Summary
L'utilisation de plusieurs angles à couper le cerveau des petits de la souris, nous améliorons sur une tranche de cerveau aiguë décrite précédemment qui capture les liens entre la plupart des grands du mésencéphale et du cerveau antérieur structures auditives.
Introduction
Dans le système auditif, bien qu'il y ait une transformation substantielle d'informations entre la périphérie sensorielle et le colliculus inférieur, il existe un traitement supplémentaire considérable avant d'atteindre le cortex auditif. Nous savons très peu sur la façon dont la transformation est effectuée et donc peu sur la façon dont cette transformation permet au cerveau pour interpréter l'information sensorielle entrante. À l'exception de l'olfaction, chacun des sens a une organisation très similaire avec les signaux périphériques étant initialement relayés avec une haute fidélité qui diminue à mesure que le signal monte au cortex. Le cortex envoie alors projections aux structures inférieures à moduler davantage l'information entrante. Ce système complexe a été étudiée dans une variété de manières in vivo, ainsi que dans un certain nombre de préparations in vitro. Dans le premier, toutes les connexions sont intactes, ce qui permet au chercheur de sonder tout ensemble de connexions, tout en contrôlant l'entrée sensorielle et mesuresortie dans une zone donnée. Avec cette approche, il ya peu ou pas de contrôle de la grande variété d'autres intrants, y compris d'autres entrées sensorielles, l'excitation et l'attention, donnant lieu à une sortie intensément complexe. In vitro, des tranches de cerveau ont été coupés pour capturer soit un ensemble unique des projections, ou deux zones du cerveau connectés, qui permettent aux chercheurs de stimuler et évaluer afférences ou zones cérébrales différentes. Ce sont souvent des tranches soit thalamocorticales ou tectothalamic où soit l'entrée du thalamus ou du thalamus et sa sortie vers le cortex sont conservés 5.2. Ces préparations permettent une grande variété de manipulations pharmacologiques, électriques et optogénétiques. Cependant, avec seulement deux régions du cerveau, ils évaluent essentiellement le transfert d'informations et manquent de la capacité d'évaluer la transformation de l'information qui passe dans le thalamus. Aussi la projection de réticulo-thalamique, qui peuvent jouer un rôle dans l'attention modulation 6-9 est prESENT dans cette tranche. Ici, nous démontrons améliorations sur notre préparation précédente 1, qui permet le contrôle de l'investigateur de diverses entrées du thalamus pour donner une perspective unique de la façon dont les portes thalamus et filtres informations. Nous coupler cette nouvelle préparation de tranche avec l'imagerie flavoprotéine d'autofluorescence pour évaluer la connectivité de tranche et l'analyse d'activation à grande échelle, l'imagerie de calcium dans le thalamus pour neuronale analyse de la population, et l'enregistrement d'une cellule unique de mesurer l'impact des différentes entrées au niveau de la cellule unique.
Pour aider à maintenir ces relations étendues, nous avons également développé un certain nombre de modifications de l'ancrage de la tranche normale (aka "harpe") pour maintenir la tranche de cerveau en place et un pont pour élever la tranche pour perfusion améliorée. La harpe est conçu en forme de fer à cheval modifié pour entourer la tranche et permettrait aux points de fixation personnalisables pour les cordes de la harpe. Trois chaînes sontattaché de telle sorte que i) une se trouve à l'horizontale le long du bord interne de la tranche, ii) on étend à partir du bord extrême de la puce vers le bord caudal du secteur et iii) une prolonge en diagonale à partir du bord interne de la tranche à une zone rostrale à l'AC (voir la figure 1A). Petites indentations dans le cadre pour le collage (avec de la colle cyanoacrylate) de la harpe cordes permettent une diminution de la quantité de pression sur la tranche pour aider à maintenir l'intégrité de la tranche (voir la figure 1B). En utilisant l'impression en trois dimensions, nous sommes en mesure de harpes de conception personnalisée à nos spécifications uniques, ainsi que des ponts qui permettent l'écoulement idéal de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) dessus et en dessous du tissu. Cela maintient également de grandes zones à la lumière pour pénétrer dans le tissu pour le patch clamp électrophysiologie.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université de l'Illinois. Tous les animaux ont été logés dans des installations de soins des animaux approuvées par l'Association américaine pour l'accréditation du Laboratoire de protection des animaux. Tout a été fait pour réduire au minimum le nombre d'animaux utilisés et de réduire la souffrance à toutes les étapes de l'étude.
1. Préparation et suppression de Brain de souris pour le tranchage
- Préparez-vous à perfusion et une tranche incubation.
- Environ 30 min avant de trancher, préparer une solution de saccharose de coupe haute et basse aCSF de calcium pour l'incubation de la tranche avant l'enregistrement ou l'imagerie.
- Disposez tous les outils nécessaires (grands ciseaux émoussés finaux, petits ciseaux à ressort, forceps anatomiques, de grands ciseaux ou d'une guillotine, iris ciseaux, bijoutiers forceps, seringue de 10 ml avec une aiguille 27G x 1/2 pouces, petit morceau de 1 cm x 2 cm filtres papier, et un bout pipette Pasteur rompu pour sltransfert de la glace) pour perfusion et tranchage, et préparer plateau de perfusion.
- Mettre en place la chambre avec oxygénée aCSF incubation dans un bain-marie à 32 o et une boîte de culture rempli de solution de coupe.
- Préparer étape de coupe pour trancher.
- Coupez un petit morceau de 3% de gélose environ 1 cm 3 pour l'utiliser comme un filet de sécurité pour le cerveau et 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm pour une bosse à être utilisé pour soutenir l'IC.
- Coller la butée sur la scène avec de la colle cyanoacrylate ainsi que la bosse sur le côté droit de la butée de telle sorte qu'elles forment un angle de 80 o.
- Retirer le cerveau.
- Profondément anesthésier une p12-p20 (idéalement p14-18) de la souris avec la kétamine 100 mg / kg et xylaxine 3 mg / kg (ou comité d'éthique comparables procédure approuvée).
Remarque: Confirmation du niveau d'anesthésie appropriée par l'absence de réponse à pincement de l'orteil. Comme l'animal est sous anesthésie brièvement, pommade ophtalmique est inutile. - Utilisation émousséefin ciseaux, exposer la cage thoracique de la pointe du sternum à la nuque.
- Trouver la pointe du sternum, et faire une coupe horizontale d'environ 1,5 cm.
- Faites deux coupes verticales à partir des extrémités de la coupe horizontale précédente sur les épaules, d'environ 1,5 cm chaque.
- Couper à travers le diaphragme et les jonctions costochondral pour exposer le coeur.
- Avec de petits ciseaux à ressort, faire une petite, 2-5 mm couper dans l'oreillette droite, à partir de la dorsale ventrale à côté du cœur.
- En utilisant une seringue de 10 ml avec une aiguille 27G x 1/2 pouces, injecter le ventricule gauche et perfuser rapidement l'animal avec une solution de saccharose coupe élevé.
- Une fois que le sang soit claire, utiliser de plus grandes ciseaux pour enlever la tête.
Note: Nous avons pas systématiquement évalué l'utilité de la perfusion. Cependant, dans notre expérience, transcardiaque perfusion chez les souris jeunes ce qui peut être fait avec près de 100% de réussite, et a l'avantage d'éliminer bl rougecellules Ood, peut fluo, et des interférences avec l'imagerie. - Couper la peau vers le bas de la ligne médiane pour exposer le crâne.
- Utilisation iris pliés ciseaux, couper le crâne entre les yeux, puis à partir de la coupure entre les yeux, couper soigneusement d'avant en arrière le long de la ligne médiane de suture en prenant soin de ne pas endommager le cerveau en dessous.
Remarque: La dure vient habituellement hors du crâne. Si nécessaire, retirez la dure-mère avant de retirer soigneusement le cerveau. - Utilisation bijoutiers pince, levier ouvrir le crâne et retirez soigneusement le cerveau, puis placez le cerveau dans une solution de coupe. Prenez soin de ne pas endommager le cortex.
- Profondément anesthésier une p12-p20 (idéalement p14-18) de la souris avec la kétamine 100 mg / kg et xylaxine 3 mg / kg (ou comité d'éthique comparables procédure approuvée).
2. Préparation de cerveau pour le tranchage
- Préparation cerveau pour le montage sur vibratome scène.
- En utilisant une lame marquée par deux lignes à 90 ° et une ligne diagonale à 17 o à partir du haut de gauche à droite en bas, coupant où les deux lignes se rencontrent, placez le côté cérébral dorsale jusqu'à, en utilisantune lame de rasoir, retirer 2-4 mm de l'extrémité rostrale du cerveau créer une surface plane.
- Placez le côté caudal du cerveau sur la surface plane nouvellement créée, et aligner la surface dorsale du cerveau avec l'horizontale et la ligne médiane du cerveau avec la ligne verticale.
- Aligner la lame de rasoir avec la ligne 17 de o, inclinez le rasoir à un angle de 30 o et enlever environ 3 mm du cortex droit dans une coupe en diagonale à double (17 o de plan horizontal et 60 o de la coronale).
- Montage sur le cerveau vibratome scène.
- Placer un petit morceau de papier filtre de 1 cm x 2 cm sur la face ventrale du cerveau de sorte que la dimension longue est perpendiculaire à la ligne médiane.
- Soigneusement appliquer une petite quantité de colle cyanoacrylate à la zone en face de la butée arrière (et à gauche de la bosse).
- Placez le double visage du cerveau en diagonale coupé à la colle de sorte que la partie caudale du cerveau et du cerveau postérieur sont proppé sur la bosse et le côté droit du cerveau est contre la butée.
- Délicatement Appuyez sur le cerveau, veiller à ce que toute la surface est en contact avec la chambre de tranchage.
3. Obtenir l'Colliculo-thalamocortical Slice
- De prendre rapidement l'étape de coupe et le placer dans le vibratome, remplir la scène avec une solution de coupe.
- Alignez la lame avec le haut (côté ventral) du cerveau.
- Retirer 1-1,5 mm de la partie supérieure du cerveau, retirez 300-500 um tranches et d'évaluer la profondeur après l'enlèvement.
Remarque: Lors de la CI, le MGB et le corps genouillé latéral (CGL) sont tous visibles, et le gyrus denté forme une forme de «C» de prendre une à deux tranches de 600 um. Voir la figure 3A. - Placer les tranches de chambre chauffée (32 ° C) tenant.
4. Imagerie de la tranche
- Préparation pour l'imagerie flavoprotéine d'autofluorescence.
- <li> Préparez aCSF pour la perfusion de la tranche dans une chambre d'enregistrement électrophysiologique standard, bulle aCSF avec 95% de O 2/5% de CO 2.
- Tirez électrode de verre pour la stimulation. Notez que plusieurs différentes électrodes de stimulation et de configurations (verre, le tungstène, la fibre de carbone, monopolaire, bipolaire) tous les travaux très bien en conjonction avec l'imagerie flavoprotéine d'autofluorescence.
- Tournez sur le logiciel de capture d'image logiciel de stimulation ordinateur, caméra, micromanipulateur, source de lumière,,.
- Perfuser la chambre d'enregistrement avec oxygénée aCSF, placez pont personnalisé (de conception disponibles dans des matériaux supplémentaires) pour élever tranche dans la chambre.
Remarque: le taux de perfusion peut varier avec tout individu mis en place; 5-15 ml / min est utilisé ici. - Placez une tranche dans la chambre, abaisser le niveau de liquide dans la chambre pour empêcher la tranche de levage du pont tout en plaçant la harpe spécialement construit sur tranche, en prenant soin d'éviter de placer cordes de la harpe sur les voies d'interest (figure 1A). Augmenter le niveau de liquide à environ 1-2 mm au-dessus tranche pour maintenir le débit aCSF dessus et en dessous tranche.
Remarque: Si un repositionnement est nécessaire, utiliser la fin pipette Pasteur cassé ou laisser le niveau de aCSF se lever et utiliser une pince avec un soin extrême. - Insérez argent électrode de chlorure dans électrode de verre rempli de aCSF, insérez l'électrode de verre dans micromanipulateur et se connecter à un stimulus isolateur, et placer soigneusement l'électrode de verre dans IC / matière blanche conduisant à thalamus (voir la figure 1A).
- Recueillir des images à 4 Hz (en utilisant un 2X macro objectif corrigé à l'infini (NA 0,13)) et une caméra pour 105 sec tout en stimulant électriquement (chaque stimulation se compose de 1 sec de 40 Hz 2 ms impulsions tissus à 0,05 Hz cinq fois) tout en éclairant le tissu avec la lumière bleue de 470 à 490 nm et la capture ci-dessus 515 nm. Assurez-vous que l'image est ni àVoir o sombre, ni soufflé Figure 3 colonne de gauche pour référence.
Remarque: le temps de la collection, la fréquence de collecte, et la fréquence de stimulation peuvent être modifiés en fonction de l'expérience, le programme personnalisé inclus dans du matériel supplémentaire peut être modifiée en tant que telle. - Exporter des images vers Matlab, et en utilisant le programme écrit sur mesure disponibles dans des matériaux supplémentaires pour analyser la puissance spectrale des images à 0,05 Hz. L'image résultante montrera voies connectés.
Remarque: Le programme personnalisé utilise une transformée de Fourier rapide des valeurs de pixels dans la série de temps pour produire l'image.
- Préparer petite chambre d'incubation à l'aide d'une boîte de culture de 3 cm et la membrane de culture soulevé pour permettre aCSF pour atteindre à la fois le haut et le bas de la tranche, et le placer sur un coussin chauffant pour maintenir la température à environ 32 ° C
- Remplissez petite chambre d'incubation avec aCSF chaude et lentement bulle avec 95% d'O2/5% de CO 2.
- Mélanger 2 pi de pluronique acide F-127 et 50 pg de Fura-2 heures dissous dans 48 pi de DMSO.
- Lieu tranche dans la petite chambre d'incubation sur la membrane soulevée et soigneusement à l'aide d'une micropipette Ajouter le mélange de coloration directement au-dessus de la BTP (ou autre structure d'intérêt).
- Couvrir de tranches pour prévenir le blanchiment avant l'imagerie, et permettent tranches à incuber pendant 45 min - 1 h.
- Retirer les tranches de chambre de retenue chauffée pendant 10-15 min pour laver l'excès de matériau.
- Suivez les étapes 4.1.1 à 4.1.6 pour la préparation à stimuler et à l'image de la tranche de colliculo-thalamocortical.
- Recueillir des images à 10 Hz (en utilisant un objectif à immersion 20X d'eau) pendant 25 secondes tout en stimulant électriquement (chaque stimulation se compose d'une impulsion de 2 ms) tissu à 0,2 Hz cinq fois tout en éclairant le tissu avec 365 nm de lumière et la capture de fluorescence au-dessus de 510 nm. Exporter des images vers Matlab et en utilisant le programme écrit sur mesure disponibles dans des matériaux supplémentaires pour analyser la puissance spectrale des images à 0,2 Hz. L'image résultante montrera cellules actives.
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Representative Results
Un exemple de cerveau de souris tranche de colliculo-thalamocortical obtenu dans P15 souris est présentée dans la figure 2. La tranche idéal contiendra les quatre grandes structures auditives mésencéphale et du cerveau antérieur IC, MGB, TRN, et AC, qui sont tous activés lorsque l'IC est stimulée (figure 2A). En utilisant l'analyse de Fourier, la puissance spectrale est mesurée à la fréquence de la stimulation électrique, avec des régions cérébrales liées présentant une activité qui est périodique et entraîné à la fréquence de stimulation 10. Ce protocole permet l'étude de l'écoulement ascendant d'informations particulier dans le thalamus comme un lien entre le mésencéphale et le cortex. Bien que ce protocole aides à la production de la tranche de colliculo-thalamocortical connecté ainsi que de fournir un ensemble plus facilement personnalisable du matériel avec l'incorporation de l'impression 3D, inclus sont un exemple d'une tranche non connecté du thalamus au cortex (figure 2B ), un s ainsi que d'un modèle de connectivité où le thalamus ne montre pas d'activité avec flavoprotéine autofluorescence imagerie (figure 2C). Cela est probablement dû à la liaison étant interne à la tranche de telle sorte que l'activation ne figure pas sur la surface de la tranche et donc incapable d'être vu avec la formation d'image d'autofluorescence flavoprotéine. Il est possible bien que peu probable que cette activation est antidromique. On n'a pas vu lors de la stimulation antidromique activation de la substance blanche des saillies thalamocorticales 11, et avec ce paradigme stimulation synaptique blocage dans le thalamus provoque une élimination réversible du signal cortical 1. L'utilisation de cette tranche, il est également possible d'examiner l'activité de la population de cellules dans le thalamus avec la stimulation électrique du circuit intégré. Une expérience d'imagerie de calcium de l'échantillon montre l'activité de dopage d'une petite population de neurones thalamiques en réponse à un stimulus mésencéphale (figure 3).
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Figure 1. Rendu 3D de matériaux imprimés. (A) a rendu l'image de la tranche assis sur le pont avec la harpe imprimé en place. La flèche indique le flux de aCSF. (B) image rendue soulignant rainures pour les cordes de la harpe permettant la tranche épaisse (cercles).
Figure 2. Couper le cerveau pour le tranchage. (A) de positionnement Agar sur la scène de coupe. (B) Faites glisser pour le positionnement du cerveau. (C) Position du cerveau antérieur coupé. (D) Position du cerveau et rasoir pour le double coupe en biais. (E) blocage final du cerveau pour le tranchage .
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Figure 3. flavoprotéine autofluorescence imagerie de colliculo-thalamocortical tranche de cerveau. (A) Connecté colliculo-thalamocortical tranche de cerveau tel que confirmé par flavoprotéine autofluorescence. La stimulation électrique à 0,05 Hz de IC imagée à 4 Hz et Fourier traitée pour montrer la puissance à la fréquence de stimulation. Remarque activation de MGB, TRN et AC ainsi que le corps strié (CS). (B) tranche Unconnected. La stimulation électrique des IC avec seulement activation de MGB. Toute voie n'a pas été capturé probablement due à 17 o angle étant un peu trop raide. (C) activation atypique de l'AC. La stimulation électrique des IC avec l'activation de l'AC sans signal visible dans le BTP ou TRN. Chemin probablement intact cependant les cellules actives du MGB sont susceptibles de l'autre côté du tissu.
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Figure 4. imagerie de calcium. (A) de l'image RAW d'exemple tranche illuminée pour l'imagerie de calcium. (B) de l'image RAW 20X de la BTP, des points brillants sont des cellules. La barre d'échelle 100 um. (C) du signal de calcium avec la stimulation électrique du circuit intégré. Traitement de Fourier montre activation des deux cellules flèches blanches et neuropile flèche noire. En médaillon, cours du temps de signal moyen (en médaillon de barre d'échelle de variation de 0,5% de la fluorescence, 1 sec).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100 x 15 mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35 x10 mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
References
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