Protokol til Isolering af primære humane hepatocytter og Tilsvarende Major populationer af ikke-parenchymale leverceller

Abstract

Udover parenkyme hepatocytter, leveren består af ikke-parenchymale celler (NPC), dvs. Kupffer-celler (KC), lever-endotelceller (LEC) og hepatiske Stjemeformige celler (HSC). To-dimensional (2D) kultur af primære humane hepatocyt (PHH) er stadig betragtes som "gold standard" for in vitro-test af stofskiftet narkotika og hepatotoksicitet. Det er velkendt, at 2D monokultur af PHH lider dedifferentiering og tab af funktion. For nylig blev det vist, at hepatisk NPC spille en central rolle i leveren (patogen) fysiologi og vedligeholdelse af PhH funktioner. Aktuel forskning fokuserer på genopbygningen af in vivo vævsarkitekturen af 3D- og co-kultur modeller til at overvinde begrænsningerne i 2D monokulturer. Tidligere vi offentliggjort en fremgangsmåde til isolering af humane leverceller og undersøgt egnetheden af disse celler for deres anvendelse i cellekulturer i Experimental Biology and Medicine ^1. Baseret på den brede interesse i denne technique formålet med denne artikel var at give en mere detaljeret protokol for leveren celle isolation proces, herunder en video, som vil give en nem gengivelse af denne teknik.

Humane leverceller blev isoleret fra humant levervæv prøver af kirurgiske indgreb ved en totrins-EGTA / collagenase P perfusion teknik. PHH blev separeret fra NPC ved en initial centrifugering ved 50 x g. Densitetsgradientcentrifugering trin blev anvendt til fjernelse af døde celler. Individuel lever cellepopulationer blev isoleret fra den berigede NPC fraktionen ved hjælp specifikke celleegenskaber og celle sortering procedurer. Ved siden af ​​PHH isolation var vi i stand til at adskille KC, LEC og HSC for yderligere dyrkning.

Tilsammen den præsenterede protokol tillader isolering af PHH og NPC i høj kvalitet og kvantitet fra vævsprøven én donor. Adgangen til oprensede lever cellepopulationer kan tillade etablering af in vivo som menneskelig liver modeller.

Introduction

Humant levervæv er meget komplekse og består af to forskellige celle enheder, parenchymale celler og ikke-parenchymale celler (NPC). Parenchymale leverceller omfatter hepatocytter og cholangiocytes. Hepatocytter repræsentere 60 til 70% af de samlede leverceller og tegner sig for de fleste af de metaboliske leverfunktioner, fx galdesyre og supplere faktor syntese, biotransformation og energimetabolisme ^2,3.

Den mindre NPC fraktion udgør 30-40% af den samlede leverceller. NPC omfatte forskellige cellepopulationer, nemlig Kupffer-celler (KC), lever endotelceller (LEC) og hepatiske stjerneformige celler (HSC). Denne heterogene cellefraktion spiller en central rolle i fysiologiske processer i leveren. Derudover NPC deltager i mediering akut leverskade, f.eks lægemiddelinduceret leverskade (DILI) samt i kroniske leverskader, såsom cirrhose ^4.

I de seneste år, hUman leverceller er blevet mere og mere vigtigt i forskning og udvikling af narkotika-test, udvikling af lægemidler og identifikation af nye biokemiske veje i leversygdomme. Til in vitro test PHH monokulturer stadig betragtes som "gold standard" ^5. Den væsentligste begrænsning af de nuværende homotypiske liver modeller er dedifferentiering og tab af funktion af hepatocytterne i løbet af få dage ^4. Etablering af 3-dimensionelle (3D) kultur teknikker har vist, at disse begrænsninger kan kompenseres ^4,6. Men selv moderne 3D kultur teknikker er ikke i stand til at vise alle hepatotoksiske former for handlinger ^7. Missing NPC populationer i de eksisterende in vitro modeller er diskuteret som en mulig årsag til denne forskel til in vivo situationen. Det er blevet vist, at celle-celle-kommunikation mellem de forskellige liver cellepopulationer spiller en central rolle i fysiologisk homeostase, men også i pathophysiologic processer ^8. den videnskabelige opmærksomhed fokuserer derfor mere og mere på NPC og deres celle-celle-interaktioner. Deres målrettet anvendelse i co-kultur og manipuleret væv systemer kunne være en løsning for den store efterspørgsel af in vitro liver modeller ^8,9, der er så tæt på in vivo-situationen som muligt.

I øjeblikket den største udfordring er udviklingen af ​​en standardiseret human lever co-kultur model, som indeholder klart definerede dele af PHH og NPC. Følgelig er isoleringsteknikker for de meget heterogene leverceller behov og dem skal optimeres for at opnå rene cellepopulationer. Mens standardiserede protokoller for PHH isolation eksisterer ^10, den standardiserede isolering af human NPC er stadig under udvikling. Mest offentliggjorte NPC isolation protokoller er baseret på forsøg med ikke-menneskelige celler ^11,12. Kun få publikationer beskriver isolering proces af human NPC og mest dækker kunMetoder til isolering af en enkelt celletype ^11-16. De vigtigste cellekarakteristika, der er blevet udnyttet til celleseparation er størrelse, densitet, fastgørelse adfærd, og ekspressionen af ​​overflade-proteiner. På grundlag af disse egenskaber udviklede vi en forenklet protokol til at isolere PHH, KC, LEC og HSC, som tidligere blev offentliggjort i Experimental Biology and Medicine ^1. På grund af den brede interesse i denne teknik, er formålet med denne artikel var at give en mere detaljeret protokol for leveren celleisolering proces indbefatter en video, som vil tillade reproduktion teknikken lettere. Protokollen indeholder også metoder til evaluering af udbyttet og levedygtighed samt til identifikation og renhed evaluering ved hjælp af specifikke immunfarvninger kvalitetskontrol.

Protocol

Bemærk: Alle celler blev isoleret fra opereret ikke-tumorøst humant levervæv, som forblev efter delvis leverresektion med primære eller sekundære levertumorer. Informeret samtykke af patienterne blev opnået i overensstemmelse med de etiske retningslinjer i Charité - Universitätsmedizin Berlin.

1. Forberedelse af materialer og løsninger

1. Sterilisere alle instrumenter og materialer på forhånd for at undgå bakteriel forurening under isolation processen.
2. Forbered løsninger, der kræves for perfusion af leveren vævsprøve, isolationsprocessen af hepatocytter og ikke-parenchymale leverceller og dyrkning af primære humane leverceller ifølge tabellerne 1 og 2, med undtagelse af Digestion-opløsning, som fremstilles frisk før anvendelse. Alle løsninger kan opbevares ved 4 ° C, og det anbefales at anvende dem inden for 4 uger efter fremstilling.
3. Steriliserealle løsninger ved hjælp af en 0,22 um flaske top filter.

2. Udarbejdelse af Perfusion udstyr

1. Konfigurere udstyret til perfusion og fordøjelse af vævsprøven leveren som vist i figur 1A.
2. Juster vandbadstemperatur til 39 ° C for at sikre optimal collagenase P aktivitet under perfusion og fordøjelse.

3. Perfusion og fordøjelse af Liver vævsprøve (1,5 time)

1. Vælg en vævsprøve med en intakt Glisson kapsel fra den resekterede levervæv. Ved skæring af vævsprøve, forsøge at få en lille skærefladen med gode synlige skibe. Undgå varme iskæmi gange ved transport og håndtering af leveren vævsprøve på is indtil perfusion.
2. Tag vævsvægt under sterile forhold og placere levervævet prøve i en petriskål i den laminare luftstrøm. Rengøre overfladen af ​​vævsprøven med en steril komprimere fra reresterende blod og skyl kanylen indstillet med 1x Perfusion-Solution jeg at sikre, at alle kanyle var gennemtrængelig.
3. Brug væv lim til at fastsætte oliven af ​​kanyler i nogle større blodkar. Afhængig af størrelsen af ​​leveren vævsprøve og antallet af fartøjerne på overfladen, brug en kanyle sæt med 3 til 8 kanyler. Test perfusion og tjekke for lækager. Luk alle blodkar, der lække klar 1x Perfusion-Solution I, med væv lim.
4. Placer kanylerede levervæv prøven i Buchner-tragt på dens perforerede filter disk (figur 1A).
5. Indstil strømningshastigheden af ​​den peristaltiske pumpe mellem 7,5 ml / min og 14,6 ml / min afhængigt af antallet af kanyler, der anvendes, og om modstanden i levervæv. Hastigheden sættes hver gang for at sikre, at der er en aktuel, men langsom perfusion. Perfundere vævet indtil helblodet skylles ud, men mindst 20 min. Overhold vævet bliver lysere i områder med gode perfusipå.
   Bemærk: I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at fastspænde en af ​​kanylerne med plastklemmer eller at forøge det indre tryk af et område ved at skubbe blidt med en spatel mod leveren kapsel, for at optimere perfusion. En fuldstændig farveændring til en lysegul til lys brunlig farve indikerer en god perfusion.
6. Skift perfusionsfluidet til Fordøjelse-opløsning indeholdende collagenase P (tabel 1).
7. Omarrangere opsætningen (figur 1A) for fordøjelsen trin. Derfor udføre en cirkulær strøm af Digestion-Opløsning ifølge figur 1B i op til 15 min.
   Bemærk: Det er kritisk at stoppe perfusionen straks når leveren vævsprøven er tilstrækkeligt fordøjet. En god fordøjelse kan observeres, når vævet ikke viser tegn på elasticitet som vurderet ved bevarelse af kapsel deformationer, når den skubbes med en spatel.

4. Isolering af hepatocytter (1 time)

1. Turn den peristaltiske pumpe ud og placere levervævet prøve i en glasskål. Skyl ydersiden af vævsprøven med iskold Stop-opløsning (tabel 1). Fjern kanylerne fra leveren vævsprøven. Brug en skalpel til at åbne vævsprøven leveren, ved indskæring i midten af ​​området, hvor kanylerne var vedlagt. Hold omhu at Glisson's kapsel forbliver intakt.
2. Skyl indersiden af ​​vævsprøven og derefter dække hele vævsprøve med iskold Stop-opløsning. Ryst vævet forsigtigt for at frigive cellerne ud af vævet.
3. Saml cellesuspensionen og filtrere det gennem et blik tragt (plastik tragt foret med gaze komprimere) i 50 ml plastikrør. Tilføj flere stop-løsning til leveren vævsprøven indtil en endelig volumen på 500 ml forbruges.
4. Centrifuger cellesuspensionen ved 50 x g, 5 min, 4 ° C. Opsaml supernatanten til senere ikke-parenchymale celleisolering. Vask cellepelleten med PBS (figur 2A).
5. Centrifuger cellesuspensionen igen ved 50 x g, 5 min, 4 ° C. Saml supernatanten og re-suspendere pellet i hepatocyt Incubation medium (tabel 2, figur 2B).
6. Bestem celletallet og levedygtighed i den resulterende cellesuspension hjælp trypanblå farvning. Tæl de levende og døde celler i et Neubauer tællekammer. Beregn celletal, levedygtighed og udbytte af PHH hjælp af nedenstående formler.
   
   udbytte (tælles celler) = optalte celler x fortyndingsfaktor x volumen af ​​celle suspension (ml) x 10.000
   
   udbytte (hepatocytter / (vævsprøven g lever)) = (udbytte (hepatocytter / (ml medium)) x Volumen af ​​cellesuspensionen (ml)) / (vægt af levervæv prøve (g))
   
   levedygtighed (%) = 100% x (antal levende celler) / (samlet celleantal)

5. Oprensning af hepatocytter (1 time)

Bemærk: Det anbefales Denne rensning trin, hvis levedygtighedener lavere end 70%.

1. Udfør alle trin på is. Der fremstilles en 25% densitetsgradient ved blanding 5 ml densitetsgradient opløsning og 15 ml PBS i densitetsgradientcentrifugering.
2. Sætte maksimalt 50 mio celler i alt ud af hepatocyt rige cellesuspensionen forsigtigt og langsomt oven på densitetsgradient lag 25% for at sikre, at en klar adskillelse af begge lag er opnået (figur 2C). Sætte rørene forsigtigt ind i centrifugen og centrifugeres ved 1.250 xg, 20 min, 4 ° C uden bremse (Figur 2D).
3. Aspirere den resterende cellesuspension og de døde celler i interfasen. Afhængigt af fedtindholdet man kunne også aspirere densitetsgradienten-opløsning.
   Bemærk: PHH med lavt lipidindhold danne en tæt pellet og densitetsgradienten kan opsuget fuldstændigt. PHH med højt lipidindhold danne en mere diffus pellet og en masse af levedygtige celler kan forblive i densitetsgradient opløsning over pelleten.
4. Resuspender hepatocyt pellets med PBS og centrifuger igen ved 50 x g, 5 min, 4 ° C. Pool pillerne, vask igen med PBS og re-suspendere renset PHH i hepatocyt Incubation medium. Udfør celletælling som beskrevet i trin 4.6.

6. Dyrkning af hepatocytter

1. Forbered cellekultur retter til podning af PHH ved at coate dem med en ekstracellulær matrix, f.eks rottehalecollagen (collagen type I). Forbered rotte hale kollagen i overensstemmelse med protokollen er oprettet ved Rajan et al. ¹⁷
2. Fortynd rottehalecollagen stamopløsning 1: 200 i PBS. Overfør 100 ul / ^cm2 rotte hale collagen løsning i kulturen retter, der tager sig at hele overfladen er dækket. Inkubér cellekultur plast i 20 minutter ved stuetemperatur. Aspirere den resterende rottehalecollagen opløsning.
3. Seed 15 x 10 ⁴ hepatocytter / ^cm2 i hepatocyt Incubation medium på kultur dishes overtrukket med rottehalecollagen. Dyrk cellerne i en fugtig inkubator ved 37 ° C, _5% CO2 i mindst 4 timer. Efter 4 timer hepatocytterne har klæbet, og mediet kan ændres.
4. Udfør undersøgelser afhængigt forsøgsopstillingen. Der anbefales en dyrkningstid på 48 timer for at tillade cellerne at komme sig efter isolation proces.

7. Isolering af ikke-parenchymale leverceller (1,5-2 timer)

1. Centrifuger den opsamlede supernatant (trin 4.5 og 4.6) ved 72 x g, 5 min, 4 ° C for at fjerne de resterende erythrocytter og hepatocytter. Pool supernatanterne og centrifugere dem to gange for at opnå to cellepellets: 300 xg 5 min, 4 ° C for sedimentation af HSC, LEC og delvist KC og 650 xg, 7 min, 4 ° C til sedimentering af den resterende KC.
2. Pool både piller og re-suspendere dem i HBSS. Der fremstilles en 25% og en 50% densitetsgradienter ved blanding densitetsgradient opløsning og PBS i densitetsgradient centrifugalugation (25% densitetsgradient opløsning: 5 ml densitetsgradient opløsning og 15 ml PBS, 50% densitetsgradient opløsning: 10 ml densitetsgradient opløsning og 10 ml PBS, se figur 2). Placer densitetsgradient opløsning 25% forsigtigt på toppen af ​​densitetsgradient opløsning lag 50%.
3. Sæt NPC suspensionen forsigtigt og langsomt oven på densitetsgradient opløsning lag 25% på en måde, en klar adskillelse af begge lag er opnået.
4. Centrifuger cellesuspensionen af densiteten gradient ved 1.800 xg, 20 min, 4 ° C uden bremse (figur 2.2).
5. Aspirer døde celler og cellerester fra det øverste lag. NPC er placeret i interfasen mellem densiteten gradient lag 25% og 50% (figur 2). Saml NPC, vaske dem med HBSS og centrifuger cellesuspensionen anvende den ovenfor beskrevne dobbelt centrifugering trin (trin 7.2.).

8. Separation af Kupffer-celler (OverholdelseSeparation Step) (1 time)

1. Udfør en celletælling for KC i NPC fraktion som beskrevet i trin 4.6. (For udseendet af KC i suspension se figur 3B). Centrifuger NPC fraktionen med den ovenfor beskrevne dobbelt centrifugering trin (trin 7.2) og re-suspendere NPC i Kupffer Cell såning medium (tabel 2).
2. Seed KC holdige fraktion på plastik celle dyrkningsbeholdere ved en densitet på 5 x 10 ⁵ KC / ^cm2. Inkubér KC-kulturer i 20 minutter i en befugtet inkubator ved 37 ° C, _5% CO2. Primær KC klæbe på cellekultur plast inden for en kort periode (figur 2.3).
3. Saml supernatanten indeholdende ikke levet NPC, der hovedsagelig består af LEC og HSC. Pool supernatanterne til senere adskillelse af LEC (se afsnit 9) og HSC (se afsnit 10). Vask det vedhængende KC med HBSS og dyrke dem i Kupffer Cellekulturmedium (tabel 2) ved 37 ° C, 5% CO₂ i en fugtig inkubator.

9. Separation af endotelceller (1,5 timer)

1. Centrifuger den opsamlede supernatant (trin 8.5.) Ved 300 xg 5 min, 4 ° C. Vask pelleten med PBS. Efter centrifugering ved 300 xg 5 min, 4 ° C resuspender cellerne i Stellate Cell / endotelcelle separationsmediet og udføre en celletælling for alle resterende celler som beskrevet i trin 4.6.
2. Resuspender 1 x 10 ⁷ mio ​​celler i 1 ml Stellate Cell / endotelcelle separationsmedium, tilsættes 20 pi blokeringsopløsning fra MACS-KIT og 20 pi af CD31 mikroperler for immunolabeling og inkuber den resulterende suspension i 15 minutter ved 4 ° C temperatur (figur 2.4).
3. Separat LEC fra HSC som beskrevet i producentgaranti protokol for magnetisk aktiveret cellesortering systemet MACS (figur 2.5). Eluer magnetisk bevaret CD31-positive LEC og suspendere dem i Stellate Cell / endotelcelle dyrkningsmedium (tabel 2).
4. Udfør celletælling for LEC som beskrevet i trin 4.6. Frø LEC i en densitet på 1,25 x 10 ⁵ celler / ^cm2 i celle dyrkningsbeholdere overtrukket med rottehalecollagen (se trin 6.1). Dyrk cellerne ved 37 ° C, _5% CO2 i en fugtig inkubator.

10. Adskillelse af Stjemeformige Cells (0,5 timer)

1. Umærket HSC pasning separationskolonnen under MACS procedure. Saml HSC fraktion (se trin 9.5, Figur 2.5). Udfør celletælling som beskrevet i trin 4.6.
2. Seed HSC med en densitet på 5 x 10 ⁴ celler / ^cm2 i cellekultur fartøjer overtrukket med rottehalecollagen (se trin 6.1) i Stellate Cell / endotelcelle dyrkningsmedium (tabel 2) og dyrke dem ved 37 ° C, 5% _CO2 i en fugtig inkubator.

Tabel 1: Perfusion og isolation opløsning.

Tabel 2: Kultur og isolation medier.

Representative Results

Den separation i en parenchymale og ikke-parenchymale fraktion, under anvendelse af densitetsgradientcentrifugering som en oprydning procedure kombineret med anvendelsen af ​​adhærensegenskaber og MACS fører til vellykket PHH og NPC isolation. PHH og NPC kan isoleres i høj kvalitet og kvantitet. Figur 1 viser repræsentative opsætning af udstyr til leveren perfusion og fordøjelse. 10% FCS blev tilsat til collagenase P indeholdende Perfusion - Opløsning II for at reducere proteolytisk aktivitet af proteaser og stabilisere collagenase P-aktivitet til gengæld. I konsekvens længere fordøjelse gange kræves for NPC isolation kan anvendes uden en negativ indvirkning på levedygtighed PHH.

Figur 1:. Perfusion og fordøjelse sætning Første perfusion udføres in order for at fjerne resterende blod, varme op vævet og fjerne Ca2 ⁺ for at opløse celle-celle-forbindelser ved hjælp 1x perfusionsopløsning I (PI) (A). Recirkulation af Fordøjelsen-Solution (GD) udføres for fordøjelsen af leveren væv under perfusion trin II (B).

Figur 2:. Forenklet skematisk fremstilling af komplette PHH og NPC isolation proces Modificeret fra Pfeiffer m.fl. ^1, 2014 med tilladelse fra Eksperimentel biologi og lægevidenskab.. Først vævsprøven leveren perfunderet og fordøjet af en totrins EGTA / collagenase P perfusion teknik (A). Den opnåede cellesuspension centrifugeres indledningsvis ved 50 x g, 5 min, 4 ° C (B), for at adskille de større PHH-fraktion (pellet) fra den mindre NPC-fraktion (supernatant). I tilfælde af en PHH levedygtighed under 70%, kan den levedygtige del PHH blive beriget med en densitetsgradient centrifugering ved 1.250 x g, 20 min, 4 ° C (C) resulterer i bundfældning af PHH ved bunden af røret, mens døde celler / celle debris er placeret på toppen af densitetsgradient lag (D). Indsamlet supernatanter af den indledende centrifugering (1) centrifugeres under anvendelse af to trin: 1) 300 xg 5 min, 4 ° C, og 2) 650 xg 7 min, 4 ° C. Efter den første centrifugering KC er delvis beliggende i supernatanten. I denne sammenhæng er det nødvendigt den anden isolation trin. De opnåede cellepellets puljes og re-suspenderet i HBSS. Efterfølgende cellesuspensionen forsigtigt lagt oven på en to-lags (25% / 50%) densitetsgradient. De lagdelte densitetsgradient rør centrifugeres ved 1.800 x g, 20 min, 4 ° C (2). Døde celler oven på densitetsgradient lag 25% kasseres. NPC beliggende mellem interfasen af ​​25%, og 50% density gradient lag opsamles og samles. NPC fraktionen podes på uovertrukne cellekultur plast. Anvendelse af en 20 minutters inkubation tid (adhærens adskillelsestrin) KC er adskilt fra andre lever cellepopulationer (3). LEC og HSC er adskilt ved hjælp af MACS-kit. At de indsamlede resterende leverceller i supernatanten centrifugeres ved 300 xg 5 min, 4 ° C, og er mærket med CD31-konjugerede mikroperler (4). Kun CD31-negative HSC passere MACS separation kolonne (5). CD31-positive LEC stick til kolonnen. Endelig søjlen er fjernet fra den magnetiske indretning og CD31-positive LEC elueres ud af søjlen (5). Klik her for at se en større version af dette tal.

Den isolerede PHH viste et udbytte på 14,2 x 10 ⁶ ± 6,6 x 10 ⁶ levedygtige PHH / g levervæv og en levedygtighed omkring 76.6 ± 4,2% (tabel 3 ^1). Mikroskopisk synlige træk var en typisk stor cytoplasmatisk volumen i kombination med lipiddråber og mellem en og fire kerner, (figur 3A). Cellestørrelsen varierer mellem 20 til 30 um i suspension.

KC var den mest almindelige celletype i NPC fraktionen. Vi isoleret ca. 1,9 x 10 ⁶ ± 0,2 x 10 ⁶ levedygtige KC / g levervæv med en levedygtighed på 92,8 ± 3,5% (tabel 3 ^1). KC er meget små celler (ca. 5 um) med en lav cytoplasma / kerne-forhold og typiske mikrovilli på overfladen (figur 3B).

Endelig brugte vi MACS adskillelse teknik til at adskille CD31-positive LEC fra den resterende CD31-negative HSC. Udbyttet af LEC var ca. 2,7 x 10 ⁵ ± 0,1 x 10 ⁵ levedygtige LEC / g livER væv og den opnåede levedygtighed var 95,6 ± 2,8% (tabel 3 ^1). Fastlagte kriterier er det multiple granulat og en størrelse på omkring 10 um i cellesuspensionen (figur 3C) samt den karakteristiske spindel form efter kort dyrkningstid (figur 3G).

Isoleringen proces førte en HSC udbytte ca. 4,7 x 10 ⁵ ± 0,2 x 10 ⁵ levedygtige HSC / g lever (N = 8) med en levedygtighed på 89,6 ± 3,8% (tabel 3 ^1). Mikroskopisk identificerbare karakteristika var en størrelse på omkring 20 um og en typisk granuleret udseende med en varierende mængde af lipiddråber (figur 3D).

Tabel 3: Afgiver levedygtighed og renhed af isolerede PHH og NPC. Tre forskellige donorer blev evalueret. Data er givet som middel ± SD. Denne tabel blev offentliggjort før i Pfeiffer et al. ^1, 2014 og er genoptrykt med tilladelse fra Experimental Biology and Medicine.

Til identifikation og bestemmelse af cellekultur renhed, blev hver isoleret fraktion celle behandlet med antistoffer mod celle typespecifikke antigener. Cellerne blev behandlet med fluorescerende sekundære antistoffer og undersøgt ved immunfluorescensmikroskopi. Renheden blev bestemt ved tælling positive fluorescerende farvede celler i forhold til det samlede celleantal visualiseret ved Hoechst-farvning.

Efter 24 timers dyrkning PHH viste en karakteristisk polygonal form og ofte polyploidi (figur 3E). PHH var positive for CK 18 (fig 3I) og viste en renhed på 92,3 ± 3,2%(Tabel 3 ^1).

KC levet inden for 20 minutter på cellekultur plastoverflader. Efter blev observeret en inkubationstid på 24 timers små runde celler med en fremtrædende rund cellekerne (figur 3F). Overfladeproteinet CD68 blev anvendt til at identificere KC (figur 3J). Renheden af CD68-positive celler udgjorde 81,0 ± 5,4% (tabel 3 ^1).

På trods af den MACS adskillelse hjælp CD31 mærkning under NPC adskillelse var det stadig muligt at farve isoleret LEC med CD31. Derfor isolerede og dyrkede LEC blev farvet med CD31 til identifikation og bestemmelse af renhed. Derudover viste LEC immunoreaktivitet for mesenchymale cellemarkør vimentin (Fig 3K). Vi observerede ca. 81,0 ± 1,7% af positive farvede celler (tabel 3 ^1). HSC med deres typiske prominente lipiddråber (figur 3H) var præget af immunfluorescensfarvning for GFAP (Figur 3 I). HSC renhed var 93,0 ± 1,7% (tabel 3 ^1).

Hver fraktion celle blev modfarvet med andre NPC markører. Alle cellefraktioner indeholdt en lille antal andre specifikke celletyper lever, men var negative for hepatocyt markør CK18 og cholangiocyte markør CK19.

. Figur 3: Morfologi af human parenchymale og ikke-parenchymale leverceller i suspension og efter vedhæftning Den venstre kolonne (A - D) viser de forskellige isolerede lever cellepopulationer direkte efter isolation procesi fasekontrastmikroskopi baggrund: PHH (A), KC (B), LEC (C), og HSC (D). Den midterste kolonne (E - H) præsenterer billeder af isolerede og dyrkede PHH (E), KC (F), LEC (G) og HSC (H) efter 24 timers dyrkning (fasekontrast mikroskopi). Immunofluorescens-baserede karakterisering af de forskellige celle fraktioner er vist i sidste kolonne: PHH viste positive signaler for hepatocyt markør CK18 (I, 24 timer efter isolering), KC var positive for CD68 (J, 24 timer efter isolering), LEC viste positive signaler for vimentin (K, 72 timer efter isolering) og HSC var positive for GFAP (L, 72 timer efter isolering). Cellekerner blev farvet med Hoechst; Forstørrelse: 400 x. Modificeret fra Pfeiffer et al. ^1, 2014 med tilladelse fra Experimental biologi og lægevidenskab. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den publicerede protokol beskriver en teknik til at isolere rene PHH og NPC, nemlig KC, HSC og LEC, samtidig i høj kvalitet og renhed fra den samme prøve af humant levervæv. Hovedparten af publikationer, der beskæftiger sig med lever celle isolationer kun omfatte en af de cellepopulationer ^18-20 og isolation procedurer udført med humant væv er sjældne (gennemgået af Damm et al.) ^21. Tilpasning af metoder, der er etableret med animalsk væv (f.eks rottelever) til human lever afsløret flere forskelle i celle egenskaber mellem dyr og mennesker cellepopulationer. Etableringen af ​​en levercelle isoleringsmetode dækker de forskellige liver cellepopulationer afslørede, at kombinere parenchymale og ikke-parenkyme celler isolation er et kritisk trin på grund af forskellen i fordøjelsen tid, der kræves til optimerede resultater. Facing denne udfordring vi udviklet en lever celle isolation protokol kombinere forskellige teknikker og tilpasset dense til vores PHH isolation protokol ^10.

Ved tilsætning af 10% FCS til collagenase P indeholdende Opløsning II var vi i stand til at reducere den proteolytiske aktivitet af proteaser. Denne modifikation tillod længere fordøjelse gange, der er nødvendige for at få et stort antal NPC. Følgelig kunne vi isolere PHH samt NPC af god kvalitet og i høj mængde. Vellykket levercelle isolation afhænger meget af den oprindelige væv kvalitet. Donoren data og anamnese kan påvirke kvaliteten og mængden celle. Fra vores erfaring er der ingen sammenhæng med donor specifikke faktorer og også meget erfarne medarbejdere kan blive konfronteret med mislykket celle isolation. Fordi kvaliteten af ​​donorvæv er et kritisk punkt, alle eksterne kilder, som kan forringe kvaliteten væv, skal minimeres.

Mest kritiske faktorer er varm iskæmi tidspunkter efter det kirurgiske indgreb og kolde iskæmi gange under transport af vævet to laboratoriet. Derudover bør undgås nogen kilder til bakterielle infektioner. Det skal bemærkes, at nogle gange organet selv kan indeholde bakteriel forurening, fx i tilfælde af galde tract sygdomme. Kritiske trin i isolationsproceduren dække perfusionen tider og densitetsgradientcentrifugering trin. Den første perfusion skridt skal vare 20-30 min. Kortere perfusion gange kan føre til ufuldstændig frigørelse af celle-celle-kontakter resulterer i forekomsten af ​​celleklynger i den opnåede cellesuspension. En forlænget første perfusion reducerer cellelevedygtighed og inducerer celle stress på grund af Ca2 ⁺ depletion.

Det andet perfusion trin udføres for enzymatisk vævsfordøjelse kræver en vis erfaring til at bestemme den optimale fordøjelse grad for at træffe afgørelse om at stoppe den proteolytiske reaktion på det rigtige tidspunkt. Korte fordøjelsesperiode føre til lave udbytter og forlænget fordøjelsesperiode til celle stress og celleskader.Fra vores erfaring tidsrammen mellem ufordøjet væv og beskadiget væv under omsætningen ligger ofte inden for et vindue på 1-3 min. En ufuldstændig perfusion kan imødegås ved at flytte trykket i vævet ind i et andet område ved hjælp af klemmer til at knibe off kanyler. Derudover blødt tryk med en spatel mod vævsprøven fører til en ændring i vævsperfusion. Vævet komprimeres og de indre tryk stiger. Efterfølgende blodkarrene også komprimeres og deres radius aftager. Med et fald i radius, modstanden stiger (Hagen-Poiseuille lov) og perfusionen løsning foretrækker vejen med mindst modstand og gennemløber vævet andre områder. I overensstemmelse med Baccarani og medarbejdere observerede vi, at fibrotisk eller cirrose væv har brug for en længere fordøjelse periode fører til lavere celle levedygtighed ^22. Af denne grund anbefales det at undgå væv af patienter med leverfibrose eller cirrose.

Forberedelsen oghåndtering af densitetsgradienter samt høst celler ud af gradienter (se trin 5 og 7) også omfatte kritiske trin. De forskellige densitetsgradient lag og cellesuspensionen skal overføres i en langsom og omhyggelig måde for skabelsen af ​​skarpe interphases. Derudover er der altid risiko for at beskadige gradient under håndteringen, især mens høst af cellerne. Under NPC adskillelse vedhæftningen adskillelse skridt er afgørende for senere udbytter og renheden af ​​alle NPC fraktioner. At øge celle antal ikke klæbet NPC og renheden af ​​KC et yderligere vasketrin kan være nyttig. Vaskeopløsningen af ​​dette trin pooles med supernatanterne for yderligere NPC separation. For at undgå forurening med bakterier, svampe eller virus strenge aseptiske forhold skal sikres ^23.

I afhængighed af de krævede cellepopulationer protokollen kan ændres og tilpasses ved at springe specifikke skridt. For eksempel hvis kun KC erkrævede den dobbelte centrifugering skridt for NPC sedimentering kan reduceres til det andet centrifugeringstrin og kan være faldet trinene for HSC og LEC adskillelse. Perfusion tider og g-kraft for centrifugering kan også varieres i afhængighed af væv og celler kvalitet. Fibrotisk væv kræver langvarig fordøjelsesperiode, derfor er der et behov for at omhyggeligt at kontrollere vævet elasticitet. Ophobning af lipiddråber i fedtholdige hepatocytter falder celledensiteten og ændrer derfor bundfældningstanke egenskaber. Ifølge vores observationer kan det være nyttigt at indstille g-kraft under PHH isolation afhængigt af lipidindholdet af PHH, når høje PhH mængder er nødvendige. Det skal bemærkes, at eventuelle ændringer i den oprindelige centrifugering skridt negativt vil påvirke NPC isolation med hensyn til kvalitet og kvantitet. Indtil videre anbefaler vi g-kræfter mellem 50 xg (hepatocytter med lavt fedtindhold) og 150 xg (hepatocytter med højt fedtindhold). Derudover fede HEPAtocytes tendens til at danne en mindre kompakt cellepellet efter densitetsgradient centrifugering, og yderligere cellehøst skal ændres som beskrevet i trin 5.5.

For at fremskynde isoleringsproceduren nogle trin kan udføres samtidigt. For eksempel parallelt med oprensning af de isolerede hepatocytter en anden person kan begynde med NPC isolation. Derudover de gradient løsninger tæthed kan være forberedt på forhånd. Hvis der er mere end to personer kan udføres endnu flere trin på samme tid.

I sammenligning med andre menneskelige levercelle isolation protokoller vores resultater viser tilsvarende eller højere celle udbytter og levedygtighed som tidligere offentliggjort i Experimental Biology and Medicine ^1. For KC isolation Alabraba og medarbejdere demonstrerede isolation resultater med et udbytte på 2,3 x 10 ⁶ levedygtige KC / g levervæv kombineret med en levedygtighed på ca. 98% ^13, der er sammenlignelige medvores KC resultater (celleantal: 1,9 x 10 ⁶ levedygtige KC / g levervæv, levedygtighed ca. 93%). De fleste af de offentliggjorte LEC isolation data beskriver isolationer fra hele organer ^15,24. Gerlach og medarbejdere samt Lalor og medarbejdere isoleret celletal mellem 10 ³ og 10 ⁶ celler / organ ^15,24. Disse data kan ikke sammenlignes direkte til celle isolationer fra vævsprøver. Men ved hjælp af vores protokol viste vi udbytter for LEC 2,7 x 10 ⁵ levedygtige LEC / g levervæv, som er langt større, når ekstrapoleres på en hel orgel. HSC blev isoleret med et udbytte på omkring 4,7 x 10 ⁵ levedygtige HSC / g levervæv og levedygtighed omkring 90%. Eksisterende resultater offentliggjort af Friedman og kolleger viste halvdelen lavere celle udbytter (2,3 x 10 ⁵ HSC / g lever), men en tilsvarende renhedsgrad (91%) ^14. Vedrørende vores protokol, kan lave celle udbytter skyldes dårlig perfusion og fordøjelse på grund af lav eller ingen cirkulation af 1x Perfusion-Solution I og fordøjelse-løsning i vævet. Derudover gasbobler i væv kan forstyrre intra-væv cirkulation af 1x Perfusion-løsning Jeg og fordøjelse-Solution. I disse tilfælde kan perfusion forbedres ved forøgelse af perfusion tryk og fjernelse af gasbobler ved klemning enkelt kanyler og / eller med en spatel ved at skubbe imod vævsprøven. En dårlig rentabilitet er i de fleste tilfælde en konsekvens af celle stress. Langvarig iskæmi gange, skader af Ca ²⁺ udtømning og proteolyse af membranproteiner er knyttet til celle skader, synlige ved blærer i cellemembranen. Fra vores observationer disse celler en meget følsomme for forskydningsspænding og i de fleste tilfælde dør under isolationsproceduren. Sammenfattende vellykket isolering og adskillelse af parenkymale og ikke-parenchymale leverceller kræver, at der udføres kritiske trin i den rigtige tidsramme, udføres pipetteringstrin omhyggeligt og generelt tidspunktet for celleisolering og adskillelse should holdes så kort som muligt ^21. En ulempe ved den beskrevne protokol er, at isolation betingelser (f.eks perfusion gange) ikke kan være helt standardiseret, men vil blive tilpasset individuelt til kvalitet væv. Desuden kan udbyttet og renheden af ​​de opnåede cellepopulationer variere i afhængighed af kvaliteten væv og fordøjelsen resultat.

Vi offentliggjorde for nylig en undersøgelse, der viser indflydelsen af dyrkningsbetingelser kombineret med funktionel karakterisering af hver NPC celletype isoleret ved denne metode ^en. Muligheden for at isolere og separate forskellige cellepopulationer i leveren tillader oprettelse af innovative human lever celle co-kulturer og væv-manipuleret in vitro lever-modeller. Det er velkendt, at PHH dyrkning i 2D mono-kulturer fører til dedifferentiering og tab af typiske cellefunktioner ^7. Af denne grund er det nødvendigt at efterligne in vivo væv architektur inden in vitro liver modeller. Kostadinova og kolleger (2013 ^8,9) samt Messner og kolleger (2013 ^8,9) med succes etableret funktionelle co-kultur lever modeller til påvisning af hepatotoksiske effekter. Imidlertid blev NPC ikke karakteriseret og specifikke funktioner blev ikke undersøgt i disse systemer.

Derfor bør yderligere forskning fokusere på undersøgelser på overlevelse NPC langsigtet, deres særlige karakteristika og interaktioner inden co-kulturer. For sådanne undersøgelser, kunne det også være af interesse for at etablere en protokol til isolering af cholangiocytes. Realisering af funktionelle in vitro-co-kulturer, herunder alle celletyper indeholdt i den oprindelige leveren kunne være et yderligere skridt i retning af in vivo som menneskelige lever modeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G