Ændring af et Colliculo thalamus Mouse Brain Slice, Omfattende 3D-print af Afdeling Komponenter og Multi-skala Optisk Imaging

Summary

Brug af flere vinkler til at skære musen hvalp hjernen, forbedrer vi på en tidligere beskrevne akut hjerne skive som indfanger forbindelserne mellem de fleste af de store auditive midthjernen og forhjernen strukturer.

Introduction

I auditive system, selv om der er væsentlig bearbejdning af information mellem sensoriske periferi og ringere colliculus, der er betydelig yderligere behandling, før den når den auditive cortex. Vi ved meget lidt om, hvordan at behandlingen er gjort, og derfor lidt om, hvordan at transformation tillader hjernen at fortolke indkommende sensoriske informationer. Med undtagelse af lugtesansen, hver af sanserne har en meget lignende organisation med perifere signaler oprindeligt videreudsendelse med high fidelity, som falder, når signalet stiger til cortex. Cortex sender derefter fremspring til de nedre strukturer til yderligere at modulere den indkommende information. Dette komplekse system er blevet undersøgt i en række forskellige måder i vivo såvel som i en række in vitro-præparater. I førstnævnte, alle forbindelser er intakte, så forskeren at sonden et sæt af forbindelser, mens styring af sanseindtryk og målingproduktion i et givet område. Med denne fremgangsmåde, er der lidt at ingen kontrol over det store udvalg af andre indgange, herunder andre sensoriske inputs, ophidselse og opmærksomhed, hvilket giver anledning til en stærkt kompliceret output. In vitro har hjerneskiver blevet skåret til at fange enten et enkelt sæt af fremskrivninger eller to forbundne områder i hjernen, som giver forskerne til at stimulere og evaluere forskellige afferente eller hjerneområder. Disse er ofte enten thalamus eller tectothalamic skiver hvor enten input til thalamus eller thalamus og dens output til cortex er bevaret ^2-5. Disse præparater giver mulighed for en bred vifte af farmakologiske, elektriske og optogenetic manipulationer. Men med kun to områder af hjernen, de primært vurdere overførsel af information og mangler evnen til at vurdere omdannelsen af ​​oplysninger, når den passerer gennem thalamus. Også netmave-thalamiske projektion, som kan spille en rolle i opmærksomhed graduering ^6-9 er prESENT i dette udsnit. Her demonstrerer vi forbedringer i forhold til vores tidligere ^fremstilling 1, hvilket tillader investigator styring af forskellige input til thalamus at give et unikt perspektiv på, hvordan thalamus porte og filtre information. Vi par denne roman forberedelse skive med flavoprotein autofluorescens billeddannelse til vurdering skive tilslutningsmuligheder og storstilet aktiveringsanalyse, calcium billeddannelse i thalamus for neuronal befolkning analyse og enkelt celle optagelse for at måle effekten af ​​de forskellige indgange på en enkelt celle niveau.

For at hjælpe med at opretholde disse omfattende forbindelser har vi også udviklet en række ændringer af den normale skive anker (aka "harpe") til at holde hjernen skive på plads, og en bro til at ophøje den skive for øget perfusion. Harpen er designet i en modificeret hestesko form til at omgive skive og give mulighed for tilpasses fastgørelsespunkter for harpe strygere. Tre strenge erfastgjort således, at i) man ligger vandret langs den mediale kant af skiven, ii) en strækker sig fra kaudale kant af IC til den kaudale kant af AC og iii) en forløber diagonalt fra den mediale kant af udsnittet til et område rostrale til AC (se figur 1A). Små fordybninger i rammen til limning (med cyanoacrylat lim) på harpe strygere giver mulighed for en nedsat mængde af pres på skive for at hjælpe med at opretholde slice integritet (se figur 1B). Ved at bruge tredimensionelle udskrivning, er vi i stand til brugerdefinerede design harper til vores unikke specifikationer, såvel som broer, der tillader ideel strøm af over og under vævet kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Det fastholder også store områder til let at trænge ind i væv til patch clamp elektrofysiologi.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på University of Illinois. Alle dyr blev opstaldet i dyr pasningsmuligheder er godkendt af American Association for Akkreditering af Laboratory Animal Care. Ethvert forsøg på at minimere antallet af dyr, der anvendes, og for at mindske lidelserne i alle faser af undersøgelsen.

1. Forberedelse til og Fjernelse af hjernen fra mus til udskæring

1. Forbered perfusion og skive inkubation.
   1. Ca. 30 minutter før udskæring, forberede høj sucrose skæring løsning og lav calcium aCSF til inkubation af skive forud for optagelse eller billedbehandling.
   2. Læg alle de nødvendige værktøjer (store stump ende saks, små foråret saks, anatomiske pincet, store saks eller guillotine, iris saks, guldsmede pincet, 10 ml sprøjte med 27G x 1/2 tommer nål, lille stykke på 1 cm x 2 cm filter papir, og en brudt tippet Pasteur pipette til slis overførsel) til perfusion og udskæring, og forberede perfusion bakke.
   3. Opsætning inkubere kammer med iltet aCSF i en 32 ^{° C} vandbad og en kultur fad fyldt med opskæring løsning.
2. Forbered skære scenen for udskæring.
   1. Skær et lille stykke 3% agar ca. 1 ^cm3 til brug som bagstopper for hjernen og 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm for en bule, der skal anvendes til at understøtte IC.
   2. Lim bagstopper på scenen med cyanoacrylatklæbestof samt bump på højre side af bagstopper sådan, at de danner en 80 ^o vinkel.
3. Fjern hjernen.
   1. Dybt bedøver en p12-p20 (ideelt p14-18) mus med ketamin 100 mg / kg og xylaxine 3 mg / kg (eller tilsvarende etiske udvalg godkendt procedure).
      Bemærk: Bekræft ordentlig anæstesi niveau via manglende respons til tå knivspids. Da dyret er under anæstesi kort, oftalmisk salve er unødvendig.
   2. Ved stumpende saks, eksponere brystkassen fra formet som et sværd proces til halsen.
      1. Find formet som et sværd proces og gøre en horisontal snit på ca. 1,5 cm.
      2. Lav to lodrette snit fra enderne af den foregående vandrette snit til skuldrene, ca. 1,5 cm hver.
   3. Skære igennem mellemgulvet og de costochondral knudepunkter at eksponere hjertet.
   4. Med små spring saks, lave en lille, 2-5 mm skåret i højre atrium, fra den ventrale at dorsale side af hjertet.
   5. Anvendelse af en 10 ml sprøjte med en 27G x 1/2 inch nål injiceres den venstre ventrikel og hurtigt perfuse dyret med højt saccharoseindhold skæring opløsning.
   6. Når blodet løber klare, bruge større saks til at fjerne hovedet.
      Bemærk: Vi har ikke systematisk vurderet anvendeligheden af ​​perfusion. Men vores erfaring, transcardiac perfusion hos mus denne unge kan gøres med næsten 100% succes, og har den fordel at fjerne røde blOOD celler, som kan fluorescere og forstyrre billeddannelse.
   7. Skære huden ned midterlinjen at blotlægge kraniet.
   8. Brug bøjede iris saks, klippe kraniet mellem øjnene, derefter starte fra snittet mellem øjnene, omhyggeligt skåret fra forreste til posterior langs midterlinjen sutur pas på ikke at beskadige hjernen nedenunder.
      Bemærk: dura normalt kommer ud med kraniet. Fjern om nødvendigt dura før forsigtigt fjerner hjernen.
   9. Ved hjælp af guldsmede pincet, lirke åbne kraniet og fjern forsigtigt hjernen, derefter placere hjernen i at skære løsning. Sørge for at undgå at beskadige cortex.

2. Forberedelse Brain til udskæring

1. Forberedelse hjernen til montering på vibratome scenen.
   1. Ved hjælp af et dias markeret med to linjer ved 90 ^o og en diagonal linje ved 17 ^o fra øverste venstre hjørne til nederste højre, krydsende hvor de to linier mødes, placere hjernen dorsalsiden op, ved hjælp afet barberblad, fjerne 2-4 mm rostralt ende hjernen skabe en flad overflade.
   2. Placer hjernen caudale opad på den nyoprettede flad overflade og tilpasse den dorsale overflade af hjernen med vandret, og midterlinjen af ​​hjernen med den lodrette linje.
   3. Juster barberblad med 17 ^o linje, vippe barbermaskine i en ³⁰ o vinkel og fjern ca. 3 mm af retten cortex i en dobbelt diagonalt snit (17 ^o fra vandret plan og 60 ^o fra den koronale).
2. Montering hjernen på vibratome scenen.
   1. Placer en lille stykke filterpapir 1 cm x 2 cm på den ventrale side af hjernen, så den lange dimension er vinkelret på midterlinien.
   2. Påfør forsigtigt en lille mængde cyanoacrylat klæbemiddel til området foran modholdet (og til venstre for bump).
   3. Det dobbelte diagonalt-cut hjernen ansigt på til limen, således at i den bageste del af hjernen og baghjerne er propped på bump og den højre side af hjernen er imod bagstopper.
   4. Fint tryk ned på hjernen, der sikrer, at hele overfladen er i kontakt med udskæring kammeret.

3. Modtagelse af den Colliculo thalamus Slice

1. Hurtigt tage opskæring scenen og plads i vibratome, fylde scenen med at skære løsning.
2. Juster kniven med toppen (ventrale side) af hjernen.
3. Fjern 1-1,5 mm fra toppen af ​​hjernen, fjern 300-500 um skiver og vurdere dybden efter fjernelse.
   Bemærk: Når IC, MGB, og den laterale geniculate nucleus (LGN) er alle synlige, og den tandede gyrus danner en »C« facon tage en til to 600 um skiver. Se figur 3A.
4. Læg skiver i opvarmet (32 ^{° C)} holder kammer.

4. Imaging af Slice

1. Forberedelse til flavoprotein autofluorescens billeddannelse.
   <li> Forbered aCSF for perfusion af skive i en standard elektrofysiologiske optagelse kammer, bubble aCSF med 95% O _2/5% CO2.
   1. Træk glaselektroden for stimulation. Bemærk, at flere forskellige stimulerende elektroder og konfigurationer (glas, wolfram, kulfiber, monopolar, bipolar) alle arbejde meget godt sammen med flavoprotein autofluorescens billeddannelse.
   2. Tænd computeren, kamera, mikromanipulator, lyskilde, stimulation software, billedoptagelse software.
   3. Perfundere optagelsen kammer med iltet aCSF, placere custom bro (design fås i supplerende materiale) for at ophøje skive i kammeret.
      Bemærk: Perfusion sats kan variere med enhver person oprettet; 5-15 ml / min anvendes her.
   4. Placer skive i kammeret, sænke væskeniveauet i kammeret for at forhindre, at skive i at løfte fra broen samtidig lægge specielt konstrueret harpe løbet skive, idet man undgå at placere harp strenge løbet veje for interest (figur 1A). Forøg væskeniveauet til ca. 1-2 mm over slice at opretholde aCSF flow over og under udsnit.
      Bemærk: Hvis repositionering er nødvendigt, skal du bruge brudte ende Pasteur-pipette eller tillade aCSF niveau til at stige og bruge pincet med største omhu.
   5. Indsæt sølvchlorid elektrode i glas elektrode fyldt med aCSF, indsætte glaselektroden i mikromanipulator og oprette forbindelse til stimulus isolator, og omhyggeligt placere glas elektrode i IC / hvid substans, der fører til thalamus (se figur 1A).
2. Flavoprotein autofluorescens billedoptagelse.
   1. Saml billeder på 4 Hz (ved hjælp af en uendelighed-korrigeret 2X makro mål (NA 0,13)) og et kamera til 105 sek, mens elektrisk stimulerende (hver stimulering består af 1 sek på 40 Hz 2 ms pulser væv på 0,05 Hz fem gange), mens belysning vævet med blåt lys 470-490 nm og opfange over 515 nm. Sørg for, at billedet er hverkeno mørke, og heller ikke blæst ud se figur 3 venstre kolonne for reference.
      Bemærk: Indsamling tid, indsamling frekvens, og stimulering hyppigheden kan ændres så de passer til eksperimentet, den brugerdefinerede programmet indgår i supplerende materialer kan ændres som sådan.
   2. Eksport billeder til Matlab, og bruge den brugerdefinerede skriftligt program til rådighed på supplerende materialer til at analysere spektraleffekten af ​​billederne på 0,05 Hz. Det resulterende billede vil vise tilsluttede veje.
      Bemærk: Den brugerdefinerede program bruger en hurtig Fourier transformation af pixelværdier i tidsserien for at producere billedet.
3. Forberedelse til calcium imaging.
   1. Forbered lille rugekammeret anvendelse af en 3 cm dyrkningsskål og opvokset kultur membran for at tillade aCSF at nå både toppen og bunden af den del, og sted på en varmepude til at opretholde temperaturen ved ca. 32 ^o C.
   2. Fyld lille inkubation kammer med varm aCSF og langsomt boble med 95% O_2/5% CO2.
   3. Bland 2 pi Pluronic F-127-syre og 50 ug Fura-2:00 opløst i 48 pi DMSO.
   4. Placer skive i små inkubation kammer på hævet membran og omhyggeligt ved hjælp af en mikropipette tilføje farvning blanding direkte over MGB (eller anden struktur af interesse).
   5. Dække skiver for at forhindre blegning før billeddannelse og tillade skiver at inkubere i 45 minutter - 1 time.
   6. Fjern skiver til opvarmet bedrift kammer i 10-15 min at vaske overskydende materiale.
   7. Følg trin 4.1.1 til 4.1.6 til forberedelse til at stimulere og billedet colliculo thalamus skive.
4. Calcium billedoptagelse.
   1. Saml billeder ved 10 Hz (ved hjælp af en 20X vand nedsænkning mål) i 25 sek, mens elektrisk stimulerende (hver stimulering består af en 2 ms puls) væv på 0,2 Hz fem gange, mens belysning af væv med 365 nm lys og indfange fluorescens over 510 nm. Eksport billeder til Matlab og bruge den brugerdefinerede skriftligt program til rådighed på supplerende materialer til at analysere spektraleffekten af ​​billederne på 0,2 Hz. Det resulterende billede vil vise aktive celler.

Representative Results

Et eksempel på colliculo thalamus musehjerne skive opnået i P15 mus er vist i figur 2. Den ideelle skive vil indeholde de fire store midthjernen og forhjernen auditive strukturer IC, MGB, TRN og AC, der alle aktiveres, når IC stimuleres (Figur 2A). Brug af Fourier-analyse, er den spektrale effekt målt ved den elektriske stimulation frekvens, med tilsluttet hjerneområder, der viser aktivitet, der er periodisk og medføres på stimulationsfrekvensen ^10. Denne protokol muliggør undersøgelse af opstigende informationsstrømmen især i thalamus som et bindeled mellem midthjernen og cortex. Mens denne protokol hjælpemidler i produktionen af den tilsluttede colliculo thalamus skive samt giver en mere let tilpasses sæt hardware med indarbejdelse af 3D-print, inkluderet er et eksempel på en skive ikke tilsluttet fra thalamus til cortex (figur 2B ), en s samt en konnektivitet mønster, hvor thalamus ikke viser aktivitet med flavoprotein autofluorescens imaging (figur 2C). Dette skyldes sandsynligvis forbindelsen er interne til skive, således at aktivering ikke er på overfladen af ​​skive og derfor ikke kan ses med det flavoprotein autofluorescens billeddannelse. Det er dog muligt usandsynligt, at dette er antidrom aktivering. Vi har ikke set antidrom aktivering, når stimulere den hvide substans af thalamus fremspring ^11, og med denne stimulation paradigme synaptiske blokade i thalamus forårsager en reversibel afskaffelse af den kortikale ^signal 1. Brug af dette udsnit, er det også muligt at se på cellepopulation aktivitet i thalamus med elektrisk stimulation af IC. En prøve calcium imaging eksperiment viser spiking aktivitet af en lille population af neuroner thalamiske som reaktion på en stimulus midthjernen (figur 3).

ent "fo: holde-together.within-side =" altid ">
Figur 1. Gengivelse af 3D trykte materialer. (A), gengivet billede af den pågældende del sidder på broen med den trykte harpe på plads. Pil angiver strømmen af aCSF. (B) gengivet billede fremhæve riller for strenge af harpe giver mulighed for tykkere skive (cirkler).

Figur 2. Skæring hjernen til udskæring. (A) Agar positionering på skære scenen. (B) Slide for hjernens positionering. (C) Placering af hjernen til forreste snit. (D) Placering af hjerne og barbermaskine til dobbelt vinklet snit. (E) Endelig blokering af hjernen til udskæring .

/ftp_upload/53067/53067fig3.jpg "/>
Figur 3. flavoprotein autofluorescens billeddannelse af colliculo thalamus hjerne skive. (A) Connected colliculo thalamus hjerne skive som bekræftet ved flavoprotein autofluorescens. Elektrisk stimulering ved 0,05 Hz IC afbildet ved 4 Hz og Fourier forarbejdet til at vise effekt ved stimulation frekvens. Bemærk aktivering af MGB, TRN og AC samt corpus striatum (CS). (B) Ikke tilsluttet skive. Elektrisk stimulation af IC med kun aktivering af MGB. Hele pathway blev ikke fanget sandsynligvis på grund af 17 ^o vinkel er lidt for stejl. (C) Atypiske aktivering af AC. Elektrisk stimulation af IC med aktivering af AC uden synlig signal i MGB eller TRN. Pathway sandsynligt intakte de aktive celler i MGB er imidlertid sandsynligt på den anden side af vævet.

annonce / 53067 / 53067fig4.jpg "/>
Figur 4. Calcium billeddannelse. (A) Rå billede af eksempelvis skive belyst for calcium billeddannelse. (B) Raw 20X billede af MGB, lyse punkter er celler. Scale bar 100 um. (C) Calcium signal med elektrisk stimulering af IC. Fourier forarbejdning viser aktivering af begge celler hvide pile og neuropilen sort pilespids. Indpresningsdybde, tidsforløbet for gennemsnitlige signal (inset Målestokken 0,5% ændring i fluorescens, 1 sek).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High sucrose cutting solution			in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Low calcium aCSF			in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF			in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Lot: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lot: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lot: 1499369
Large culture dish	Fisherbrand	08-757-13	100 x 15 mm culture dish
Small culture dish	Falcon	353001	35 x10 mm culture dish
Raised culture membrane	Millicell	PICMORG50	Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.
Flavoprotein imaging fluorescence cube	Olympus	UMNIB	470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.  We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.
Calcium imaging fluorescence cube	Omega Optical	BX-18	XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission
Agar for blocking brain			3% by weight in water
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems