina el tejido con azul claro desde 470 hasta 490 nm y por encima de la captura de 515 nm. Asegúrese de que la imagen no es ni dever o oscuro, ni apagada Figura 3 dejó la columna de referencia.
Nota: El tiempo de recolección, la frecuencia de recogida, y la frecuencia de estimulación se pueden cambiar para adaptarse a la experiencia, el programa personalizado incluido en materiales complementarios se pueden modificar como tal. - Exportar imágenes a Matlab, y utilizando el programa escrito de encargo disponible en materiales complementarios para analizar la energía espectral de las imágenes a 0,05 Hz. La imagen resultante mostrará las vías conectados.
Nota: El programa personalizado utiliza una transformada rápida de Fourier de los valores de los píxeles de la serie temporal para producir la imagen.
- Preparar pequeña cámara de incubación utilizando una placa de cultivo de 3 cm y la membrana cultura elevada para permitir LCRa para alcanzar la parte superior e inferior de la rebanada, y colóquelo sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura a aproximadamente 32 ° C
- Rellene pequeña cámara de incubación con LCRa cálido y poco a poco la burbuja con un 95% de O2/5% de CO 2.
- Mezclar 2 l de Pluronic F-127 ácido y 50 g de Fura-2AM disuelto en 48 l de DMSO.
- Lugar rebanada en la pequeña cámara de incubación de la membrana elevada y con cuidado utilizando una micropipeta añadir mezcla de tinción directamente encima del MGB (u otra estructura de interés).
- Cubra las rebanadas para prevenir la decoloración antes de la proyección de imagen, y que permiten rebanadas incubar durante 45 min - 1 hora.
- Retire rebanadas a cámara de retención calentado durante 10-15 minutos para lavar el exceso de material.
- Siga los pasos 4.1.1 al 4.1.6 para la preparación de estimular y la imagen de la rebanada-colliculo tálamo-cortical.
- Recoge imágenes a 10 Hz (con un objetivo de inmersión 20X agua) durante 25 segundos, mientras que la estimulación eléctrica (cada estimulación consiste en un impulso de 2 ms) tejido en 0,2 Hz cinco veces mientras que ilumina el tejido con 365 nm de luz y la captura de fluorescencia por encima de 510 nm. Exportar imágenes a Matlab y utilizando el programa escrito de encargo disponible en materiales complementarios para analizar la energía espectral de las imágenes a 0,2 Hz. La imagen resultante mostrará células activas.
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Representative Results
Un ejemplo de cortes de cerebro de ratón colliculo talamocortical obtenido en P15 ratón se muestra en la figura 2. El corte ideal deberá contener los cuatro grandes estructuras auditivas del cerebro medio y cerebro anterior IC, MGB, TRN, y CA, los cuales están activados cuando el IC es estimulada (Figura 2A). Utilizando el análisis de Fourier, la potencia espectral se mide en la frecuencia de estimulación eléctrica, con las regiones del cerebro que muestran conectados actividad que es periódica y arrastrado a la frecuencia de estimulación 10. Este protocolo permite el estudio del flujo ascendente de la información en particular en el tálamo como nexo entre el cerebro medio y la corteza. Si bien esta ayudas de protocolo en la producción de la rodaja-colliculo talamocortical conectado, así como proporcionar un conjunto más fácilmente personalizable de hardware con la incorporación de la impresión 3D, que incluye son un ejemplo de una rebanada no está conectado desde el tálamo a la corteza (Figura 2B ), la s así como un patrón de conectividad donde el tálamo no muestra actividad con imágenes de autofluorescencia flavoproteína (Figura 2C). Esto es probablemente debido a la conexión de ser interna a la rebanada de tal manera que la activación no está en la superficie de la rebanada y por lo tanto no puede ser visto con la formación de imágenes autofluorescencia flavoproteína. Es posible, aunque poco probable que esta es la activación antidrómica. No hemos visto la activación antidrómica al estimular la sustancia blanca de las proyecciones thalamocortical 11, y con esta estimulación sináptica paradigma de bloqueo en el tálamo provoca una eliminación reversible de la señal cortical 1. El uso de este rebanada, también es posible mirar a la actividad población de células en el tálamo con la estimulación eléctrica del IC. Un experimento de imágenes de calcio ejemplo muestra la actividad spiking de una pequeña población de neuronas talámicas en respuesta a un estímulo del cerebro medio (Figura 3).
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Figura 1. Representación de los materiales impresos en 3D. (A) Imagen rendida de la rebanada que se sienta en el puente con el arpa impresa en su lugar. La flecha indica el flujo de LCRa. (B) Imagen rendida destacando ranuras para las cuerdas del arpa que permitan la rebanada más gruesa (círculos).
Figura 2. Cortar el cerebro para cortar. (A) Agar posicionamiento en el escenario de corte. (B) Deslice para el posicionamiento del cerebro. (C) Posición del cerebro para el corte anterior. (D) Posición del cerebro y la maquinilla de afeitar de doble corte en ángulo. (E) de bloqueo Final del cerebro para rebanar .
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Figura 3. flavoproteína imágenes autofluorescencia de cortes de cerebro-colliculo tálamo-cortical. (A) Conectado cortes de cerebro colliculo-tálamo-cortical como confirmó flavoproteína autofluorescencia. La estimulación eléctrica a 0,05 Hz de IC proyectado en 4 Hz y Fourier procesa para mostrar potencia a la frecuencia de estimulación. Nota activación de MGB, TRN y, AC, así como el cuerpo estriado (CS). (B) rebanada sin conectar. La estimulación eléctrica de IC sólo con la activación de MGB. Toda vía no fue capturado debido probablemente a 17 o ángulo ligeramente demasiado empinada. (C) la activación atípica de AC. La estimulación eléctrica de IC con la activación de CA sin señal visible en el MGB o TRN. Pathway probable intacta sin embargo, las células activas en la MGB es probable en el otro lado del tejido.
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Imagen RAW 20X del MGB figura de imágenes 4. El calcio. (A) Imagen Raw de ejemplo rebanada iluminada por imágenes de calcio. (B), los puntos brillantes son células. Barra de escala 100μm. (C) de la señal de calcio con la estimulación eléctrica del IC. Procesamiento de Fourier muestra la activación de ambas células flechas blancas y neuropil punta de flecha negro. Inserción, evolución temporal de la señal promediada (barra de escala inserción cambio 0,5% de la fluorescencia, 1 seg).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100 x 15 mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35 x10 mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
References
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