Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

Abstract

Bu çalışmada biz, hasta kaynaklı multipl miyelom (MM) hücreler kemosensitiviteyi ve heterojenitesini tahmin etmek ex vivo ilaç duyarlılık testleri ve dijital görüntü analizi birleştiren yeni bir yaklaşım açıklar. Bu yaklaşım, hasta-Taze hücre dışı matrisin (kolajen ya da temel membran matrisi) ve stroma (dahil olmak üzere her kemik iliği mikro bir yeniden oluşan, çok oyuklu plakalara uygulanan mikroakışkan odaları içine, kemik iliği elde primer MM tohum hücreleri oluşur türetilmiş mezenkimal kök hücreleri) veya insandan türetilmiş endotel hücreleri (HUVECler). odaları, farklı ajanlar ve konsantrasyonları ile uyuşturulmuş olan ve bir dijital kamera ile donatılmış bir motorlu mikroskopta, parlak bir alan mikroskobu ile 96 saat süreyle sırayla görüntülenmiş. Dijital görüntü analiz yazılımı varlığı veya zar hareket yokluğu canlı ve ölü hücreleri algılar ve bir fonksiyon o kadar canlılığı değişim eğrileri üretirf ilaç konsantrasyonu ve maruz kalma süresi. Her ilaç, tümör nüfusun duyarlılığında parametrelerini yanı sıra, tümör heterojenite bir ölçüsü olarak, bu alt-popülasyonlarının sayısını belirlemek için bir hesaplama modeli kullanırlar. Bu hasta özel modeller daha sonra tedavi rejimleri taklit ve klinik yanıtı tahmin etmek için kullanılabilir.

Introduction

Bu yöntemin amacı, bu sonuçlar Kemoterapiye alt tespit etmek için kullanılabilir yeterli hassasiyetle, fizyolojik koşullara mümkün olduğunca yakın, ex vivo olarak ajanların bir panele birincil hücreler multipl miyeloma (MM), ilaç duyarlılığını karakterize etmektir tümör yükü ve içinde nüfusları sonuçta, klinik yanıtı tahmin etmek için tasarlanan hesaplama modelleri parameterize için.

Hesaplamalı modelleri, kanser konak-terapi etkileşimleri gibi kompleks sistemler, analiz etmek güçlü araçlardır. Ancak, modeller sadece veri onları parameterize eskisi kadar iyi. Ne yazık ki, literatürde mevcut olan en veriler genellikle birbirini dışlayan deney koşullarında elde edilenler gibi, bu tür modeller parametrelerini elde etmek için, mevcut biçimde kullanılamaz. Böylece, yeni deneyler genellikle gerekli deneysel parametrelerin set elde etmek amacı ile ihtiyaç vardır. Çoğu canlılık deneyleri, ancak, yıkıcı ve inci vardırBize zaman noktalarında az sayıda, genellikle sadece birine sınırlı. Bu büyük ölçüde bu tür deneyler sistemin zamansal dinamikleri hakkında bilgi vermek için başarısız beri kemosensitivite tahlillerin kullanımı, hesaplama modelleri parameterize için yaşlılık ve sakatlık. Bu genellikle, böylece mevcut deneysel koşullar sayısının sınırlandırılması, numune başına birkaç milyona sınırlı ve biyopsi sonra kısa bir ömre sahip olan primer kanser hücrelerinin, özellikle de geçerlidir. Buna ek olarak, çoğu canlılık deneyleri ayrıca hücreleri bozan ve yapılabilir deneyler sayısını sınırlar, protokole ekstra çalışma ekler ölçümü, zamanında olmayan kanser (stroma) hücrelerinden kanser ayrılmasını gerektiren .

40 yıl kadar önce, somon ve ortak ¹ tümör hücrelerinin duyarlılığında değerlendirilmesi için in vitro koloni oluşturma deneyi kendi ünlü önerdi. Ne yazık ki bu deney sayesinde çoklu mye az sayıda karışık başarı bulunduKontrol koşulları altında koloniler oluşturabilen edildi Loma (MM) hasta numuneleri: Bu, AA hücrelerin 0.1 ila% 0.001,% sadece küçük bir alt-grup replikasyon kabiliyetine sahip olduğu tahmin edilmiştir multipl miyelom kök hücreler ² olarak adlandırılan edilir. Bu anlamlı daha yeni modeller ^3, testin başarı oranını ve bir anda test edilebilir ilaçların sınırlı sayıda. (Standart ya da deneysel) MM ajanlar, dört yıl önce daha çoktur Bu sorun artık çok daha önemlidir.

Ya bir hasta belirli bir ilaca "hassas" veya "dirençli" dir: Bu erken tahlillerin önemli bir sınırlama onların ikiye bölünmüş çıkışıdır. Hiçbir bilgi tümör nüfusun duyarlılık ve heterojen derecesine ilişkin sağlanmaktadır. Böylece, hızlı büyüyen dirençli hücrelerin küçük alt popülasyonlar olan hastalar tedaviye "hassas" olarak sınıflandırılır, ancak kısa bir süre nüks olur ve böylece değil bentedaviden Efit. Kanser hastalarının ^4,5 genel sağkalım (OS) yanıt süresi önemi göz önüne alındığında, bu deneyler doğru sürekli OS tahmin etmek mümkün değildi nasıl açıktır.

Amacıyla bu sınırlamaları aşmak için, ve uyuşturucu bir panele kişiselleştirilmiş klinik yanıtı tahmin ediyorum hastaya özgü hesaplama modelleri üretmek edebilmek için, biz multipl miyelom (MM) hücre hatlarının olmayan yıkıcı test ilaç duyarlılığı için bir yöntem geliştirdik ve hücre dışı matriks ve stroma ⁶ olmak üzere kemik iliği mikroçevresindeki bir ex vivo yeniden, birincil MM hücreleri. Bu deney, ancak, kimin boyutları ve maliyetli ekipman belirli bir parça bir defada yapılabilecek deneyler veya ilaç sayısını sınırlı belirli bir ticari mikroakışkan slayt, güvenerek sınırlama vardı.

Burada anlatılan sistem, yüksek içine bu orijinal tahlil uzanırolmayan yıkıcı hücre canlılığını ölçmek için bir dijital görüntü analizi algoritmasına dayalı ilaçlar, in vitro tarama için Organotipik doz-yanıt platformu, -throughput. De 384 ya da 1536 oyuklu plakalarda her primer MM hücreleri, hücre-dışı matris ve hasta türevi stroma ve büyüme faktörleri de dahil olmak üzere kemik iliği mikro-3D rekonstrüksiyonu vardır. Canlı mikroskopi ve dijital görüntü analizi doz-yanıt yüzeyler üretmek için kullanılan farklı ilaç konsantrasyonları, hücre ölümü olayları tespit etmek için kullanılır. In vitro verilerden, bir matematiksel model hastanın tümör yükü içinde boyutu ve alt-popülasyonlarının kemosensitiviteyi tanımlar ve tümörü (klinik rejime ⁶ fizyolojik koşullarda ilaç (lar) nasıl tepki vereceğini simüle etmek için kullanılabilir Şekil 1).

Bu platformun temel yenilikler şunlardır: İlaç konsantrasyonlarda başına gereken kanser hücrelerinin, (a), az sayıda (1,000-10,000rasyon); (B) anılan ilacı, fizyolojik koşullar etkinlik (hücre dışı matrisin, stroma hasta türevli büyüme faktörleri) değerlendirilmesi; (C) Sadece parlak bir alan görüntüleme beri canlılık belirteçleri ⁷ No toksisite, floresan ⁸ veya ⁹ biyoparlaklık ile hücreleri transfect böylece hiç gerek kullanılır; (D) Sürekli görüntüleme konsantrasyonu ve uygulama zamanı (farmakodinamik) 'in bir fonksiyonu olarak, ilaç etki sağlar; ve (e) in vitro ve hesaplamalı evrimsel modeller arasındaki entegrasyon, klinik sonucu ⁶ (Silva ve ark., hazırlık) tahmin etmek.

Dijital görüntü analizi algoritması stromal hücrelerin kanser ayırt sağlar önemli bir faktördür altına onların farklı afinite de: dd hücreleri uygun ve stromal hücreler alt uygun ise, matris içinde süspansiyon halinde kalır yok iyi ve daha sonra streç.

Bu ayrılık bile MM ve stroma a da oluşurAynı zamanda tohumlanmıştır ve inkübasyon O / N işlemi sırasında oluşur yeniden. plaka santrifüj aşağı iplik aşağıdaki tohumlama daha bu süreci hızlandırır. Stroma düşük bir profil ve koyu gölge (Şekil 2) korurken Sonuç olarak, MM hücreleri, karanlık bir halka ile çevrili yuvarlak parlak diskler gibi görüntüde görünür. Algoritması ayarlamaları gibi boyut ve şekil olarak diğer morfolojik özellikleri, dayalı ayrı kanser ve stroma ile yapılabilir rağmen Böylece, mevcut haliyle tahlil, yapışmayan kanser hücreleri için uygundur. Bu protokolde, (kemik iliğinden elde edilen mezenkimal stem hücreleri) BHYK ve HUVECler, kemik iliği interstisyel ve perivasküler niş temsil eden, hücre-dışı matrisi (kollajen ve temel zar matris) iki tip olarak ko-kültürler iki tip tarif sırasıyla.

384-plaka kullanarak, ilaç başına 5 konsantrasyonları ve iki çoğaltır, biz tes başardıkTek bir hastanın numune ile 31 farklı ilaçlara t kadar. Ek Şekil 1 bir robot pipet kullanarak optimum dağılımını temsil ederken 1,536 kuyucuğu bu sayı, 3 şu anda manuel hücre tohumlama için kullanılan düzen göstermektedir 127. Şekil olduğunu. Şekil 3'ten tasarımda, her bir 384-oyuklu plaka 21 ilaç test 7 farklı ilaçlar, ya da bir hasta örneği 3 hasta numuneleri taşıyabilir. Her ilaç 5 konsantrasyonları ile temsil edilir, ve her bir durum çiftleri olarak tohumlanır. 4 kontrol kuyuları (ilaç yok) eklendi 7 ilaçlar (örneğin, kuyular 36-39, 126-129 ve 200-203) her biri için tohumlanır. Kullanılan ilaçların etkisini temin etmek için, insan miyeloma hücre kuşağı (örneğin, H929 ya da MM1.S), aynı zamanda tohumlandı ve (kuyular 76-89) kullanılan ilaçların her birinin en yüksek konsantrasyonda iki kopya halinde uyuşturulmuş. pozitif hücre hattı kontrolü onların doz yanıt eğrileri karşılaştırılabilir ac beri kullanılan ilaçlar, yeterli güce sahip olmalarını sağlarross deneyleri. Iki kuyu (kuyular 75 ve 90), görüntüleme sırasında tezgah üstü inkübatör olası sorunları tespit etmek için, başka bir deyişle, çevre koşulları için bir kontrol olarak, bir miyeloma hücre kuşağı ile tohumlanır. Kuyuların numaralandırma etme süresini azaltır ve ekipmanın aşınmasını azaltan mikroskop motorlu aşamasında tarafından katedilen mesafeyi azaltmak için zikzak bir yol izler.

Protocol

Aşağıda açıklanan Moffitt Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmış ve H. Lee Moffitt Kanser Merkezi ve Araştırma Enstitüsü'nde yürütülen klinik araştırmada MM # 14745 altında gerçekleştirildi olarak biyopsi türetilen insan hücrelerinin kullanılması.

Kemik İliği ASPİRAT gelen MM Hücreleri 1. Sıralama

1. Sodyum heparin şırınga içinde hastaların kemik iliği aspiratları (20 mi) toplayın.
2. Ortam sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'de steril sulu ortam santrifüj gradyan: (steril PBS ile 1: 1) seyreltilmiş iliği santrifüjle mononükleer hücreleri izole edin.
3. Mononükleer hücreleri içeren arayüzü, toplayın. Canlılığının belirlenmesi için tripan mavisi kullanarak, soğuk PBS ile hücreleri yıkayın ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak saymak.
4. Plazma hücresi yüzdesini ¹¹ değerlendirmek için Wright-Giemsa boyası ile ince katmanlı bir hücre hazırlama slayt ¹⁰ ve lekeyi hazırlayın.
5. HesaplamakCD138 tanelerin miktarının göre hücreler ve plazma hücre yüzdesi sayısı kullanılır. Örnek başlayarak% 20'den az plazma hücreleri ise, ayırma tamponu 90 ul 5 x 10 ⁶ hücre başına CD138 boncuk 10 ul kullanarak hücrelerin yeniden askıya. Örnek başlayarak% 20'den fazla plazma hücreleri ise, ayırma tamponu 80 ul, 1 x 10 ⁷ hücre başına CD138 boncuk 20 ul kullanılarak yeniden süspansiyon haline getirilmiştir.
6. 15 dakika boyunca 4 ° C 'de boncuklar olan hücreler inkübe edin.
7. 35 mikron süzgeç vasıtasıyla hücrelerin önceden ıslatılmış ayrılık eklendi geçirin (LS) sütunlar (malzemelerin listesine bakınız) manyetik alan ayracı yerleştirilir.
8. Mıknatıstan sütun çıkarın. Ayırma 1 ml tampon ile sütundan 3 kez yıkanarak CD138 seçilmiş hücreler toplanır.
9. ¹⁰ slayt başka lekeli ince tabaka hücre hazırlığı ile CD138 zenginleştirme değerlendirin.
10. Filtre plazma 0.22 mikron bir şırınga filtresi ile, her bir hastanın kemik iliği biyopsisinden elde edilmiştir. Taze plazma kullanCD138 + hücreleri aynı hastadan.
11. % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu,% 10 hastanın plazma ve% 1 penisilin-streptomisin ile RPMI-1640 takviye ederek deney için ortamı hazırlar.
12. Seçim (CD138-) akış-through toplayın ve kemik iliği mezenkimal hücreler (BMSCs) seçmek için klasik yapışma yöntemi ¹² izleyin. BMSCs kullanılmak üzere hazır olana kadar bu işlem hafta gerektirdiğinden, daha önceki hastalar ya da sağlıklı vericilerden BMSCs hazır olması gerekmektedir.

(Manuel Çok kanallı pipet kullanarak) Tabaklar 2. Tohumculuk Hücreleri

1. Tercihen bir optik uygulamalar ve hücre kültürü için optimize edilmiş siyah duvarlı, çok oyuklu bir plaka (384 ya da 1536) ile saydam bir düz dipli kullanın.
2. Kolajen tip I ya da temel membran matrisi ya Co-kültür BMSCs MM hücre Ancak HUVECler bazal membran matrisi gerektirir.
3. Her hücre türü nihai yoğunlukları tutunAşağıdaki aralığı: MM hücre hatları için 3 x 10 ⁵ hücre / mi, HUVEC ya KİKSH 2 x 10 ⁵ hücre / mi, ve hasta-türevi MM hücreleri için 2 x 10 ⁶ hücre / ml olmuştur.
   Not: Bu yoğunluklar tahlillerinde biyolojik alaka korurken mümkün olan en yüksek görüntü kalitesi ve mümkün olan en uzun süre görüntüleme sağlamak için deneysel optimizasyon sonucudur. MM hücre hatları da daha hızlı çoğaltma oranı ve daha büyük bir boyuta bağlı olarak birincil, MM hücrelerine daha düşük yoğunluklarda tohumlanır.
4. KİKSH primer MM hücrelerinin Co-kültür:
   1. 4 ° C'de 10 x MEM 20 ul deiyonize _H2O içinde 20 ul,% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 10 ul ve 1 x RPMI 1640, 50 | il ve mağaza oluşan önceden karıştırılmış ortam 100 ul alikotları hazırlayın.
   2. AA hücreleri ile plakaları ekim sırasında, 250 ul bir son hacme kadar 3.1 mg / ml sığır kollajen tip I 150 ul ile önceden karıştırılmış ortam alikotları karıştırın.
   3. Yeniden asmalaraltı kez, istenen son yoğunlukta RPMI 1640 hücre 50 ul son.
   4. P200 pipet kullanarak 300 ul bir son hacim oluşturmak için kolajen karışımı ile hücre süspansiyonuna karıştırılır.
   5. Manüel veya tekrarlayıcı pipet kullanarak, iyi 1536 gözlü levhalar (mekansal düzenlemesi bir örnek için adım 2.6 bakınız her çukuruna 384 oyuklu plaka ya da 2 ul her merkezinde / matriks karışımı nihai hücrenin 8 ul damla yatırmak kuyu).
   6. 500 xg'de 2 dakika süreyle Santrifüj plaka görüntüleme sırasında aynı odak düzlemine tüm hücreleri konsantre.
   7. Jel polimerizasyonu için, 1 saat için bir kuluçka makinesi (% 5 _CO2, 37 ° C), plaka bırakın.
   8. 1536 oyuklu plakalar içinde desteklenmiş büyüme ortamı içinde 80 ul (RPMI-1640,% 10 FBS HI,% 10 hasta oluşan plazma,% 1 P / S), her bir sıra 384 oyuklu plakalar ya da 8 ul ekle.
   9. Plaka O / N stroma yapışması için inkübatör (% 5 _CO2, 37 ° C), plakanın alt bırakın.
5. Co-CuHUVEC primer MM hücre lture:
   1. Buz ile bir kova -80 ° C transfer bazal membran matrisi erimesine.
   2. Sayın ve ayrı bir tüp içinde 4 kez son yoğunluğuna, her biri, RPMI-1640 ortam içinde primer hücreleri ve HUVECler yeniden askıya.
   3. 1 oranında: 1 de hasta hücreleri ve HUVECler hacimleri karıştırın.
   4. Önceki adımda elde edilen hücre karışımı ile 1: bazal membran matrisi çözülmüş, ama yine de polimerize olmayan sonra, 1 karıştırın.
   5. Her bir merkezinde hücre-matriks karışımı yeterli olan tohum damlacıkları (384 oyuklu plakalar 8 ul 1536 kuyucuğu için 2 ul, kuyu mekansal düzenleme bir örnek için adım 2.6).
   6. 10 dakika boyunca 500 xg'de Santrifüj plaka.
   7. Inkübatör plaka matrisi polimerizasyonu için 1 saat boyunca (% 5 _CO2, 37 ° ^C).
   8. Büyüme ortamı ekleme, 384 oyuklu levhalar için (her bir oyuğa 80 ul (RPMI-1640,% 10 FBS,% 10 hastanın plazma ve% 1 P / S ile takviye edilmiş) 1,5 8 ul36 oyuklu plakalar).
   9. Plakasının tabanına kadar HUVEC'lerin yapışması için inkübatör (% 5 _CO2, 37 ° C), plaka O / N bırakın.
6. ., 384 oyuklu plaka Tohum 3 tohumlama tipik bir dağılımını tasvir etmektedir.
   1. Ilaçlar, test edilecek da B2 başlayarak, çok sayıda sütun tohum. Şekil 3'ün örneğinde, yedi uyuşturucu kullanımı.
   2. Konsantrasyonları gibi birçok kez tohum tekrar kullanılır. Şekil 3'te örnek olarak beş konsantrasyonları kullanırlar.
   3. Kontrol koşulları için dört kuyu Tohum.
   4. Tekrarlayın 2.6.1 ve ikinci deney için 2.6.2 yineleyin.
   5. Tekrarlayın her hasta numune plakasına test edilecek için 2.6.4 için 2.6.1 adımları.
   6. Ilaçlar (iki kopya halinde), test edilecek kadar çok kuyucuklu kuyu iki sıra, her bir MM hücre doğrusu, tohum. Bu Gözlerden her biri kullanılan hazır yeterli Poten sahip olmasını sağlamak için, her ilaç yüksek konsantrasyon ile tedavi edilecektirCY (örneğin, bakınız Şekil 3).
   7. Bir MM hücre hattı ile Tohum iki kuyu vb tezgah üstü inkübatör düzgün işlemesi, büyüme ortamı gibi deneysel koşullar, kontrol olarak hizmet vermektedir.

3. Tabaklar Hücreleri Tohumlama (a Robotik pipet kullanarak)

Not: adım tohum Bu dizi, bir robot pipet kullanarak 384 oyuklu plaka. plaka tasarımı, primer AA hücreleri iki kez tekrarlanmış beş farklı konsantrasyonda 31, farklı bir ilaç paneline karşı test edilir Ek Şekil 1, ek bir negatif kontrol olarak gösterilmektedir. Gibi bir hücre dizisi aynı zamanda ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için pozitif kontrol olarak tohumlanır ve iki tekrarlı, en yüksek konsantrasyonda 31 ilaçlara karşı test edilir. sağlanan dosyalar belirli bir marka ve model içindir (Malzeme tabloya bakınız) fakat algoritma herhangi robot pipet adapte edilebilir.

1. Birincil mm'lik bir hücre ko-kültürüKİKSH S:
   1. 10x MEM 240 ul deiyonize _H2O içinde 240 ul,% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 120 ul, 600 1 x RPMI 1640 ul ve 1.8 ml 3.1 mg / ml sığır kollajeni tip I Etiket oluşan 15 ml'lik bir tüp hazırlanır "CD138 + için ön-karışım" gibi tüpü. Buz üzerinde kullanıma kadar yerleştirin.
   2. 10x MEM 50 ul deiyonize _H2O içinde 50 ul,% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 25 ul, 1 x RPMI 1640 125 ul 3.1 mg 375 ul oluşan bir 1.5 ml tüp hazırlanır / ml sığır kollajeni tip I Etiket "Hücre Hattı ön karışım" olarak tüpü. Buz üzerinde kullanıma kadar yerleştirin.
   3. Altı kez nihai istenilen yoğunlukta RPMI 1.640 yılında CD138 + hücreler 300 ul yeniden askıya. Altı kez nihai istenilen yoğunlukta RPMI 1640 yılında BMSC hücrelerinin 300 ul yeniden askıya. 1.5 ml tüp ve etiket "CD138 +" birlikte her iki hacimleri karıştırın. Inkübatör kullanıma kadar yerleştirin.
   4. 60 ul yeniden askıyaaltı kez, istenen son yoğunlukta RPMI 1640 hücre hattı. Altı kez nihai istenilen yoğunlukta RPMI 1640 yılında BMSC hücrelerinin 60 ul yeniden askıya. 1.5 ml tüp ve etiket "Hücre Hattı" nda bir araya hem hacimleri karıştırın. Inkübatör kullanıma kadar yerleştirin.
   5. Robotik pipet ile verilen yazılımı kullanarak, ilk komut dosyasını, "cell_seedingPt47.PGM" yüklenemedi. Robotun, sırasıyla istasyon A, B ve E bir 200 ul pipet kutusu, bir mikrotitre plaka, ve steril bir 384 plaka yerleştirin.
   6. Tüplerin içeriğini ve "CD138 +" "CD138 + için ön karışımı" karıştırın. Mikrotiter plakasının iyi # 1 içeriğinin 1.5 mi aktarın. Buz üzerinde hacim kalan tüp yerleştirin. Programını başlatın. Robot 384 plaka ilk 176 kuyu (11 en soldaki sütun) tohum ve ardından duraklar. Mikrotiter plakasının iyi # 2 için buz üzerinde tüp kalan aktarın. Programı devam edin.Robot 384 plaka ve duraklama kalan 144 kuyu tohum olacak.
   7. Tüplerin içeriği "hücre hattı için ön karışım" ve "Hücre Hattı" karıştırın ve mikrotiter plakasının # 3 içeriğini aktarın. Programı devam edin. Robot 384 oyuklu plakanın geriye kalan 64 kuyu tohum olacaktır.
   8. 500 x g'de 10 dakika 4 ° C'de santrifüj 384 oyuklu plaka koyun. Transfer levhası kollajen polimerizasyonu için 1 saat boyunca (% 5 _CO2, 37 ° C) kuluçka.
   9. İkinci komut dosyası, "media_layer.PGM" Yük. 120 ul pipet kutusu,% 10 FBS,% 10 hastanın plazma ve% 1 P / S ile takviye edilmiş RPMI-1640 içinde 31 ml bir ayıraç hazne ve istasyon A, B ve E içine hücreleri ile 384 oyuklu plaka koyun sırasıyla. Programı çalıştırın. Robot her kuyuya medya 81 ul transfer olacak. Bittiği zaman, / N O substrata uymak için stroma inkübatör ve izin 384-plaka transfer.
4. İlaç Hazırlama ve Plakaların drugging (Manuel Çok kanallı pipet kullanarak)
1. Kuyulara ilaç ekleme işlemini kolaylaştırmak ve karışıklık olasılığını azaltmak amacıyla Şekil 3'e benzer bir şablon hazırlayın.
2. 96 oyuklu bir plaka içerisinde, ilaçların her bir seri seyreltme, bir 3-kat seyreltme kullanarak beş konsantrasyonları için, örneğin, tabak içinde test edilecek Hazırlama:
   1. Iyi 10x en yüksek konsantrasyonda istenen konsantrasyona ilacın 120 ul ekleyin. Hücreler plaka maruz kalacağı yüksek konsantrasyon 50 uM olması durumunda örneğin, 500 uM melfalan kullanın.
   2. Büyüme ortamı 80 ul ekle dört ardışık oyuklara (RPMI% 10 FBS,% 10 hasta türevi plazma ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenmiş).
   3. Aktarım, ikinci ilk kuyusundan 40 ul ve birinci kuyunun ilaç konsantrasyonu 1/3 ya da 1 ile 120 ul toplam hacmine tamamlamak üzere, karışımı67 uM.
   4. Kalan kuyulara adımı tekrarlayın 4.2.3 (örn, üçüncü karıştırmak için ikinci 40 ul transferi, daha sonra üçüncü, dördüncü, vb 40 ul transferi).
3. Hücre plakası iyi gelen iyi içeren her ilaçtan 8 ul aktarın. Iyi içeren her ilaç hücre plakası 10 kuyu için yeterli hacme sahip olmalıdır. Şekil 3'ün örneğinde, her bir ilaç konsantrasyonu 8, oyuklara ilave edilir, en yüksek konsantrasyon, hariç olmak üzere, 6 farklı, oyuklara ilave edilir.
4. Büyüme ortamı 8 ul ekle kontrol oyuklarına (RPMI% 10 FBS,% 10 hasta türevi plazma ve% 1 P / S ile takviye edilmiş).
5. Mikroskop yerleştirin hücreleri kısa sürede hazır olarak ve tezgah üstü inkübasyon açın.

Plakaların 5. İlaç Hazırlama ve drugging (a Robotik pipet kullanarak)

1. Http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS fi dan robotik pipet için komut dosyaları indirinles.zip
2. Robotik pipet kullanıcı arayüzünde komut "media_layer_DRUGPLATE.PGM" Yük. 120 ul pipet kutusu,% 10 FBS,% 10 hastanın plazma ve% 1 P / S ve istasyonları, sırasıyla A, B ve D, boş bir 384-oyuklu bir plaka ile desteklenmiş RPMI-1640 içinde 21 ml 'si ile hazne yerleştirin. Programı çalıştırın, robotik pipet 384 plaka tüm kuyulara medya 30 ul katacak.
3. Ek, Şekil 2 ile ilgili şablon sonra bir mikrotitre plakasının her bir oyuğuna 20x en konsantrasyondaki ilacın 200 ul ilave edin. Bu kurulum 31 ilaçlara kapasitelidir. Kontrol gözü (CTRL) için% 10 FBS,% 10 hastanın plazma ve% 1 P / S ile takviye edilmiş RPMI-1640 ekler.
4. Istasyonları, sırasıyla A, B ve C bölgesi (aşama 5.1) ortamı ile 384 oyuklu 20X konsantrasyonunda ilaç ile 120 ul pipet kutusu, mikrotitre plakası yerleştirin ve. Programı "drug_plate.PGM" Yük. Robotik pipet seri seyreltme yaratacakEk Şekil 1'de mekansal dağılımı aşağıdaki 3, 1:.
5. 120 ul pipet kutusu istasyonları, sırasıyla A, B ve C içine ilaç (adım 5.3 arasında) seyreltme ve (aşama 3.1.9 gelen) hücreler ile 384 oyuklu plaka ile 384 oyuklu plaka koyun. Yük ve çalışma programı "drug_add.PGM". Robotik pipet hücre plakasına muadili ilaç levhanın herbir ilacın 8 ul transfer edecektir. Bir kez işlenmiş, mümkün olan en kısa zamanda, dijital mikroskop inkübatör hücre plakası aktarın.

Plate Hücreleri 6. Görüntüleme

Not: Aşağıdaki prosedür Evos Oto FL mikroskop için de geçerlidir, ancak kolayca tezgah üstü inkübasyon veya kuvöz gömülü mikroskopları ile diğer motorlu sahne mikroskopları adapte edilebilir.

1. Ile tezgah üstü inkübatör içini temizlemek bir etanol-ıslak mendil ve dikkatle inc kapağını yerleştirirken plakanın kapağını kaldırınubator.
2. Işaretleri eklemek için yazılım adımları izleyin. Bu ilgi bölgeler için önemli noktalara başvurmak için kullanılan bir terimdir, deney (ayrıntılar için yazılım kullanım kılavuzuna bakın) sırasında arka arkaya yansıması için.
3. 5X veya 10X büyütme hedefi kullanın. Odak 2 Şekil benzer olduğundan emin olun: MM hücreleri koyu halka ve BMSCs veya HUVECler zorlukla görülebilir çevrili parlak diskler görünür. Bazı birincil MM hücreleri çok küçük ve böylece ince ayar optimum odak bulmak için gerekli olabilir vardır.
4. 10-30 dakika arasında ve en az 96 saat süresince satın alma aralığını ayarlayın. Satın arasında daha uzun aralıklar kabul edilebilir olsa da, 45 dakika ya da daha fazla aralıklarla belirgin canlılığının ölçüm hassasiyetini azaltır.
5. Her kuyunun görüntüleri Beacon-1, Beacon-2, vb robotik pipet kullanılmışsa adlı ayrı dosyalarda saklanır, böylece gösterilen sırayla işaretleri ayarlamak, yazılım yapılandırmaEk Şekil 3.
6. Hücreler Optimum koşullarda olacak şekilde inkübatör nemlendirici ve gaz yeterince su, olduğundan emin olun.
7. Deneyin tamamlanmasından sonra, analiz çalıştırılacağı bilgisayara görüntüleri içeren klasörleri kopyalayın.

İlaç Duyarlılık 7. Kantitasyonu

Not: Aşağıdaki talimatlar bir kişisel bilgisayar bir çok-çukurlu plaka analizden sonra, bir bilgisayar küme kullanılarak görüntü analizi kullanımı kılavuz çok zaman alıcıdır.

1. NIH web sitesinden ImageJ yazılımını indirin: http://imagej.nih.gov/ij/
2. Http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ de script ve eklentileri indir
3. Dijital görüntü analizi yazılımı çalıştırmak için http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf yönergeleri izleyin. Sonuç EAC için düzenli aralıklarla canlılık ölçümleri içeren Results.csv adında bir elektronik tablo olmalıDeney (örneğin, 96 saat) boyunca plaka h de.
4. Manuel çok kanallı pipet kullanarak, aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. Dosyayı http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt indirin ve adım 3.1 tanımlanan plaka planına uyması için değiştirmek (örneğin, Şekil 3).
   2. Yazılım http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar indirin ve adımları giriş parametresi olarak 5.3 ve 5.4 oluşturulan dosyaları kullanarak çalıştırın. Sonuç birden elektronik tablolar içeren bir klasör adı Raporu, her biri belirli bir ilaç için sonuç gruplandırma olacaktır.
   3. Hesap tablosu şablonuna http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx içinde kopyalama ve yapıştırma içeriği
      Not: Sonuç, böyle bir ilaç konsantrasyonu ve maruz kalma süresinin bir fonksiyonu olarak farklı ilaçlara örnek kemosensitiviteyi temsil Şekil 4'te gösterilen biri olarak grafikler olmalıdır.
   </ Ol>
   4. Bir robot pipet kullanarak, aşağıdaki adımları uygulayın.
      1. Http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Şablon Files.zip gelen robotik pipet Download komut dosyalarını şablon dosyalarını indirin ve bir dizindeki dosyaları ayıklayın.
      2. Hücreleri ile plaka ilaçların listesi ve en yüksek ilaç konsantrasyonuna göre DrugList.csv dosyasını değiştirin. Ek Şekil 2 düzenini takip edin.
      3. Parametre olarak adım 7.3 aşama 7.5.1 çıkarılan dosyaları ve dosyaların Results.csv içeren klasörü geçen programı BuildExperimentalDesign.java çalıştırın. Sonuç, iki klasör MM1_S ve PtSample isim olmalıdır. İlk hücre çizgisi Pozitif kontrol için oyuklara (ilaç ve konsantrasyon) bir tanımını içerir. İkinci hasta hücreleri ile seribaşı plaka parçası ile ilgili aynı bilgileri, ancak içerir.
      4. Adım 7.5.3 oluşturulan dizin her dosyayı Results.csv kopyalayın. İndirYazılım http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar hem klasörler için adımlar 7.5.3 oluşturulan dosyaları kullanarak çalıştırın. Sonuç 7.5.3 oluşturulan klasörlerin her biri bir klasör adı Raporu olacaktır. Rapor klasörü her biri belirli bir ilaç için sonuç gruplama, birden elektronik tablolar içeriyor.
      5. Programı BuildGraphPadFile.java çalıştırın ve parametre olarak adım 7.5.1 yılında Ayıklanan dosyaları içeren klasörü geçmek ve dosyaları adım 7.3 den Results.csv. Sonuçlar, konrol bir GraphPad 31 ilaçlarının her biri için doz tepki eğrileri içeren dosya ve normalleştirilmiş olur. Her grafik birincil MM hücreleri için 5 ilaç konsantrasyonlarını ve pozitif hücre hattı kontrolü için tek konsantrasyon içerecektir.

Representative Results

Deney akışı kısaca Şekil 1'de açıklanan tüm adımları başarıyla tamamlandığı takdirde, mikroskop ile elde edilen görüntüler Şekil 2'ye eşdeğer olmalıdır. MM hücreleri açıkça parlak diskler ve BMSCs veya HUVECler zor görünür olmalıdır görülmelidir canlı ve de arka planda dağıtılır. Şekil 2A'da görüldüğü gibi, DD hücreleri bir hastadan diğerine boyutu değişir, ancak genel olarak hücre çizgileri daha küçüktür. Pratik olarak deney aralığında ex vivo replike olmayan yana (96 saat), daha yüksek konsantrasyonlarda (1-3.000.000 hücre / ml) tohumlanır edilebilir. BMSC düşük bir profil sunan, kuyu ve streç dibine bağlı olarak Stroma, zorlukla algılanabilir olmalıdır. insan miyelom hücre çizgisi H929, hasta türetilmiş MM hücreleri (Şekil 2B) önemli ölçüde daha büyük olan, ve 24 saat içerisinde çoğaltılır. Görüntünün kalabalığı önlemek için, MM hücre soyları, bkzdüşük yoğunlukları, 0,3 milyon / ml ded. 2C ve 2D hasta kaynaklı MM hücreleri ve insan miyelom hücre hatları H929 temsil Rakamlar, sırasıyla, ko-kültüre HUVECler ile. HUVECler ilk kuyunun dibine yapışır ve daha sonra kalın ile lümen olmak birbirleriyle ve form ağları irtibata başlar.

Şekil 4, deneyin sonunda KİKSH ve HUVEC hiçbir ya da çok küçük yeşil sinyal ile yeşil (Şekil 4A) 'de sözde renkli canlı MM hücrelerini tespit gösteren görüntü analiz algoritması tarafından üretilen işlenmiş videoları beklenebilir ne örnek teşkil yüksek ilaç konsantrasyonu, tüm MM hücreleri (Şekil 4B), ölü yer. Yazılım, farklı kuyulardan sonuçları toplam ve farklı ilâç konsantrasyonlarına (Şekil 4C) ile maruz kalma süresi ile canlılığı kademeli kaybı gösteren bir grafik oluşturmak gerekir. dozu tepkisi eğrisikontrol hücre hattı (örneğin, H929 ya da MM1.S) Önceki deneyler için aynı olmalıdır; önemli sapmalar deneyde kullanılan ilacın stok solüsyonu ile sorunlara işaret edebilir.

Eserler görüntü analiz yazılımı yanıltmak ve yanlış sonuçlara yol açabilir gibi dikkatle görüntüleme işlemi başlamadan önce seribaşı tüm kuyuları gözlemlemek önemlidir. Örneğin, Şekil 5A, topaklar bu hücrelere yol açar. Şekil 5B, MM hücre "koloniler" gösterir Tripsinasyon ve tohumlama arasında geçen zamanda ya da çok fazla zaman KİKSH aşırı yoğunluk sonucunu göstermektedir. Hücre çizgileri yüksek yoğunluklarda tohumlanır Eğer diğerinden bir hücre ayırt etmek giderek daha zor hale gelir, bu çoğaltma onlar koloniler oluşturur ve bu dijital görüntü analizi algoritması doğruluğunu azaltır. Şekil 5C karşısında, bir örnektir çok az MM hücre ekilmiştir. TKemik iliği aspirasyon elde MM hücrelerinin sayısı aşağıda 500.000 olup, tekrar süspansiyon önce tüp içinde sol "ölü hacim" yüksek yoğunluklarda MM hücrelerin yeniden askıya için gerekli ortamın hacmi ile karşılaştırılabilir hale geldiğinde onun sık oluşur . Bu sorunu çözmek için, kullanılan boru ölü hacmi belirlemek ve seyreltme hesaplamalarında bulunmaktadır. Şekil 5D çarpık odak düzlemi bir örneğidir. Üst soldaki MM hücreleri parlak ve sağ alt olanlar karanlık olduğuna dikkat edin. Bu am dengesiz yerleştirilmiş plaka veya yanlış yerleştirilmiş amaç kaynaklanır. Bu görüntünün farklı bölümlerde MM hücreleri farklı sayılacaktır neden olur. Ölçek çubukları (her görüntünün sağ alt) 500 mikron temsil etmektedir.

Bir kemik Marro sırasında Şekil 1. Protokol genel tanımı. (A)biyopsi w aspirat ekstra bir tüp protokolü için elde edilir. (B) Multipl miyeloma (MM) hücreleri manyetik aspirasyon diğer hücrelerden ayrılmıştır. MM hücrelerini (MM), sigara-AA hücreleri ve plazma içeren (C) üç tüpler, sırasıyla ayırma işleminden elde edilir. Önceki aspirat (d) kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (BMSCs) yeni elde edilen AA hücreleri ile birlikte kültürlendi ve hücre-dışı matrisi (kolajen ya da temel membran matrisi) içinde yeniden süspansiyon haline. (E) plaka olası aynı odak düzlemi içinde ve BMSC kuyunun dibine uymak için hazırız o kadar çok MM sağlamak için aşağı bükülmüş. Matris polimerize kadar plaka inkübatör yerleştirilir. (F) her bir kültür ortamı ve hasta türetilen bir plazma karışımı ile doldurulur. Plaka bir kuluçka O / N yerleştirilir. (G) İlaçlar her bir oyuğuna ilave edildi ve plaka, bir mikroskop yerleştirilirbir dijital kamera, motorlu bir sahne ve tezgah üstü inkübatör ile donatılmış ve 96 saat bir süre için, düzenli aralıklarla görüntüsü alınmıştır. (H) her bir göz için görüntü dosyaları segmentler membran hareketine göre MM hücreleri canlı bir algoritma kullanılarak analiz edilir (canlı hücreler sözde yeşil renklidir) ve her bir zaman noktası için her bir oyuk için hücreselliğinde değişiklikler içeren bir elektronik tablo oluşturur. Ölçek çubuğu (sağ alt) 500 mikron temsil eder. (I) bir yazılım programı ilaçlar ve konsantrasyonları gruplar kuyuları ve ilk önlemler% 100 olduğunu. Bu yüzden normalize doz yanıt eğrileri ile bir elektronik tablo oluşturur , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kuyuların 2. Ön-ilaç beklenen bir görünüm Şekil. (A) stroma ile birlikte kültürlenmiş MM hücreleri. (B) insan miyelom hücre çizgisi H929 eş-kültürlenen stroma. (C) HUVECler ile ko-kültür MM hücreler hastadan türetilen. (D) insan hücre hattı H929 HUVECler ile ko-kültür miyelom. Ölçek çubukları (her şekil sağ alt) 500 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. 384 oyuklu plaka kuyuları dağılımını önerilir. Her bir 384-oyuklu plaka 21 ilaç test 7 farklı ilaçlar, ya da bir hasta örneği 3 hasta numuneleri taşıyabilir. Açık yeşil Wells, mavi ve kahverengi ışık, üç farklı hastalardan MM hücreleri içerir. RX1, Rx2 vb beş farklı con her farklı ilaçlar temsildeùerleri ve iki kopya olarak. Dört kuyu her bir hasta için bir kontrol (hasta 2 hastadan 1 36-39, 126-129 ve 200-203 hasta 3) olarak kullanılır. Portakal Wells, iki kopya halinde, her bir ilacın en yüksek ilaç konsantrasyonunda hücre hatları içerebilir. Sarı Wells hücre hattı kontroller (ilaç) vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil dijital görüntü analizi ve doz-yanıt grafikleri 4. Örnek. (A), kollajen I gömülü KİKSH ile ko-kültür, MM hücreler, 50 nM carfilzomib bir konsantrasyona maruz bırakılmıştır. Görüntü analizi algoritması yeşil canlı hücreleri ve sözde renkleri onları algılar. (B) görüntüleri deney süresince düzenli aralıklarla alındı. Bu konsantrasyon derecesinden olarakilacın, hemen hemen tüm hücrelerin 96 saat sonunda öldü. (C), grafik 96 saat kadar bir aralık boyunca carfilzomib beş farklı konsantrasyonları için canlı hücre sayısı değişimleri, bir süre için normalize =% 100 olarak 0 saat gösterir. insan miyelom hücre çizgisi MM1.S ilaç etkinliği için kontrol olarak kullanılmıştır. Ölçek çubukları (A sağ alt ve B) 500 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. Genel hatalar tohumlama veya görüntüleme levhası. (A) Stroma hücreleri "karışık" ise. MM hücrelerinin (B) "Kolonileri". (C) çok az AA hücreleri. (D) Çarpık odak düzlemi. Ölçek çubukları (her görüntünün sağ alt) 500 mikron temsil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Şekil bir robot pipet kullanarak 384 plaka kuyuların 1. Optimum mekansal dağılımı. Bu yapılandırma 31 farklı ilaçlar ise 5 farklı konsantrasyonda ve 2 çoğaltır (yeşil) test edilebilir. Buna ek olarak, bir hücre hattı ile pozitif kontroller ilaç potansiyeli (pembe) sağlamak için de kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Şekil 2. Mekansal dağılımı İlaç "ana plaka". ilaç seyreltme plaka oluşturmak için, her bir kuyunun 20x konsantrasyonda 31 ilaçlardan birini içeren bu tabak kullanacak robot pipet. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir robot pipet ile bir tabak hazırlarken kuyuların Ek Şekil 3. Numaralama kullanılacak. Protokolde açıklanan yazılım yeterli ilaç ve konsantrasyonları kuyu harita için kuyu bu numaralandırma gerektirir. Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.

/ftp_upload/53070/53070fig4sup.jpg "/>
Mikroakışkan kızak arasında Ek Şekil 4. karşılaştırması (Khin ve ark., 2014) ve mevcut protokol., Önceki sisteme 24 saat (üst sol bortezomib, orta sol melfalan) ve mevcut sistem ölçülen H929 multipl miyelom hücre hattı Doz tepkisi ( Sağ üst bortezomib ve orta sağ melfalan). Karşılaştırma amacıyla, her iki platform için 24 saat sonra LD50 3.9 nM ve bortezomibe 4.1 nM ve 6.4 uM ve melphalan için 14.65 mM oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Özet olarak, bu kemik iliği, bir yeniden birincil MM hücre ve ilaç ex vivo farmakodinamik kemosensitiviteyi ölçmek için güçlü ve yüksek kapasiteli bir yöntemdir. Bu protokol kapsamında kritik adımlar kuyuların uygun tohumlama ve yeterli (beklenen sonuçlar için bakınız Şekil 2) odaklama: MM ve stromal hücreler düzgün yayılı sağlamak, bu stromal hücreler, kuyunun dibine yapışık olan MM tüm Hücreler, MM hücreleri koyu halka çevrili aydınlık diskin yönü olan aynı odak düzleminde ve vardır.

Uygunsuz tohumlama durumunda deney ile devam etmeyin, (Şekil 5), daha ziyade ikinci bir tabak tohum. Sorun düşük veya yüksek MM veya stroma hücre yoğunluğu, hücrelerin homojen dağılımını sağlamak için tohumlama işlemi sırasında tohum ve düzenli aralıklarla tekrar süspansiyon önce tüp içinde hücre konsantrasyonunu kontrol edildi tespit edersebasında. Tekrarlayıcı fonksiyonu ya da robotik dağıtıcı ile bir çok kanallı pipet kullanımı önemli ölçüde bu sorunu azaltabilir. Bu tahlilde kullanılan ortam (1:10) hücre / matris oranı tohumlanır ve böylece koşulları incelenebilen kuyu sayısı en üst düzeye çıkarmak için çalışmıştır. Bununla birlikte, üretilen veya kanser hücrelerinde veya stroma tarafından tüketilen çözünür faktörler çalışma, bu ortam hücre / matris oranı 1 olması tavsiye edilir: 1 arasındadır.

Şu anda uygulanmakta olduğu gibi, bu sistem sadece yapışmayan hücreleri rakamlarla. Stroma selülarite değişiklikleri ölçmek amacıyla yazılım stroma morfolojik özellikleri değiştirilmiş ve ayarlanması gerekir. Bu stroma bölmesinde kanser hücrelerinin ya da uyuşturucu etkisini araştırmak için yararlı bir özellik olacaktır. Burada tarif edilen sistemi de yapışkan stroma ile birlikte, özellikle de yapışık kanser hücrelerinin selülarite ölçmek için mümkün değildir. çözüm dijital imag içinde değişiklikler olacağınıE analizi algoritması morfolojik özellikler göre stromadan kanser ayırmak için ya da her iki popülasyonundan elde hücreleri tanımlamak için kullanılabilecek bir floresan boya ile nüfus ya ön-inkübasyona.

Bu sıralı ölçümleri, çok daha detaylı sağlayan yapılabilir, böylece, önceki yöntemlere göre bu protokol önemi, yıkıcı olmayan bir şekilde kemik iliği mikro bölgesinin bir ex vivo yeniden primer kanser hücrelerinin ilaç yanıtını değerlendirmek yeteneğidir farmakodinamik, ziyade sabit zaman noktalarında bilgiler. Bizim önceden tahlil ⁶ sınırlamaları Bir tek konsantrasyonlarının doğrusal pencere içinde ilaç duyarlılık değerlendirmesini izin ilaç difüzyon, tarafından oluşturulan doğrusal gradyan oldu. Her kuyu ayrı bir varlık olduğu için mevcut tahlil, ilaç konsantrasyonlarının herhangi aralığında canlılığı değerlendirilmesini sağlar. Her iki testte de, ancak, (eşdeğer sonuçlar elde

Bu yaklaşımın birden gelecek uygulamalar arasında, bizim grup klinik yanıta içine bu deneyleri tarafından sağlanan farmakodinamik bilgileri tahmin matematiksel modeller kullanılarak odaklanmıştır. Bu ilaç kaynaklı hücre ölümünün dinamiklerini, diferansiyel denklemler sistemi, her bir ilaç için elde edilen veri noktalarını (Şekil 4C) uyacak şekilde teklif Bu hedefe ulaşmak için. Sonra, bu matematiksel modeller klinik bir rejimdeki her bir ilacın bilinen farmakokinetik özellikleri başvurarak, hastanın ⁶ asıl bir cevap tahmin etmek mümkün olacaktır. Tohumlama otomasyonu ve robotik sistem kullanılarak drugging ederek, bakım ilaçların sadece standart test etmek mümkün olabilir, ama aynı zamanda yüzden fazla deney ilaçlar numune başına (a 1.536 plaka olarak) olacaktır. Bu deneysel ilaçların yüzlerce test edilebilir silico klinik çalışmalarda, olasılığını açacağınıHastalar numunelerin grupları, böylece sanal klinik çalışmalarda ¹³ hayatta kalma eğrileri oluşturma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system