Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Органотипической Высокая пропускная система для характеризации наркотиками чувствительности первичных клетки множественной миеломы

Published: July 15, 2015 doi: 10.3791/53070
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cancer Imaging and Metabolism, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute

Abstract

В этой работе мы описываем новый подход, который сочетает в себе Экс Vivo анализов чувствительности препарат и цифровой анализ изображения для оценки химиочувствительность и неоднородность множественной миеломы (ММ) клеток пациента, полученных. Этот подход состоит в посеве первичных клеток ММ недавно извлеченные из аспирации костного мозга в микрофлюидных камер, реализованных в нескольких луночных планшетах, каждый из которых состоит из реконструкции микросреды костного мозга, в том числе внеклеточного матрикса (коллаген или базальную мембрану матрицы) и стромы (на пациента мезенхимальных стволовых клеток) или эндотелиальные клетки человека, полученные (HUVECs). Камеры накачивают различных агентов и концентрациях и загружаются последовательно в течение 96 ч с помощью светлой микроскопии, в моторизованной микроскопа, снабженного цифровой камерой. Цифровой программного обеспечения для анализа изображений обнаруживает живых и мертвых клеток из наличия или отсутствия движения мембраны, и генерирует кривые изменений в жизнеспособности как функции ое концентрация препарата и время экспозиции. Мы используем вычислительную модель для определения параметров химиочувствительность населения опухоли на каждого препарата, а также количество групп населения, присутствующих в качестве меры опухоли неоднородности. Эти модели пациентом с учетом затем могут быть использованы для моделирования терапевтические режимы и оценить клинический ответ.

Introduction

Цель этого метода заключается в характеристике чувствительности к лекарству множественной миеломы (ММ) первичные ячейки в панели агентов экс естественных условиях, как можно ближе к физиологическим условиям, и с достаточной точностью, что эти результаты могут быть использованы для идентификации химиорезистентных югу популяции в пределах опухолевой и, в конечном счете, параметризации вычислительные модели, предназначенные для оценки клинической реакции.

Вычислительные модели являются мощными инструментами для анализа сложных систем, таких как рак хост-терапии взаимодействий. Тем не менее, модели только так хорошо, как данные, используемые для параметрирования. К сожалению, большинство данных, доступных в литературе не может быть использован в его текущей форме для параметризации таких моделей, так как они часто получают в взаимоисключающих экспериментальных условиях. Таким образом, новые эксперименты часто требуются с целью получения набора экспериментальных параметров, необходимых. Большинство жизнеспособность анализы, однако, являются разрушительными и йнам ограничено небольшим количеством временных точках, как правило, только один. Это значительно затрудняет использование химиочувствительность анализов для параметризации вычислительной модели, поскольку такие эксперименты не предоставляют информацию о временной динамики системы. Это особенно верно с первичными раковых клеток, которые часто ограничены до нескольких миллионов в образце, и имеют короткую продолжительность жизни после биопсии, тем самым ограничивая число доступных экспериментальных условиях. Кроме того, большинство жизнеспособности анализы требуют отделение от рака неонкологической (стромы) клеток на момент количественного, который добавляет дополнительную работу с протоколом, дополнительно возмущает клетки, и ограничивает количество экспериментов, которые могут быть выполнены ,

40 лет назад, лосось и сотрудники 1 предложила их знаменитый в пробирке анализа формирования колонии для оценки химиочувствительность опухолевых клеток. К сожалению, этот анализ обнаружил переменным успехом из-за малого числа множественных MYEлома (мм) образцов пациентов, которые были способны образовывать колонии в контрольных условиях: Было подсчитано, что только небольшая подгруппа 0,001% до 0,1% клеток ММ были способны к репликации, которые называют как множественная миелома стволовых клеток 2. Это значительно ограничивает вероятность успеха анализа и ряд препаратов, которые могут быть проверены в одно время, даже в более поздних моделях 3. Этот вопрос гораздо более важно сейчас, когда MM агенты (стандартные или экспериментальные), являются более многочисленными, чем четыре десятилетия назад.

Основным недостатком этих ранних анализов является их дихотомии выход: либо пациент "чувствительный" или "устойчивых" для конкретного препарата. Никакая информация не предоставляется в отношении степени чувствительности и неоднородность населения опухоли. Таким образом, пациенты с небольшими субпопуляций быстрорастущих клеток, резистентных к будут классифицироваться как «чувствительны» к терапии, но будет рецидив в ближайшее время, и, таким образом, не бенefit от лечения. Учитывая важность продолжительности ответа в общей выживаемости (OS) больных раком 4,5, это ясно, как эти анализы не смогли должным образом оценить ОС последовательно.

Для того, чтобы обойти эти ограничения, и быть в состоянии генерировать конкретного пациента вычислительные модели, которые бы оценить персональную клинический ответ на панели наркотиков, мы разработали метод для чувствительности неразрушающим тестирование наркотиков множественной миеломы (ММ) клеточных линий и первичные клетки мм экс естественных условиях реконструкции микросреды костного мозга, в том числе внеклеточного матрикса и стромы 6. Этот анализ, однако, было ограничение, опираясь на конкретном коммерческом микрофлюидного горкой, чьи размеры и стоимость ограничили количество экспериментов или лекарств, которые могут быть выполнены сразу в данной части оборудования.

Здесь описано система расширяет этот оригинальный анализ в высокой-throughput органотипической платформу доза-ответ, для скрининга в пробирке наркотиков, основанный на алгоритме анализа цифровых изображений в неразрушающим количественно жизнеспособность клеток. Каждый хорошо в 384 или 1536-луночных планшетах является 3D-реконструкция микроокружения костного мозга, в том числе первичных клеток ММ, внеклеточного матрикса и пациентом происходит стромы и факторов роста. Живой микроскопии и анализа цифровых изображений используются для обнаружения события клеточной гибели в разных концентраций препарата, которые используются для создания поверхностей доза-ответ. Из данных в пробирке, математическая модель определяет размер и химиочувствительность субпопуляций в пределах опухолевой пациента, и может быть использован для моделирования, как опухоль будет реагировать на препарат (ы) в физиологических условиях в клиническом режиме 6 ( Фигура 1).

Основные новшества этой платформы являются: (а) небольшое количество раковых клеток, необходимых (1000-10000 за наркотиками ОБОГАЩЕНИЯпаек); (Б) оценка эффективности препарата в физиологических условиях (внеклеточного матрикса, стромы, пациентов факторы роста); (С) Нет токсичность жизнеспособности маркеров 7, поскольку только яркой визуализации поля не используется, таким образом, нет необходимости для трансфекции клеток с флуоресценции 8 или 9 биолюминесценции; (D) непрерывного изображения обеспечивает эффект наркотиков в зависимости от концентрации и времени воздействия (фармакодинамики); и (е) интеграция между в пробирке и вычислительных эволюционных моделей, чтобы оценить клинические результаты (6 Silva и др., в процессе подготовки).

Ключевым фактором, который позволяет алгоритм анализа цифровых изображений, чтобы различить рак из стромальных клеток является их отличается сродством к нижней части скважины: клетки ММ не прилипают, и остаются во взвешенном состоянии в матрице, в то время как стромальные клетки прилипают к нижней части Ну а потом растянуть.

Это разделение происходит, несмотря мм и стромы аповторно засевали в то же время, и происходит во время O / N процессе инкубации. Спиннинг вниз в центрифуге следующие посев пластины дополнительно ускоряет этот процесс. Как следствие, клетки ММ предстанет в образе как круглых ярких дисков, окруженных темным кольцом, в то время как стромы поддерживает низкий профиль и более темный оттенок (рис 2). Таким образом, анализ в его нынешнем виде лучше всего подходит для неадгезивных раковых клеток, хотя коррективы в алгоритм может быть сделано для отдельного рака и стромы на основе других морфологических особенностей, таких как размер и форма. В этом протоколе мы опишем два типа внеклеточного матрикса (коллаген и базальной мембраны матрицы), а также два типа сокультурах, с (костный мозг мезенхимальных стволовых клеток) BMSC и HUVECs, представляющий интерстициальные и периваскулярные ниши костного мозга соответственно.

Использование 384-луночного планшета с 5 концентрации препарата в два повтора и мы смогли ТЭСт до 31 различных препаратов с образцом одного пациента. В 1536-луночных планшетах это число 127. На рисунке 3 изображен макет в настоящее время используется для ручного посева клеток, в то время как Справочная Рисунок 1 представляет собой оптимальное распределение помощью робота пипетки. При проектировании на рисунке 3, каждый 384-а пластина может перевозить 3 пробы пациентов с 7 различных препаратов, или один образец пациента протестированы с 21 препаратов. Каждый препарат представлен 5 концентраций, и каждое условие высевают в дубликатах. 4 контрольные лунки (лекарственное средство не добавлено) высевают для каждого набора 7 препаратов (например, скважины 36-39, 126-129 и 200-203). Для обеспечения потенции лекарств, используемых, линии клеток миеломы человека (например, H929 или MM1.S) также семенами, и наркотики в двух экземплярах на самом высоком концентрации каждого из препаратов, используемых (скважины) 76-89. Положительный контроль клеточной линии гарантирует, что препараты, используемые иметь достаточное потенцию, так как их АЧХ дозы сравнимы переменного токаРосс эксперименты. Две скважины высевают с миеломной клеточной линии в качестве контроля для условий окружающей среды, иными словами, чтобы обнаружить возможные проблемы в настольной инкубаторе во время съемки (75 скважин и 90). Перечень скважин следует зигзагообразный узор, чтобы уменьшить расстояние, пройденное автоматическими столик микроскопа, который сокращает время приобретения и уменьшает износ оборудования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование человеческих клеток, полученных при биопсии, как описано ниже, утвержденных Экспертный совет Moffitt и проводимых под клиническом испытании МСС # 14745, проведенного в Ли Moffitt онкологического центра Х. и научно-исследовательского института.

1. Сортировка ММ клетки костного мозга аспирации,

  1. Сбор аспираты костного мозга (20 мл) у пациентов в гепарина натрия шприца.
  2. Изолировать мононуклеарных клеток центрифугированием разбавленный мозга (1: 1 со стерильным PBS) в течение стерильной водной среде центрифугирования градиента при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. Соберите интерфейс, который содержит одноядерные клетки. Вымойте клеток с PBS и холодной рассчитывать с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток, используя трипанового синий для определения жизнеспособности.
  4. Подготовьте клеточный препарат слайд тонкослойной 10 и пятно Райт-Гимза, чтобы оценить процент плазматических клеток 11.
  5. Вычислятьколичество CD138 бусинок, которые будут использоваться на основе количества клеток и процент плазматических клеток. Если исходный образец составляет менее 20% плазматических клеток, а затем вновь приостановить клеток с использованием 90 мкл буфера разделения и 10 мкл из бисера CD138 в 5 х 10 6 клеток. Если исходный образец является более 20% плазматических клеток, ресуспендировали с использованием 80 мкл буфера для разделения и 20 мкл бусин CD138 на 1 х 10 7 клеток.
  6. Инкубируйте клетки с бисером при 4 ° С в течение 15 мин.
  7. Pass клетки через 35 мкм фильтр добавляется к предварительно смоченной разделение (LS) колонки размещены в сепараторе магнитном поле (см перечень материалов).
  8. Удалить столбец из магнита. Сбор CD138 + клетки путем промывания колонки 3 раза по 1 мл буфера для разделения.
  9. Оценка CD138 обогащение с другом окрашенных подготовки тонкослойной клеток слайд 10.
  10. Фильтр плазмы получены из биопсии костного мозга у каждого пациента с шприцевой фильтр 0,22 мкм. Используйте свежие плазмыот того же больного, в CD138 + клеток.
  11. Подготовьте носитель для эксперимента, дополняя RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 10% плазмы пациента и 1% пенициллина-стрептомицина.
  12. Соберите проточного выбора (CD138-) и следуйте классический метод адгезии 12, чтобы выбрать для мезенхимальных клеток костного мозга (BMSCs). Так как этот процесс требует недель до BMSCs готовы для использования, необходимо иметь готовые BMSCs от предыдущих пациентов или здоровых доноров.

2. Посев Ячейки в пластинах (с использованием ручной многоканальный дозатор)

  1. С помощью MULTI-луночного планшета с (384 или 1536) с черными стенами и прозрачный плоское дно, преимущественно один оптимизированный для оптических приложений и в клеточной культуре.
  2. Сотрудничество культуры BMSCs с MM клетки в любом коллагена типа I или базальной мембраны матрицы, тем не менее, требуют HUVECs базальной мембраны матрицу.
  3. Держите окончательные плотности каждого типа клеток вследующий набор: 3 х 10 5 клеток / мл для клеточных линий ММ, 2 х 10 5 клеток / мл для HUVECs или BMSCs, и 2 х 10 6 клеток / мл для пациентов, полученных клеток ММ.
    Примечание: Эти плотности результат экспериментальной оптимизации для обеспечения максимально возможного качества изображения и как можно дольше, сохраняя изображения биологическую значимость в анализах. Клеточные линии ММ высевают при более низких плотностей, чем первичных клеток ММ в связи с их большей скоростью репликации и большего размера.
  4. Совместное культивирование первичных клеток ММ с BMSCs:
    1. Подготовьте 100 мкл аликвоты предварительно смешанной технике, состоящей из 20 мкл 10х MEM, 20 мкл деионизированной H 2 O, 10 мкл 7,5% раствора бикарбоната натрия и 50 мкл 1x RPMI 1640 и хранить при 4 ° С.
    2. Во время посева пластины с клетками ММ, смешать аликвоты предварительно смешанной среде с 150 мкл 3,1 мг / мл бычьего коллагена типа I, до конечного объема 250 мкл.
    3. Re-SUSPконец 50 мкл клеток в среде RPMI 1640 в шесть раз конечной желаемой плотности.
    4. Смешайте в клеточной суспензии с коллагеном смеси для создания конечного объема 300 мкл с использованием P200 пипетки.
    5. Использование ручного или ретранслятора пипетки, наносить каплю 8 мкл конечного клетки / матрица смесь в центре каждую лунку в 384-луночные планшеты, или 2 мкл в каждую лунку 1536-луночных планшетах (этап 2.6 для примера пространственного расположения скважин).
    6. Центрифуга пластины в течение 2 мин при 500 х г сосредоточить все клетки в той же фокальной плоскости во время съемки.
    7. Оставьте пластину в инкубаторе (5% СО2, 37 ° С) в течение 1 ч, в течение полимеризации геля.
    8. Добавить 80 мкл питательной среды, дополненной (RPMI-1640, 10% FBS Привет, 10% пациента, полученных в плазме, 1% P / S) в каждую лунку в 384-луночных планшетах или 8 мкл в 1,536-луночных планшетах.
    9. Оставьте пластина O / N в инкубаторе (5% СО2, 37 ° С) для сцепления стромы к нижней части пластины.
  5. Со-Culture первичных клеток ММ с HUVECs:
    1. Передача базальной мембраны матрицы от -80 ° С до ведро со льдом, чтобы растопить.
    2. Количество и повторно приостанавливать первичные элементы и HUVECs в среде RPMI-1640 в 4 раза конечной плотности, каждый в отдельной трубке.
    3. Смешайте пациента клетки и объемы HUVECs в пропорции 1: 1.
    4. После базальной мембраны размораживают матрицы, но до сих пор не полимеризуется, смешать 1: 1 с клеточной смеси с предыдущей стадии.
    5. Семенной капли с достаточным объемом клеток-матрицы смеси в центре каждой скважины (8 мкл для 384-луночных планшетах и ​​2 мкл для 1536-луночных планшетах, см шаг 2,6 для примера пространственного расположения скважин).
    6. Центрифуга пластины при 500 мкг в течение 10 мин.
    7. Место пластины в инкубаторе (5% СО2, 37 ° С) в течение 1 ч для матрицы полимеризации.
    8. Добавить питательной среды (RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 10% плазмы пациента и 1% P / S) в каждую лунку (80 мкл для 384-луночных планшетах, 8 мкл на 1,536-луночные планшеты).
    9. Оставьте пластина O / N в инкубаторе (5% СО2, 37 ° С) для сцепления HUVECs к нижней части пластины.
  6. Семенной 384-луночного планшета с. Рисунок 3 показывает типичную пространственное распределение посева.
    1. Начиная с а В2, семена столько столбцов, сколько лекарства для тестирования. В примере на фиг.3, используют семь препаратов.
    2. Повторите посев столько раз, сколько концентрации, которые будут использоваться. В примере на фиг.3, используют пять концентраций.
    3. Семенной еще четыре скважины для контрольных условиях.
    4. Повторите шаги 2.6.1 и 2.6.2 для второго репликации.
    5. Повторите шаги 2.6.1 на 2.6.4 для каждого образца пациента для испытания в тарелку.
    6. Заполнение линии клеток ММ в двух линий скважин, каждая из которых, как много скважин, а препараты для тестирования (в двух экземплярах). Каждый из этих скважин будет рассматриваться с высокой концентрацией каждого препарата, чтобы гарантировать, что запас используется имел достаточную POTENCY (смотри рисунок 3, например).
    7. Семенной две скважины с клеточной линии ММ, чтобы служить в качестве контроля экспериментальных условий, таких как надлежащего функционирования настольной инкубатора, питательных сред, и др.

3. Посев клеток в пластинах (с помощью роботизированной пипетки)

Примечание: Эта серия шагов семян 384-луночного планшета с помощью пипетки робота. Конструкция пластины изображена на рисунке 1 Дополнительное, где первичные элементы мм проводятся против панели 31 различных препаратов в пяти различных концентрациях в двух повторностях, а также отрицательного контроля. Клеточная линия также высевают в качестве положительного контроля для оценки эффективности препарата и проходят от всех 31 препаратов при самой высокой концентрации, в двух повторностях. Файлы, являются для конкретной марки и модели (см таблицу материалов), но алгоритм может быть адаптирован к любым роботов дозаторов.

  1. Совместное культивирование клеток ММ первичнойс с BMSCs:
    1. Приготовьте 15 мл трубку, состоящую из 240 мкл 10x MEM, 240 мкл деионизированной H 2 O, 120 мкл 7,5% раствора бикарбоната натрия, 600 мкл RPMI 1640 1x и 1,8 мл 3,1 мг / мл бычьего коллагена типа I. Этикетка трубка, как «пре-микс для CD138 +". Поместите на льду до использования.
    2. Подготовьте 1,5 мл трубки, состоящее из 50 мкл 10х MEM, 50 мкл деионизированной H 2 O, 25 мкл 7,5% раствора бикарбоната натрия, 125 мкл 1x RPMI 1640 и 375 мкл 3,1 мг / мл бычьего коллагена типа I. Этикетка трубка, как «пре-микс для клеточной линии". Поместите на льду до использования.
    3. Повторное приостановить 300 мкл CD138 + клеток в среде RPMI 1640 в шесть раз конечной желаемой плотности. Повторное приостановить 300 мкл BMSC клеток в среде RPMI 1640 в шесть раз конечной желаемой плотности. Смешайте оба тома вместе в 1,5 мл трубки и этикетки "CD138 +". Поместите в инкубаторе до использования.
    4. Повторное приостановить 60 мклклеточная линия в RPMI 1640 в шесть раз конечной желаемой плотности. Повторное приостановить 60 мкл BMSC клеток в среде RPMI 1640 в шесть раз конечной желаемой плотности. Смешайте оба тома вместе в 1,5 мл трубки и этикетки "клеточной линии". Поместите в инкубаторе до использования.
    5. Использование программного обеспечения, поставляемого с роботизированной пипетки, загрузите первый файл сценария, "cell_seedingPt47.PGM". Поместите 200 мкл пипетки ценностей, планшет, и стерильный 384-луночный планшет на станциях А, В и Е, соответственно, робота.
    6. Смешайте содержимое пробирки "премикс для CD138 +" и "CD138 +". Перевести 1,5 мл, содержание которого также # 1 из лунок планшета. Поместите пробирку с остальной объем на льду. Запустите программу. Робот семена первые 176 скважин (11 левая колонки) пластины 384-а, а затем на паузу. Перевести остальные трубки на льду хорошо # 2 микротитрационного планшета. Резюме программы.Робот семена оставшиеся 144 лунки 384-луночного планшета и паузы.
    7. Смешайте содержимое пробирки "премикс для клеточной линии" и "клеточная линия" и передать содержимое хорошо # 3 микротитрационного планшета. Резюме программы. Робот семена оставшиеся 64 лунки планшета 384-а.
    8. Поместите 384-луночный планшет в центрифуге в течение 10 мин при 500 х г и 4 ° С. Передача пластины в инкубатор (5% CO 2, 37 ° C) в течение 1 ч для коллагена полимеризации.
    9. Загрузите второй файл сценария, "media_layer.PGM". Поместите 120 мкл пипетки коробку, резервуар с реагентом с 31 мл RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 10% плазмы пациента и 1% P / S, и 384-луночный планшет с клетками в станции А, В и Е, соответственно. Запустите программу. Робот передачи 81 мкл среды к каждой лунке. После завершения, передавать 384-луночного планшета для инкубатора и позволяет стромы придерживаться подложки O / N.
    2. 4. Подготовка наркотиков и наркотического опьянения пластин (с помощью ручного многоканальный дозатор)

    1. Подготовьте шаблон, аналогичный фиг.3, с тем чтобы облегчить процесс добавления препарата в лунки и уменьшить вероятность путаницы.
    2. Подготовьте, в 96-луночный планшет, серийное разведение каждого из препаратов, которые будут испытаны в пластине, например, в течение пяти концентраций с использованием 3-кратное разбавление:
      1. Добавить 120 мкл препарата на 10x желаемую концентрацию в высокой концентрации также. Например, можно использовать 500 мкМ Мелфалан если высокая концентрация клетки будут подвергаться в пластине будет 50 мкм.
      2. Добавить 80 мкл питательной среды (RPMI, дополненной 10% FBS, 10% пациентов, полученных плазмы и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S)) в четырех последующих скважин.
      3. Передача 40 мкл из первой скважины на второй и перемешать, до общего объема 120 мкл при 1/3 концентрации препарата первой скважины, или 167 мкм.
      4. Повторите шаг 4.2.3 для остальных скважин (например, передать 40 мкл из второго на третье, смешать, а затем перенести 40 мкл с третьего на четвертый и т.д.).
    3. Передача 8 мкл из каждого препарата, содержащего также в соответствующую лунку в клеточной пластинки. Каждый препарат, содержащий также должны иметь достаточный объем для 10 скважин в клеточной пластинки. В примере на фиг.3, каждая концентрация лекарственного средства добавляют к 6 различных скважин, для самой высокой концентрации, который добавляется к 8 лунок, за исключением.
    4. Добавить 8 мкл питательной среды (RPMI, дополненной 10% FBS, 10% пациентов, полученных плазмы и 1% P / S) в контрольных лунках.
    5. Место клеток в микроскоп, как только готова и включите Настольные инкубации.

    5. Подготовка наркотиков и наркотического опьянения пластин (с помощью роботизированной пипетки)

    1. Скачать файлы сценариев для роботизированной пипетки из http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS фантастическиеles.zip
    2. Загрузите сценарий "media_layer_DRUGPLATE.PGM" в роботизированной пипетки пользовательского интерфейса. Поместите 120 мкл пипетки коробку, резервуар 21 мл RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 10% плазмы пациента и 1% P / S и пустой 384-луночный планшет в станций А, В и Е, соответственно. Запустите программу, роботизированная пипетки будет добавить 30 мкл СМИ для всех скважин в 384-луночного планшета.
    3. После шаблона из Дополнительной фиг.2 добавить 200 мкл препарата на 20-кратным максимальной концентрации в каждую лунку микротитрационного планшета. Эта установка вмещает до 31 препаратов. Для контроля и (CTRL), добавить RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 10% плазмы пациента и 1% P / S.
    4. Поместите 120 мкл пипетки окно, планшет с 20-кратным препаратов в концентрации, и 384-а со средствами массовой информации (с шагом 5.1) на станциях, В и С, соответственно. Загрузите программу "drug_plate.PGM". Роботизированный пипетки создаст серийное разведение1: 3, после пространственного распределения на дополнительные фиг.1.
    5. Поместите 120 мкл пипетки окно, в 384-луночный планшет с разбавлением препарата (со стадии 5.3) и 384-луночный планшет с клетками со стадии (3.1.9) в станции A, B и C, соответственно. Загрузка и запуск программы "drug_add.PGM". Роботизированный пипетки будет передавать 8 мкл препарата из каждой лунки в планшете наркотиков, чтобы его аналог в клеточной пластинки. После завершения, передавать клеточной пластинки в инкубатор цифровой микроскоп, как можно скорее.

    6. Визуализация клеток в плиты

    Примечание: Процедура, описанная ниже относится к микроскопу Evos Автоматический FL, но могут быть легко адаптированы к другим моторизованных этапе микроскопов с настольной инкубации или инкубатора встраиваемый микроскопов.

    1. Очистите внутреннюю часть настольной инкубаторе с этанолом влажные салфетки и аккуратно снимите крышку пластины при размещении крышку Incubator.
    2. Следуйте инструкциям программного обеспечения, чтобы добавить маяки. Это термин, используемый для обозначения ориентиров для регионов интереса, чтобы быть отображены последовательно в ходе эксперимента (см Руководство пользователя программного обеспечения для деталей).
    3. Используйте 5X или 10X увеличения цели. Убедитесь, что внимание как на рисунке 2: MM клетки появляются как яркие диски, окруженные темным кольцом и BMSCs или HUVECs едва видны. Некоторые первичные клетки ММ очень малы и, таким образом, тонкая настройка может потребоваться, чтобы найти оптимальную фокусировку.
    4. Настройка интервала между приобретения 10-30 мин и продолжительностью не менее 96 часов. В то время как более длительные интервалы между приобретений являются приемлемыми, интервалы 45 мин или более, может значительно уменьшить точность измерения жизнеспособности.
    5. Настройка программного обеспечения, так что образы каждую лунку хранятся в отдельных файлах названных Маяк-1, Маяк-2, и т.д. Если используется роботизированная пипетки, установить маяки в порядке, показанном наСправочная Рисунок 3.
    6. Убедитесь, что имеется достаточно воды в инкубаторе увлажнитель и газа, так что клетки будут в оптимальных условиях.
    7. После завершения эксперимента, скопируйте папки, содержащие изображения на компьютер, который будет выполнять анализ.

    7. Количественная наркотиками Чувствительность

    Примечание: Следующие инструкцию использования анализа изображений с использованием компьютера кластера, так как анализ нескольких луночный планшет в персональном компьютере очень много времени.

    1. Скачать программное обеспечение ImageJ от НИЗ сайте: http://imagej.nih.gov/ij/
    2. Скачать сценарий и плагины в http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
    3. Следуйте инструкциям в http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf для запуска программного обеспечения цифрового анализа изображений. Результат должен быть таблица с именем Results.csv содержащий измерения жизнеспособности на регулярной основе для ВАСч и в пластине на протяжении эксперимента (т.е., 96 ч).
    4. При использовании ручного дозатора многоканальный, выполните следующие действия.
      1. Скачать файл http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt и изменять его в соответствии макет пластины, определенный в шаге 3.1 (например, рисунок 3).
      2. Скачать программное обеспечение http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar и запустить его с помощью файлов, созданных в шагах 5.3 и 5.4, как входной параметр. Результат будет имя папки Отчет, содержащий несколько таблиц, каждая группировка результатов для конкретного препарата.
      3. Копирование и вставка содержимого в шаблоне таблицы http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
        Примечание: результат должен быть графики, таких как тот, изображенный на рисунке 4, представляющего химиочувствительность образца для различных препаратов в зависимости от концентрации препарата и времени экспозиции.
        4. </ OL>
      4. При использовании робота пипетки, выполните следующие действия.
        1. Скачать файлы шаблонов из скачивать файлы сценариев для роботизированной пипетки из http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Template Files.zip и извлекать файлы в каталоге.
        2. Измените файл DrugList.csv в соответствии с перечнем лекарственных средств и высокой концентрации препарата в пластине с клетками. Следуйте макет Дополнительное рисунке 2.
        3. Запустите программу BuildExperimentalDesign.java проходящий в качестве параметра папку, содержащую файлы, извлеченные в шаге 7.5.1 и файлы Results.csv с шага 7.3. Результат должен быть две папки назвать MM1_S и PtSample. Первый содержит описание скважин (препаратов и их концентрации) для положительного контроля клеточной линии. Второй содержит ту же информацию, но в отношении части пластины затравку клеток пациента.
        4. Скопируйте файл Results.csv в каждом из каталогов, созданных в шаге 7.5.3. СкачатьПрограммное обеспечение http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar и запустить его с помощью файлов, созданных на этапах 7.5.3 для обеих папках. Результат будет имя папки Сообщить в каждой из папок, созданных в 7.5.3. Папка отчет содержит несколько таблиц, каждая группировка результатов для конкретного препарата.
        5. Запустите программу и передать BuildGraphPadFile.java в качестве параметра папку, содержащую файлы, извлеченные в шаге 7.5.1 и файлы Results.csv с шага 7.3. Результатом будет файл, содержащий GraphPad кривые доза-ответ для каждого из 31 лекарств, и нормализовали по контролю. Каждый график будет содержать 5 концентраций лекарственного средства для первичных клеток ММ и один концентрацию для положительного контроля клеточной линии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Поток эксперимента кратко описан на фиг.1 Если все шаги выполнены успешно, изображения, полученные с помощью микроскопа, должны быть эквивалентны Рисунок 2:. Живые клетки ММ должны быть четко видно, как светлые диски и BMSCs или HUVECs должны быть едва заметны и хорошо распределены в фоновом режиме. Как видно на фиг.2А, клетки ММ в диапазоне размеров от одного пациента к другому, но в целом они меньше, чем клеточные линии. Поскольку они практически не повторить экс виво в течение интервала эксперимента (96 ч), они могут быть посеяны в более высоких концентрациях (1-3 миллиона клеток / мл). Строма должны быть едва обнаружим, а BMSC придерживаться нижней части скважины и растяжения, представляя низкий профиль. Миеломной клеточной линией человеческой H929 значительно больше, чем пациентов полученных клеток ММ (фиг.2В), и воспроизводит в течение 24 ч. Для предотвращения скученности изображения, клеточные линии ММ смДед меньшую плотность, 0,3 млн / мл. рис 2С и 2D представляют пациента, полученных клетки ММ и клеточных линий миеломы человека H929, соответственно, совместно культивируют с HUVECs. HUVECs первый прилипать к нижней части скважины, а затем начинают контактировать друг с другом и образуют сети, которые позже становятся толще и с люмен.

Рисунок 4 иллюстрирует то, что можно ожидать от обрабатываемых видео, генерируемых алгоритмом анализа изображений, показывающий обнаружено живые клетки ММ псевдо-окрашены в зеленый цвет (фиг.4А) без или очень мало зеленого сигнала в BMSCs и HUVECs в конце эксперимента в высокой концентрации препарата, когда все клетки мм мертвых (4В). Программное обеспечение должно агрегировать результаты из разных скважин и построить диаграмму, изображающую постепенную потерю жизнеспособности со временем экспозиции при различных концентрациях наркотиков (фиг.4С). Кривая реакции дозыклеточная линия управления (например, H929 или MM1.S) должна быть такой же, как для предыдущих экспериментов; значительные отклонения могут указывать на проблемы с исходного раствора лекарственного средства, используемого в эксперименте.

Важно тщательно соблюдать все колодцы, засеянные перед началом процесса формирования изображения, а артефакты могут ввести в заблуждение программного обеспечения для анализа изображений и привести к ложным результатам. Например, 5А показан результат чрезмерной плотности BMSCs в то время скважины или слишком много, прошедшее между трипсином и посева, что приводит к этих клеток, образующих комки. 5В показана "колонии" клеток ММ. Если клеточные линии высевают при высокой плотности, они будут образовывать колонии, как они повторить, и это снижает точность алгоритма анализа цифровых изображений, как она становится все более и более трудно различить одну ячейку от другой. 5С показан пример противоположный, где слишком мало MM клетки высевали. ТЕго часто происходит, когда количество клеток ММ, полученных из аспирата костного мозга ниже 500000 и "мертвый объем" оставили в трубке перед повторным суспензии становится сравнимой с объемом сред, необходимых, чтобы повторно приостанавливать клетки ММ в больших плотностях , Чтобы решить эту проблему, определить мертвый объем для трубки используется и включить его в расчетах разбавления. Рис 5D показан пример скошенной фокальной плоскости. Обратите внимание, как клетки ММ на верхнем левом яркие и те, в правом нижнем углу темно. Это вызвано утра неравномерно размещены пластины или неправильно размещены цели. Это вызовет клетки ММ в различных участков изображения, которые будут учитываться по-разному. Масштабные бары (в правой нижней части каждого изображения) представляют 500 мкм.

Фигура 1
Рисунок 1. Общее описание протокола. () Во время кости Marroж биопсии один дополнительный тюбик аспирата получается для протокола. (B) множественной миеломы (ММ) клетки магнитно отделен от других клеток в аспирата. (с) три пробирки, содержащие клетки ММ (мм), не-клетки ММ и плазмы, соответственно, получают из процесса разделения. (D) костного мозга мезенхимальных стволовых клеток (BMSCs) из предыдущих аспирата ко-культивируют с свеже полученных клеток ММ, и ресуспендировали в внеклеточного матрикса (коллаген базальной мембраны или матрицы). (Е) пластина центрифугируют, чтобы гарантировать, что столько мм, возможно в той же фокальной плоскости, и BMSC готовы придерживаться нижней части скважины. Пластина помещается в инкубатор, пока матрица не полимеризуется. (F) В каждую лунку заполнена смесью питательных сред и пациента, полученных плазмы. Планшет инкубировали в инкубаторе O / N. (G) Препараты добавляли в каждую лунку, и планшет помещают в микроскопоснащен цифровой камерой, моторизованного столика и настольной инкубатора, и отображаемого на регулярной основе в течение 96 часов. (Н) Файлы изображений для каждой лунки анализируют, используя алгоритм, который сегменты жить клетки ММ на основе движения мембраны (живые клетки псевдо окрашены в зеленый цвет) и создает таблицу с изменением клетками для каждой лунки для каждой временной точки. Масштабная линейка (внизу справа) представляет 500 мкм. (I), программа группы лунок наркотиков и концентрации и создает таблицу с кривыми зависимости от дозы, нормированная так, что первоначальные меры на 100%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Предварительная наркотиков естественно появление скважин. () Клетки ММ совместно культивируют с стромы. (Б) миеломной клеточной линией человеческой H929 культивируют совместно с стромы. (С) пациента, полученных клетки ММ совместно с культурой HUVECs. (D) клеток человеческой миеломы линии H929 в сотрудничестве с культурой HUVECs. Масштабные бары (в правой нижней части каждой фигуре) представляют 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Рекомендуемая пространственное распределение скважин в 384-луночный планшет. Каждый 384-луночного планшета может нести 3 образцов пациентов с 7 разных препаратов или одного образца пациента тестируемых препаратов с 21. Уэллс в светло-зеленый, светло-голубой и коричневый, содержат клетки ММ из трех разных пациентов. Rx1, Rx2 и т.д., представляют собой различные наркотики, каждый на пяти различных концентрации и в двух экземплярах. Четыре лунки использовали в качестве контролей для каждого пациента (36-39 для пациента 1, 126-129 для пациента 2 и 200-203 для пациента 3). Уэллс в оранжевый содержать клеточные линии на высокой концентрации препарата каждого препарата, в двух экземплярах. Уэллс в желтый элементы управления клеточной линии (не наркотиков). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
4. Пример анализа цифровых изображений и графики доза-ответ. (А) клетки ММ в совместной культуре с BMSCs, встроенные в коллагена I, подвергается концентрации 50 нМ carfilzomib. Алгоритм анализа изображения обнаруживает живые клетки и псевдо-цвета их в зеленый цвет. (B) изображения получены с регулярными интервалами в течение всего срока эксперимента. В этом Концентрацна лекарства, почти все клетки погибли в конце 96 часов. (С) В таблице показано изменение числа жизнеспособных клеток в течение пяти различных концентраций carfilzomib вдоль интервалом 96 часов, нормализованное по времени = 0 ч за 100%. Линию клеток человеческой миеломы MM1.S использовали в качестве контроля для эффективности препарата. Масштабные бары (в правой нижней части А и Б) представляют 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Общие ошибки при посеве или изображений пластины. () Клеток стромы "запутался". (B) "Колонии" клеток ММ. (С) слишком мало клетки ММ. (D), с перекосом в фокальной плоскости. Масштабные бары (в правой нижней части каждого изображения) представляют 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 1 SUP
Справочная Рисунок 1. Оптимальное пространственное распределение скважин в 384-луночного планшета с помощью роботизированной пипетки. В этой конфигурации 31 различных препаратов может быть проверена на 5 различных концентрациях и 2 повторах (зеленый). Кроме того, положительные контроли с клеточной линии могут быть использованы для обеспечения потенции наркотиков (розовый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 Sup
Справочная Рисунок 2. Пространственное распределение Препарат "мастер тарелка". роботизированной пипетки будет использовать эту пластинку, где каждая лунка содержит одну из 31 препаратов в 20 раз концентрации, чтобы создать разбавления наркотиков пластину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 Sup
Справочная Рисунок 3. Нумерация скважин, которые будут использоваться при подготовке тарелку с роботизированной пипетки. Программное обеспечение, описанное в протоколе требуется этот нумерацию колодцев, чтобы адекватно карте скважин на наркотики и концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть крупная версия этой фигуры.

/ftp_upload/53070/53070fig4sup.jpg "/>
Справочная Рисунок 4. Сравнение микрожидком слайд (Khin и др., 2014) и текущий протокол. Доза отклика H929 множественной миеломной клеточной линией, измеренного в течение 24 ч в предыдущей системы (слева вверху бортезомибом, средний левый мелфалан) и в текущей системе ( верхний правый Бортезомиб и средним прямо мельфалан). Для сравнения, LD 50 на 24 ч для обеих платформ составила 3,9 нМ и 4,1 нМ для бортезомибом, и 6,4 мкм и 14,65 мкм для мелфаланом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В целом, это мощный и высокий метод пропускная количественно химиочувствительность первичных клеток ММ и бывших естественных условиях фармакодинамики лекарственных средств в реконструкцию костного мозга. Критические шаги в рамках этого протокола собственно посев из скважин и адекватной фокусировки (рисунок 2 для ожидаемых результатов): убедитесь, что MM и стромальных клеток равномерно распределяется, что стромальные клетки приверженцем нижней части хорошо, что все ММ клетки находятся в одной фокальной плоскости, и что клетки ММ обладают аспект ярко диска, окруженной темным кольцом.

В случае неправильного посева (рисунок 5), не продолжать эксперимента, а семена второй пластины. Если проблема обнаружена была низкой или высокой ММ или плотность стромы клеток, проверять концентрацию клеток в трубке перед посевом и ресуспендируют в регулярные промежутки времени в процессе посева, чтобы обеспечить равномерное распределение клетокв средствах массовой информации. Использование пипетки многоканальный с функцией повторителя или роботизированного дозатора может значительно уменьшить эту проблему. Доля клеток / матрицу на носитель (1:10), используемых в этом анализе стремились максимально увеличить количество скважин, которые могут быть посеяны и, таким образом, условия изученных. Тем не менее, для изучения растворимых факторов производимых или потребляемых раковыми клетками или стромы, рекомендуется, чтобы доля клеток / матрицу на носитель 1: 1.

Как в настоящее время осуществляется, эта система количественно только неадгезированных клетки. Для того, чтобы количественно изменения в клетками стромы обеспечение, необходимо будет изменить и доводят до морфологических характеристик стромы. Это было бы полезным свойством, чтобы изучить влияние раковых клеток или препаратов в строме отсека. Здесь описано, система также не может количественно клеточности адгезивных клеток рака, особенно, если они объединены с прилипшей стромы. Решение будет модификации в цифровой IMAGАлгоритм электронной анализ, чтобы отделить от рака стромы по морфологическим признакам, или предварительно инкубировать либо население с флуоресцентным красителем, который может быть использован для идентификации клеток с любой популяции.

Значение этого протокола по сравнению с предыдущими подходами способность оценить реакцию наркотиков первичных раковых клеток в естественных условиях реконструкции бывшего микросреды костного мозга в неразрушающего образом, так что последовательные измерения могут быть сделаны, обеспечивая тем самым более подробная информация о фармакодинамики, а не в фиксированных точках времени. Одним из ограничений нашего предварительного анализа 6 был линейный градиент генерируется путем диффузии препарата, который разрешено только оценку лекарственной чувствительности в линейной окне концентраций. Тока тест позволяет оценить жизнеспособность за любой диапазон концентраций препарата, так как каждый скважины отдельное юридическое лицо. Оба анализа, однако, генерировать эквивалентные результаты (

Среди многочисленных будущих приложений этого подхода, наша группа сосредоточена при помощи математических моделей для экстраполяции информации фармакодинамики предоставленную этих анализов в клинической реакции. Для достижения этой цели мы предлагаем, чтобы соответствовать точки данных, полученных (рис 4в) для каждого препарата к системе дифференциальных уравнений, описывающих динамику гибели клеток наркотиков индуцированных. Затем, путем нанесения на этих математических моделей известных фармакокинетических свойств каждого препарата в клинической режима, можно было бы оценить реальное реакции пациента 6. Благодаря автоматизации посев и давать наркотики с помощью роботизированной системы, можно было бы проверить не только уровень препаратов помощи, но и более ста экспериментальных препаратов на образец (в 1536-луночного планшета). Это открыло бы возможность для силиконового в клинических испытаниях, где сотни экспериментальных препаратов могут быть проверены вкогорты пациентов образцов, создавая, таким образом кривые выживания для виртуальных клинических испытаний 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Это исследование было профинансировано государством Флориды Бэнкхэд-Коли Team науки Грант (2BT03), Национальных Институтов Здоровья / Национального института рака (1R21CA164322-01) и Moffitt рака Центра Team науки Гранта. Эта работа была частично поддержана в трансляционных исследований основной комплекс в H. Lee Моффит онкологический центр и научно-исследовательский институт, в NCI назначенного всеобъемлющем онкологического центра (P30-CA076292). Доступ к первичных клеток стало возможным через Total Care протокола Рак в Центре рака Moffitt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EVOS FL AUTO AMG AMAFD1000 + AMC1000 Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind CORNING CLS3683 SIGMA Corning CellBIND 384 well plates
384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind CORNING CLS3832 ALDRICH Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus  GE Healthcare GE17-1440-02 SIGMA For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads Miltenyi  130-051-301 Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns Miltenyi   130-042-401 Column for separation of cells.
MidiMACS Separator Miltenyi  130-042-302 Magnet for separation column.
Matrigel Sigma-Aldrich E6909 SIGMA ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex Life Technologies A1413201 LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC Life Technologies C-003-25P-B Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media GIBCO 11875-093 RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated GIBCO 10082-147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I Advanced Biomatrix 5005-B Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS BIOTEK PRC3841 Robotic pipettor system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
  2. Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
  3. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  4. Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
  5. Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
  6. Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
  7. Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
  8. Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
  9. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
  10. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  11. Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
  12. Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
  13. Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236 (2012).

Tags

Медицина выпуск 101 множественная миелома лекарственная чувствительность эволюция лекарственной устойчивости численное моделирование системы поддержки принятия решений персонализированная медицина
Органотипической Высокая пропускная система для характеризации наркотиками чувствительности первичных клетки множественной миеломы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A., Jacobson, T., Meads, M.,… More

Silva, A., Jacobson, T., Meads, M., Distler, A., Shain, K. An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells. J. Vis. Exp. (101), e53070, doi:10.3791/53070 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter