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Neuroscience

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

Published: September 18, 2015 doi: 10.3791/53067

Summary

Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst.

Introduction

Im auditorischen System, obwohl es eine wesentliche Verarbeitung von Informationen zwischen der sensorischen Peripherie und dem Colliculus inferior, gibt es erhebliche zusätzliche Verarbeitung, bevor es den auditorischen Cortex erreicht. Wir wissen sehr wenig darüber, wie die Verarbeitung durchgeführt wird und deshalb wenig darüber, wie die Transformation ermöglicht es dem Gehirn, um eingehende sensorische Information zu interpretieren. Mit Ausnahme des Geruchssinns, hat jede der Richtungen eine sehr ähnliche Organisation mit Peripheriesignale anfänglich mit hoher Wiedergabetreue, die als das Signal steigt zum Cortex lehnt weitergeleitet. Der Cortex sendet dann Projektionen zu den unteren Strukturen weiter zu modulieren, die eingehenden Informationen. Dieses komplexe System in eine Vielzahl von Arten sowohl in vivo als auch in einer Reihe von in vitro-Präparationen untersucht. In der ehemaligen, alle Verbindungen intakt sind, so dass die Forscher, jede Menge von Verbindungen zu untersuchen, während die sensorischen Input und MessenAusgabe in einem bestimmten Gebiet. Mit diesem Ansatz gibt es wenig bis gar keine Kontrolle über die große Auswahl an anderen Eingängen, einschließlich anderer Sinneseindrücke, Erregung und Aufmerksamkeit, was zu einem intensiv komplexe Ausgangs. In vitro Hirnschnitten geschnitten worden, um entweder einen einzigen Satz zu erfassen von Vorsprüngen oder zwei verbundenen Hirnareale, die Forscher zu stimulieren und zu evaluieren verschiedene Afferenzen oder Gehirnbereiche zu ermöglichen. Diese sind häufig entweder thalamocortical oder tectothalamic Scheiben, bei denen entweder der Eingang für den Thalamus oder den Thalamus und dessen Ausgang mit dem Kortex bewahrt 2-5. Diese Präparate ermöglichen eine Vielzahl von pharmakologischen, elektrischen und optogenetischen Manipulationen. Jedoch mit nur zwei Hirnregionen, sie in erster Linie zu bewerten die Übertragung von Informationen und die Fähigkeit fehlt, die Umwandlung von Informationen auswerten, wenn er durch den Thalamus läuft. Auch die reticulo-Thalamus-Projektion, die in der Aufmerksamkeit Modulation eine Rolle spielen kann 6-9 prESENT in dieser Scheibe. Hier zeigen wir Verbesserungen an unseren früheren Herstellungsbeispiel 1, das die Ermittler Steuerung verschiedener Eingänge zum Thalamus ermöglicht, eine einzigartige Perspektive, wie Thalamus Toren und Filter Informationen. Wir Paar dieser Roman Schnittpräparat mit Flavoprotein Autofluoreszenz für die Beurteilung der Scheibe Konnektivität und groß angelegte Aktivierungsanalyse, Kalzium-Imaging im Thalamus zur neuronalen Populationsanalyse und Einzelzellableitung, um die Auswirkungen der verschiedenen Eingänge auf einer Einzelzellebene zu messen.

Um bei der Aufrechterhaltung dieser weit verbreiteten Verbindungen unterstützen wir auch zum Halten der Hirnschnitt an Ort und Stelle und eine Brücke, um die Scheibe für eine verbesserte Durchblutung zu erhöhen entwickelt eine Reihe von Änderungen des normalen Schichtanker (aka "harp"). Die Harfe wird in einer modifizierten Hufeisenform entwickelt, um die Scheibe zu umgeben und ermöglichen anpassbare Befestigungspunkte für die Harfensaiten. Drei Saitenangebracht ist, dass i) eine horizontal liegt entlang der medialen Rand der Scheibe, ii) eine sich von der kaudalen Rand des IC bis zum kaudalen Rand des AC und iii) eines diagonal von der medialen Rand der Scheibe in einen Bereich erstreckt, rostral des AC (siehe 1A). Kleine Vertiefungen in dem Rahmen zum Kleben (mit Sekundenkleber) der Harfensaiten ermöglichen eine verringerte Menge an Druck auf die Scheibe zur Aufrechterhaltung Scheibe Integrität (siehe Abbildung 1B). Durch die Verwendung von dreidimensionalen Drucken, können wir kundenspezifisch anfertigen Harfen unserer einzigartigen Spezifikationen, sowie Brücken, die für eine ideale Strömung des künstlichen Liquor (aCSF) oberhalb und unterhalb des Gewebes zu ermöglichen. Dies hält auch große Flächen für Licht, um das Gewebe für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie zu durchdringen.

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Protocol

Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Illinois zugelassen. Alle Tiere wurden in der Tierbetreuungseinrichtungen von der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care genehmigt gebracht. Jeder Versuch unternommen wurde, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren und Leid in allen Phasen der Studie zu reduzieren.

1. Vorbereitung und Beseitigung von Gehirn von Maus für Slicing

  1. Bereiten Sie für die Perfusion und Scheibe Inkubation.
    1. Etwa 30 Minuten vor dem Schneiden, bereiten hohen Saccharose Schneidlösung und niedrige Kalzium aCSF für die Inkubation der Scheibe vor der Aufzeichnung oder Abbildung.
    2. Legen Sie alle notwendigen Werkzeuge (große stumpfe Ende Schere, kleine Feder Schere, anatomische Pinzetten, große Schere oder Guillotine, Iris Schere, Juweliere Zangen, 10 ml Spritze mit 27G x 1/2 Zoll Nadel, kleines Stück von 1 cm x 2 cm Filter Papier und ein gebrochen gekippt Pasteur-Pipette für slEis-Transfer) für die Durchblutung und Schneiden, und bereiten Perfusion Fach.
    3. Up Inkubation Kammer mit sauerstoff aCSF in einem 32 ° C Wasserbad und einer Kulturschale mit Schnittlösung gefüllt wird.
  2. Bereiten Schneidphase für das Schneiden.
    1. Schneiden Sie ein kleines Stück von 3% Agar etwa 1 cm 3 als Rücklaufsperre für das Gehirn und 1,5 cm x 1,5 x 3 mm für eine Beule zu verwenden, um zur Stützung der IC werden.
    2. Kleben die Rücklaufsperre auf die Bühne mit Cyanacrylatkleber sowie die Höcker auf der rechten Seite der Rücklaufsperre derart, dass sie eine 80 o Winkel bilden.
  3. Entfernen Sie das Gehirn.
    1. Tief betäuben eine p12-p20 (idealer p14-18) Maus mit Ketamin 100 mg / kg und xylaxine 3 mg / kg (oder vergleichbar Ethikkommission genehmigten Verfahren).
      Hinweis: Bestätigen Sie die richtige Anästhesie Ebene über mangelnde Reaktion bis zu den Zehen Prise. Das Tier unter Narkose ist kurz gesagt, Augensalbe unnötig.
    2. Verwendung stumpfeEnde Schere, setzen den Brustkorb von der Schwertfortsatz bis zum Hals.
      1. Finden Sie den Schwertfortsatz, und machen einen horizontalen Schnitt von ca. 1,5 cm.
      2. Machen Sie zwei vertikale Schnitte von den Enden der vorherigen horizontalen Schnitt bis zu den Schultern, etwa 1,5 cm jeweils.
    3. Durch die Membran und den kostochondralen Gängen geschnitten, um das Herz freizulegen.
    4. Mit kleinen Federschere, machen Sie eine kleine, 2-5 mm im rechten Vorhof geschnitten, von der ventralen zur Seite des Herzens dorsal.
    5. Mit einem 10-ml-Spritze mit einer 27G x 1/2 Zoll Nadel, spritzen den linken Ventrikel und schnell durchströmen das Tier mit hohen Saccharose Schneidelösung.
    6. Sobald das Blut läuft klar, verwenden Sie größere Schere, um den Kopf zu entfernen.
      Hinweis: Wir haben noch nicht systematisch den Nutzen der Perfusions bewertet. Aber nach unserer Erfahrung transcardiac Perfusion bei Mäusen dieser junge mit nahezu 100% Erfolg durchgeführt werden und hat den Vorteil der Beseitigung der roten blood-Zellen, die fluoreszieren und stören Bildgebung kann.
    7. Schneiden Sie die Haut nach unten die Mittellinie, um den Schädel freizulegen.
    8. Verwendung gebogen Iris Schere, schnitt den Schädel zwischen den Augen, dann ausgehend von der Schnitt zwischen den Augen, sorgfältig von anterior geschnitten, um entlang der Mittellinie Naht kümmert sich nicht um das Gehirn unter beschädigen posterior.
      Hinweis: Die Dura kommt in der Regel mit dem Schädel. Entfernen Sie gegebenenfalls die Dura, bevor sorgfältig Entfernen des Gehirns.
    9. Verwendung Juweliere Zangen, hebeln Sie den Schädel und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn, dann das Gehirn in Schnittlösung. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Rinden.

2. Vorbereitung Gehirn für Slicing

  1. Vorbereiten des Gehirns für die Montage auf Vibratom Bühne.
    1. Mit Hilfe eines Objektträgers mit zwei Linien bei 90 o markiert und eine diagonale Linie bei 17 o von oben links nach unten rechts, wo die beiden sich kreuzenden Linien treffen, legen Sie die Gehirnrückenseite auf, miteine Rasierklinge, entfernen 2-4 mm des rostralen Ende Gehirn die Schaffung einer ebenen Fläche.
    2. Legen Sie das Gehirn Schwanzseite nach oben auf die neu geschaffene flache Oberfläche, und richten Sie die dorsale Oberfläche des Gehirns mit der horizontalen und der Mittellinie des Gehirns mit der vertikalen Linie.
    3. Richten Sie die Rasierklinge mit der 17 O-Leitung, kippen Sie den Rasierer in einem 30 ° Winkel und entfernen Sie etwa 3 mm von der rechten Cortex im Doppelschrägschnitt (17 o von der horizontalen Ebene und 60 o von der koronalen).
  2. Montage Hirn auf Vibratom Bühne.
    1. Stellen ein kleines Stück Filterpapier 1 cm x 2 cm auf der ventralen Seite des Gehirns, so daß die lange Abmessung rechtwinklig zu der Mittellinie.
    2. Eine kleine Menge von Cyanacrylatkleber vorsichtig auf der den Bereich vor der Rücklaufsperre (und links des Höckers).
    3. Der doppelte diagonal geschnitten Gehirn Gesicht auf den Leim, so dass der kaudalen Teil des Gehirns und Hinterhirn sind prgeopt auf dem Höcker und der rechten Seite des Gehirns, ist gegen die Rücklaufsperre.
    4. Zart unten drücken Gehirn, so dass die gesamte Oberfläche in Kontakt mit der Schneidkammer.

3. Abrufen der Colliculo-thalamokortikalen Scheibe

  1. Nehmen schnell die Schnitt Bühne und Platz in der Vibratom, füllen die Bühne mit modern Lösung.
  2. Richten Sie die Klinge mit der Spitze (Bauchseite) des Gehirns.
  3. Entfernen 1-1,5 mm von der Spitze des Gehirns, entfernen 300-500 & mgr; m Scheiben und bewerten Tiefe nach Entfernen.
    Hinweis: Wenn der IC, der MGB und das Corpus geniculatum laterale (LGN) sind sichtbar, und der Gyrus dentatus bildet ein "C" Form annehmen 1.59 600 um Scheiben schneiden. Siehe 3A.
  4. Die Scheiben in beheizten (32 ° C) Aufnahmekammer.

4. Imaging der Scheibe

  1. Vorbereitung für Flavoprotein Autofluoreszenz-Bildgebung.
      <li> Bereiten aCSF für die Perfusion von slice in einem Standard-elektrophysiologischen Aufzeichnungskammer, bubble aCSF mit 95% O 2/5% CO 2.
    1. Ziehen Glaselektrode für die Stimulation. Man beachte, dass mehrere verschiedene Stimulationselektroden und Konfigurationen (Glas, Wolfram, Kohlenstoff-Faser, monopolar, bipolar) alle Arbeiten sehr gut in Verbindung mit Flavoprotein Autofluoreszenz.
    2. Schalten Sie Computer, Kamera, Mikromanipulator, Lichtquelle, Stimulationssoftware, Bildaufnahmesoftware.
    3. Perfundieren die Aufnahmekammer mit sauerstoff aCSF, legen Sie benutzerdefinierte Brücke (Design-in Zusätzliche Materialien verfügbar), um Scheibe in der Kammer zu erhöhen.
      Hinweis: Perfusionsrate kann mit jeder einzelnen Einrichtung zu variieren; 5-15 ml / min zum Einsatz.
    4. Zeigen Scheibe in der Kammer, senken Sie den Füllstand in der Kammer, um die Scheibe vom Abheben der Brücke zu verhindern, während Platzierung speziell konstruierten Harfe über Scheibe, wobei darauf zu vermeiden, dass Harfensaiten über Wege der interest (Abbildung 1A). Erhöhen Flüssigkeitspegel auf ca. 1-2 mm über Slice aCSF Satz ober- und unterhalb Scheibe zu halten.
      Hinweis: Wenn Neupositionierung notwendig ist, verwenden Sie den gebrochenen Ende Pasteur-Pipette oder erlauben dem aCSF Ebene zu erheben und verwenden Pinzette mit äußerster Vorsicht.
    5. Legen Silberchlorid-Elektrode in die Glaselektrode mit aCSF gefüllt, legen Sie die Glaselektrode in die Mikromanipulator und eine Verbindung zum Isolator Reiz, und sorgfältig zu platzieren Glaselektrode in IC / weißen Substanz, die zu Thalamus (siehe 1A).
  2. Flavoprotein Autofluoreszenzbildaufnahme.
    1. Sammeln Bilder bei 4 Hz (mit einem unendlich korrigierte 2X Makro-Objektiv (NA 0,13)) und eine Kamera für 105 sec, während die elektrische Stimulation (jeder Stimulation besteht aus 1 s von 40 Hz 2 msec Impulse Gewebe bei 0,05 Hz fünfmal) während Beleuchtungs das Gewebe mit blauem Licht von 470 bis 490 nm und die Erfassung über 515 nm. Damit das Bild ist weder zuo dunkler, noch ausgeblasen siehe Abbildung 3 auf der linken Seite als Referenz.
      Hinweis: Sammelzeit, Sammlung Frequenz und Stimulationsfrequenz kann geändert werden, um das Experiment, das benutzerdefinierte Programm ergänzende Materialien enthalten können als solche geändert werden, zu entsprechen.
    2. Export von Bildern in Matlab, und mit Hilfe der benutzerdefinierten geschriebenes Programm in Zusatzmaterialien zum spektralen Leistungs der Bilder bei 0,05 Hz zu analysieren. Das resultierende Bild wird angeschlossene Signalwege zu zeigen.
      Hinweis: Der individuelle Programm verwendet eine schnelle Fourier-Transformation der Pixelwerte in der Zeitreihe, um das Bild zu erzeugen.
  3. Vorbereitung für die Kalzium-Imaging.
    1. Bereiten Sie kleine Inkubationskammer mit einem 3 cm Kulturschale und hob Kulturmembran, damit aCSF, um sowohl die Ober- und Unterseite der Scheibe, und auf ein Heizkissen erreichen Temperatur bei ca. 32 o C zu erhalten
    2. Füllen Sie kleine Inkubationskammer mit warmem aCSF und langsam Blase mit 95% O2/5% CO 2.
    3. Mischungs 2 ul Pluronic F-127 Säure und 50 ug Fura-2AM in 48 ul DMSO gelöst.
    4. Platz Scheibe in kleinen Inkubationskammer auf erhöhten Membran und sorgfältig mit einer Mikropipette hinzufügen Färbemischung direkt über der MGB (oder eine andere Struktur von Interesse).
    5. Bedeckung Scheiben Bleichen vor der Bilderzeugung zu verhindern und zu ermöglichen Scheiben für 45 min inkubieren - 1 Std.
    6. Entfernen Scheiben Warmhalteraum für 10-15 min abzuwaschen überschüssiges Material.
    7. Führen Sie die Schritte 4.1.1 bis 4.1.6 für die Zubereitung zu stimulieren und die Bild colliculo-thalamokortikalen Slice.
  4. Calcium Bildaufnahme.
    1. Sammeln Sie Bilder mit 10 Hz (unter Verwendung eines 20X Wasserimmersionsobjektiv) für 25 sec, während elektrische Stimulation (jede Stimulation besteht aus einem 2 ms Puls) Gewebe bei 0,2 Hz fünf Mal beim Beleuchten des Gewebes mit Licht von 365 nm und die Erfassung Fluoreszenz oberhalb 510 nm. Export von Bildern in Matlab und das benutzerdefinierte geschriebenes Programm in Zusatzmaterialien zum spektralen Leistungs der Bilder bei 0,2 Hz zu analysieren. Das resultierende Bild wird aktiven Zellen zu zeigen.

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Representative Results

Ein Beispiel colliculo-thalamocortical Maushirnschnitt in P15-Maus ist in Figur 2 gezeigt ist. Die ideale Scheibe werden die vier Haupthirn und Vorderhirn Gehörstrukturen IC, MGB, TRN und AC, die alle aktiviert werden, wenn die IC-stimuliert enthalten (2A). Verwendung von Fourier-Analyse wird die spektrale Leistung zu der elektrischen Stimulationsfrequenz gemessen wird, verbunden mit Hirnregionen, die Aktivität, die periodisch ist und an der Stimulationsfrequenz 10 mitgerissen wird. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von der aufsteigenden Informationsfluss besonders im Thalamus als eine Verknüpfung zwischen dem Mittelhirn und Kortex. Während dieses Protokoll hilft bei der Produktion des angeschlossenen colliculo-thalamokortikalen Scheibe sowie Bereitstellung einer leicht kunden Satz von Hardware mit dem Einbau von 3D-Druck, enthalten sind ein Beispiel für eine Scheibe nicht aus dem Thalamus zum Kortex (2B verbunden ), ein s sowie eine Anbindung Muster, bei dem der Thalamus keine Aktivität mit Flavoprotein Autofluoreszenz (2C) zu zeigen. Dies ist aufgrund der Verbindung wobei innerhalb des Scheibe derart, dass die Aktivierung nicht auf der Oberfläche der Scheibe und daher nicht mit dem Flavoprotein Autofluoreszenz ersichtlich wahrscheinlich. Es ist möglich, wenn auch unwahrscheinlich, dass dies antidromic Aktivierung. Wir haben beobachtet, wenn die Aktivierung antidrome Stimulierung der weißen Substanz des thalamocortical Vorsprünge 11, und mit dieser Stimulation Paradigma synaptischen Blockade im Thalamus bewirkt eine reversible Ausschaltung des kortikalen Signal 1. Mit Hilfe dieser Schicht, ist es auch möglich, bei Zellpopulation Aktivität im Thalamus mit elektrischer Stimulation des IC zu suchen. Eine Probe Calcium Imaging Experiment zeigt die Spikeaktivität einer kleinen Population von Thalamus-Neuronen in Reaktion auf einen Reiz im Mittelhirn (Abbildung 3).

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Abbildung 1. Rendering von 3D-Druckmaterialien. (A) Übertragenes Bild der Scheibe sitzt auf der Brücke mit der bedruckten Harfe an Ort und Stelle. Der Pfeil zeigt die Strömung des aCSF. (B) Gerenderten Bild Hervorhebung Kerben für die Saiten der Harfe so dass für die dickere Scheibe (Kreise).

Figur 2
Abbildung 2. Das Schneiden des Gehirns zum Schneiden. (A) Agar Positionierung auf der Schneidstufe. (B) Slide für Gehirn Positionierung. (C) Position des Gehirns, die für anteriore Schnitt. (D) Position des Gehirns und der Rasierer zum Doppelschrägschnitt. (E) Endgültige Sperrung von Gehirn zum Schneiden .

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Abbildung 3. Flavoprotein Autofluoreszenz-Bildgebung von colliculo-thalamokortikalen Hirnschnitt. (A) Verbunden colliculo-thalamokortikalen Hirnschnitt durch Flavoprotein Autofluoreszenz bestätigt. Die elektrische Stimulation bei 0,05 Hz der IC abgebildet mit 4 Hz und Fourier verarbeitet werden, um Leistung bei Stimulationsfrequenz zeigen. Hinweis Aktivierung der MGB, TRN und AC sowie Striatum (CS). (B) Nicht verbundene Scheibe. Die elektrische Stimulation des IC mit nur Aktivierung des MGB. Gesamten Weg wurde nicht erfasst wahrscheinlich auf 17 o Winkel etwas zu steil. (C) Atypische Aktivierung von AC. Die elektrische Stimulation des IC mit der Aktivierung der AC ohne sichtbares Signal in der MGB oder TRN. Weg wahrscheinlich intakt aber die aktiven Zellen in der MGB sind wahrscheinlich an der anderen Seite des Gewebes.

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Abbildung 4. Calcium Imaging. (A) Raw image beispielScheibe für Kalzium-Imaging beleuchtet. (B) Raw 20X Bild des MGB, sind helle Punkte Zellen. Maßstabsbalken 100 um. (C) Calcium-Signals mit elektrischen Stimulation des IC. Fourier-Verarbeitung zeigt Aktivierung der beiden Zellen weiße Pfeile und Neuropil schwarze Pfeilspitze. Inset, Zeitverlauf der gemittelten Signals (Einschub Maßstab 0,5% Veränderung der Fluoreszenz, 1 sec).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
High sucrose cutting solution in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Low calcium aCSF in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator World Precision Instruments A360
DMSO Life Technologies D12345 Lot: 1572C502
Fura-2AM Life Technologies F1201 Lot: 144912
Pluronic F-127 Life Technologies P3000MP Lot: 1499369
Large culture dish Fisherbrand 08-757-13 100 x 15 mm culture dish
Small culture dish Falcon 353001 35 x10 mm culture dish
Raised culture membrane Millicell PICMORG50 Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.
Flavoprotein imaging fluorescence cube Olympus UMNIB 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.  We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.
Calcium imaging fluorescence cube Omega Optical BX-18 XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission
Agar for blocking brain 3% by weight in water
Viper si Stereo Lithography Apparatus 3D Systems

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References

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Neuroscience Ausgabe 103 Neurowissenschaften Thalamus Nucleus reticularis Hörsystem Hirnschnitt thalamokortikalen
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