Abstract
本研究では、患者由来の多発性骨髄腫（MM）細胞の化学感受性と不均一性を推定するためにex vivoでの薬剤感受性アッセイおよびデジタル画像解析を組み合わせた新規な方法を説明します。このアプローチは、patient-新たに細胞外マトリックス（コラーゲンまたは基底膜マトリックス）及び間質（含む各骨髄微小環境の再構成からなる、マルチウエルプレートに実装マイクロ流体チャンバに骨髄吸引物から抽出された一次MM細胞を播種することからなります由来間葉系幹細胞）またはヒト由来の内皮細胞（HUVEC）。チャンバは、異なる薬剤および濃度で薬漬けされており、デジタルカメラを搭載した電動式顕微鏡において、明視野顕微鏡を介して96時間連続して撮像されます。デジタル画像解析ソフトウェアは、膜の動きの存在下または非存在下で生細胞と死細胞を検出し、関数Oと生存率の変化の曲線を生成しますF薬物濃度および曝露時間。私たちは、各薬剤に対する腫瘍集団の化学感受性のパラメータだけでなく、腫瘍の不均一性の尺度として存在する亜集団の数を決定する計算モデルを使用しています。これらの患者に合わせたモデルは、その後、治療計画をシミュレートし、臨床応答を推定するために使用することができます。
Introduction
この方法の目的は、生理学的条件にできるだけ近くに、これらの結果は、化学療法抵抗性のサブを識別するために使用できる十分な精度で、ex vivoでの薬剤のパネルに、多発性骨髄腫（MM）初代細胞の薬剤感受性を特徴付けることです腫瘍負荷と、内集団は最終的に、臨床応答を推定するために設計された計算モデルをパラメータ化します。
計算モデルは、癌ホスト治療相互作用のような複雑なシステムを分析するための強力なツールです。しかし、モデルのみ、それらをパラメータ化するために使用されるデータと同じくらい良いです。それらはしばしば相互に排他的な実験条件で得られるように残念なことに、文献において利用可能なほとんどのデータは、そのようなモデルをパラメータ化するために、その現在の形で使用することができません。このように、新しい実験が頻繁に必要な実験パラメータのセットを取得することを目標に必要とされます。ほとんどの生存性アッセイは、しかしながら、破壊的と目されています我々は、時間点の数が少ない、しばしばのみに限定されるもの。このような実験は、システムの時間的動態に関する情報を提供することができないので、これは非常に、計算モデルをパラメータ化するために化学感受性アッセイの使用をハンディキャップ。これは多くの場合、このように利用可能な実験条件の数を制限し、サンプル当たり数百万人に限定されるものではなく、生検後の短い寿命を持っている一次癌細胞と特にそうです。また、ほとんどの生存性アッセイは、さらに細胞を摂動し、実行することができる実験の数を制限し、プロトコルに余分な作業を追加して定量化、時の非癌（間質）細胞から癌の分離を必要と。
40年前、サーモンと共同研究者1は、腫瘍細胞の化学感受性を評価するためのインビトロのコロニー形成アッセイにおけるそれらの有名なを提案しました。残念ながら、このアッセイは、による複数のMYE少数の混合成功を収めて対照条件下でコロニーを形成することができたロマ（MM）患者サンプル：これは、多発性骨髄腫幹細胞2と呼ばれている、MM細胞の0.1％に、0.001％のわずかな部分群を複製することができたことが推定されました。これは、かなりのアッセイの成功率、さらにより最近のモデル3に、一度に試験することができる薬物の数を制限しました。 （標準または実験）MM剤は四十年以上前に多数ある場合、この問題は今はるかに重要です。
これらの初期のアッセイの主な制限は、それらの二分出力されます。患者が特定の薬物を「感受性」または「抵抗性」のいずれかです。いいえ情報は、腫瘍集団の感度および不均一性の程度に関して提供されていません。このように、急成長している耐性細胞の小さな亜集団の患者は、治療に「敏感」に分類されますが、すぐに再発だろう、そのためではないベン治療からefit。癌患者4,5の全生存期間（OS）での応答の持続時間の重要性を考えると、それはこれらのアッセイが適切に一貫してOSを推定することができませんでしたか明らかです。
注文これらの制限を回避するために、および薬物のパネルにパーソナライズ臨床応答を推定することになる患者固有の計算モデルを生成することができるように、我々は、多発性骨髄腫（MM）細胞株の非破壊検査の薬剤感受性のための方法を開発しました細胞外マトリックスおよび間質6を含む骨髄微小環境のex vivo再構築、および一次MM細胞。このアッセイは、しかし、その寸法は、コスト機器の所定枚で一度に実行することができる実験や薬の数を制限し、特定の商用マイクロ流体スライド、に頼るの制限がありました。
ここに記載されているシステムは、高にこのオリジナル検定を拡張します器官用量応答プラットフォーム-throughput、非破壊細胞生存度を定量するために、デジタル画像解析アルゴリズムに基づいて、薬物のインビトロスクリーニングのため。 384ウェルまたは1536ウェルプレートの各プライマリMM細胞、細胞外マトリックス、および患者由来の間質及び成長因子を含む、骨髄微小環境の3次元再構成です。ライブ顕微鏡とデジタル画像解析は、用量反応面を生成するために使用される、異なる薬剤濃度での細胞死のイベントを検出するために使用されます。 インビトロデータから、数学的モデルは、（患者の腫瘍負荷内のサブ集団の大きさと化学感受性を識別し、腫瘍が臨床レジメン6に生理的条件下で薬剤（単数または複数）に応答する方法をシミュレートするために使用することができ図1）。
このプラットフォームの主な革新は次の通りである：（a）癌細胞の数が少ない、必要な（薬物コンセントあたり1,000〜10,000配給）; （b）は、生理学的条件（細胞外マトリクス、ストローマ、患者由来の成長因子）における薬効の評価を、 （c）の生存性マーカー7から無毒性のみ明視野画像を用いているため、このように蛍光8または生物発光9を用いて細胞をトランスフェクトする必要がありません。 （d）は、連続撮影は、濃度および暴露時間（薬力学）の関数としての薬剤の効果を提供します。および（e） インビトロと計算進化のモデル間の統合は、臨床転帰6（シルバら、準備中）を推定します。
間質細胞から癌を識別するためにデジタル画像解析アルゴリズムを可能にする重要な要因は、ウェルの底にそれらの異なる親和性である：MM細胞が付着し、マトリックス中に懸濁状態で残っていない、間質細胞は、底部に付着している間よく、その後ストレッチ。
この分離はあっても、MMおよび間質Aかかわらず、これが発生します同時に播種し、インキュベーションのO / Nプロセスの間に発生する再。プレートの遠心分離器でスピンダウンし、次の播種は、さらに、このプロセスを加速します。間質が低いプロファイルと暗い影（ 図2）を維持しながら、結果として、MM細胞は、暗いリングに囲まれた円形の明るいディスクなどの画像に表示されます。アルゴリズムの調整は、このようなサイズおよび形状のような他の形態学的特徴に基づいて、独立した癌および間質に行うことができるが、このように、現在の形式でのアッセイは、非接着性癌細胞に最も適しています。このプロトコルでは、（骨髄由来の間葉系幹細胞）BMSCとHUVECS、骨髄の間質および血管周囲のニッチを代表して、細胞外マトリックス（コラーゲンと基底膜マトリックス）の2種類だけでなく、共培養の2つのタイプを記述します、それぞれ。
、薬剤ごとに5つの濃度と2つの複製を384ウェルプレートを使用して、我々はTESすることができました一人の患者のサンプルと31種類の薬までトン。 補足図1は 、ロボットピペッターを使用して、最適な分布を表す1,536ウェルプレートでは、この数が、3は 、現在手動細胞播種のために使用されるレイアウトを示している図 127です。 図3の設計では、各384ウェルプレートは、21の薬剤を用いて試験し、7つの異なる薬物、または一人の患者の試料で3患者サンプルを運ぶことができます。各薬剤は、5つの濃度で表され、各条件をデュプリケートで播種されます。 4対照ウェル（薬剤を添加していないが）7薬（例えば、ウェル36〜39、126-129および200〜203）の各セットのために播種します。使用される薬物の効力を保証するために、ヒト骨髄腫細胞株（ 例えば、H929ま たはMM1.S）がシードされ、そして（ウェル76から89）に使用される薬物のそれぞれの最高濃度でデュプリケートで薬漬け。陽性細胞株のコントロールは、それらの用量応答曲線が同程度の交流であるため、使用される薬剤は、十分な効力を有することを保証しますロス実験。 2つのウェルは、（ウェル75及び90）は、撮像時のベンチトップインキュベータで可能性のある問題を検出すること、言い換えれば、環境条件の制御などの骨髄腫細胞株を播種します。ウェルの列挙は、取得時間を低減し、装置の摩耗を減少させ、顕微鏡の電動ステージによって移動距離を減少させるために、ジグザグのパターンに従います。
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Protocol
以下に説明するように、生検由来のヒト細胞の使用は、モフィットの治験審査委員会によって承認され、H·リー·モフィットがんセンター研究所で行われた臨床試験のMCC＃14745で行いました。
骨髄吸引物からのMM細胞の1ソート
- ヘパリンナトリウム注射器の患者から骨髄吸引（20ミリリットル）を収集します。
- 周囲温度で30分間、400×gで滅菌水性媒体遠心分離勾配上で：（滅菌PBSで1：1）で希釈し、骨髄を遠心分離することにより、単核細胞を分離します。
- 単核細胞が含まれているインタフェースを、収集します。生存能力の決意のためにトリパンブルーを用いて、冷PBSで細胞を洗浄し、血球計または自動細胞カウンターを用いてカウントします。
- 形質細胞比率11を評価するために、ライト·ギムザ染色で薄層細胞調製スライド10と汚れを準備します。
- 計算CD138ビーズの量は、ベースの細胞および形質細胞の割合の数を使用します。サンプルを出発して20％未満の形質細胞である場合、分離緩衝液の90μlの5×10 6個の細胞あたりCD138ビーズを10μlを用いて細胞を再懸濁します。出発サンプルが20％を超える形質細胞である場合には、分離緩衝液の80μlの1×10 7個の細胞あたりCD138ビーズを20μlを用いて再懸濁しました。
- 15分間4℃でビーズで細胞をインキュベートします。
- 35μmのストレーナを介して細胞を渡すには、予め湿らせた分離磁場分離器に入れ（LS）のカラム（材料のリストを参照）に加えました。
- 磁石から列を削除します。分離緩衝液1mlでカラムを3回洗浄することによって、CD138選択細胞を収集します。
- 10をスライドさせて、別の染色薄層細胞調製物とのCD138の濃縮を評価します。
- 0.22μmのシリンジフィルターを用いて各患者からの骨髄生検から得られたフィルタのプラズマ。新鮮な血漿を使用してくださいCD138 +細胞と同じ患者から。
- 10％の熱不活性化ウシ胎児血清、10％の患者の血漿および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含むRPMI-1640を補充することによって、実験のためにメディアを準備します。
- 選択（CD138-）のフロースルーを収集し、骨髄間葉系細胞（骨髄幹細胞）を選択するために古典的な接着方法12に従ってください。骨髄幹細胞を使用する準備が整う前に、このプロセスは数週間を必要とするので、それは、以前の患者または健康なドナーからの骨髄幹細胞の準備ができていることが必要です。
（手動マルチチャンネルピペッターを使用して）プレート2.播種細胞
- 黒壁や透明平底、光学用途や細胞培養に最適化された優先1とマルチウェルプレート（384または1,536）を使用します。
- コラーゲンタイプIまたは基底膜マトリックスのいずれかにおけるMM細胞との共培養骨髄幹細胞が、HUVECを基底膜マトリックスを必要とします。
- 各細胞型の最終濃度を維持次の範囲：MM細胞株のために3×10 5細胞/ ml、HUVECを、または骨髄幹細胞2×10 5細胞/ ml、および患者由来のMM細胞2×10 6細胞/ ml。
注：これらの密度は、アッセイにおいて生物学的関連性を維持しつつ、可能な限り最高の画質と可能な限り長い撮影時間を可能にする実験的最適化の結果です。 MM細胞株は、それらの速い複製速度およびより大きなサイズに起因する一次MM細胞より低い密度で播種されます。 - 骨髄幹細胞と一次MM細胞の共培養：
- 4℃で10倍MEMの20μlの脱イオンH 2 O20μlの、7.5％炭酸水素ナトリウム溶液を10μl、および1×RPMI 164050μlの、店舗からなるプレミックスメディアの100μlアリコートを準備します。
- MM細胞を有するプレートを播種時に、250μlの最終容積に3.1 mg / mlのウシコラーゲンタイプI150μlで予備混合媒体のアリコートを混合します。
- 再SUSP6回、最終的な所望の密度でRPMI 1640中の細胞の50μLを終了します。
- P200ピペットを用いて300μlの最終容量を作成するために、コラーゲンミックスを細胞懸濁液に混合します。
- 手動またはリピーターピペットを用いて、384ウェルプレートに、各ウェルの中央の最終細胞/マトリックス混合物の8μlの滴を堆積させる、または1,536ウェルプレートの各ウェル中の2μlの（空間的配置の例については、ステップ2.6を参照してください。井戸の）。
- 撮影中に同じ焦点面に全ての細胞を濃縮するために500×gで2分間遠心操作板。
- ゲル重合のために、1時間インキュベーター（5％CO 2、37℃）でプレートにしておきます。
- 384ウェルプレートに各ウェルに補充した増殖培地（RPMI-1640、10％FBS HI、10％の患者由来の血漿、1％のP / S）を80μl加え、または1,536ウェルプレート中で8μL。
- プレートO / N間質の接着のためのインキュベーター（5％CO 2、37℃）でプレートの底に残します。
- 共同のCuHUVECを一次MM細胞のlture：
- 氷とバケツに-80°Cからの転送基底膜マトリックスは、解凍します。
- 別のチューブ内の各4回の最終密度でRPMI-1640培地中でカウントし、一次細胞を再懸濁したHUVEC。
- 1の割合：1で患者の細胞およびHUVECをボリュームを混ぜます。
- 前工程からの細胞混合物と1：基底膜マトリックスを解凍、まだ重合していないされたら、1を混ぜます。
- 各ウェルの中央の細胞 - マトリックス混合物の十分な容量を有するシード滴（384ウェルプレートおよび1536ウェルプレートのために2μlのための8μlを、ウェルの空間配置の例については、ステップ2.6を参照してください）。
- 10分間、500×gで遠心分離板。
- マトリックス重合の1時間インキュベーターに入れプレート（5％CO 2、37°C の ）。
- 増殖培地を追加し、384ウェルプレートのために（各ウェルに80μlのを（RPMI-1640を、10％FBS、10％の患者の血漿および1％P / Sを補充した）1,5 8μL36ウェルプレート）。
- プレートの底にHUVECの接着のためのインキュベーター（5％CO 2、37℃）でプレートO / Nのままにしておきます。
- 384ウェルプレートに種子。 図3は、播種の典型的な空間分布を示しています。
- 薬剤が試験されるように十分にB2に開始し、同じ数の列をシード。 図3の例では、7薬物を使用しています。
- 濃度何度でも播種繰り返し使用されます。 図3の例では、5つの濃度を使用します。
- 制御条件のための4つ以上のウェルに播種します。
- 繰り返しは、第二の複製のために2.6.1と2.6.2を繰り返します。
- 繰り返しは、プレートで試験されるすべての患者サンプルに対して2.6.4に2.6.1を繰り返します。
- 薬剤は（二重に）試験される限り多くのウェルを有するウェルの二行、各MM細胞株の種子。これらのウェルのそれぞれが使用在庫が十分なpotenを持っていたことを確認するために、各薬剤の最高濃度で処理されますCY（例えば図3を参照）。
- MM細胞株とシード2つのウェルは、 等ベンチトップインキュベータの適切な機能、増殖培地などの実験条件の制御として機能します。
3.プレートに細胞を播種（ロボットピペッターを使用）
注：ステップ種子この一連のロボットピペッターを使用して384ウェルプレート。プレートの設計は、一次MM細胞が31 2回の反復で五つの異なる濃度での異なる薬物に加え、ネガティブコントロールのパネルに対して試験された補足図1に示されています。細胞株はまた、薬剤の有効性の評価のための陽性対照として接種し、2つの複製で、最も高い濃度ですべての31の薬に対してテストされます。提供されるファイルは、特定のブランドとモデルのためのものである（材料の表を参照）が、このアルゴリズムは、任意のロボットピペッターに適合させることができます。
- 一次MM細胞の共培養骨髄幹細胞との：
- 3.1 mg / mlのウシI型コラーゲンのラベルの10倍MEMの240μlのからなる15ミリリットルチューブ、脱イオンHの240μlの2 O、7.5％炭酸水素ナトリウム溶液の120μlを、1×RPMI 1640600μlのと1.8ミリリットルを準備「CD138 +のためのプレミックス 」などのチューブ。使用するまで氷上に配置します。
- 10倍MEMの50μlのからなる1.5ミリリットルチューブを準備し、脱イオンH50μlの2 O、7.5％炭酸水素ナトリウム溶液、1×RPMI 1640および3.1 mg / mlのウシI型コラーゲンのラベルの375μlの125μlの25μlの「 細胞株のためのプレミックス 」などのチューブ。使用するまで氷上に配置します。
- 6回、最終的な所望の密度でRPMI 1640でCD138 +細胞を300μlを再懸濁します。 6回、最終的な所望の密度でRPMI 1640中でBMSC細胞を300μlを再懸濁します。 1.5mlチューブやラベル「CD138 +」で一緒に両方のボリュームを混ぜます。使用するまでインキュベーターに配置します。
- 60μlのを再懸濁6回、最終的な所望の密度でRPMI 1640中で細胞株。 6回、最終的な所望の密度でRPMI 1640中でBMSC細胞の60μLを再サスペンド。 1.5mlチューブやラベル「 細胞株 」で一緒に両方のボリュームを混ぜます。使用するまでインキュベーターに配置します。
- ロボットピペッターを備えたソフトウェアを使用して、最初のスクリプトファイルをロード、「cell_seedingPt47.PGM」。ロボットのそれぞれの局A、BおよびEに200μlのピペットチップボックス、マイクロタイタープレート、および滅菌384ウェルプレートを置きます。
- と「CD138 + "" CD138 + プレミックス 」管の内容物を混ぜます。マイクロタイタープレートのウェル＃1にその内容の1.5ミリリットルを転送します。氷の上で残りの容量を有するチューブを置きます。プログラムを起動します。ロボットは、384ウェルプレートの最初の176ウェル（11一番左の列）をシードした後、一時停止します。マイクロタイタープレートのウェル＃2に、氷上でチューブの残りを転送します。プログラムを再開します。ザロボットは、384ウェルプレートの残りの144ウェルに播種し、一時停止します。
- 管の内容物「 細胞株のためのプレミックス 」と「 細胞株 」 を混合し、マイクロタイタープレートのウェル＃3にコンテンツを転送します。プログラムを再開します。ロボットは、384ウェルプレートの残りの64のウェルをシードします。
- 500×gで4℃で10分間遠心分離器に384ウェルプレートを置きます。トランスファープレートは、コラーゲン重合の1時間（5％CO 2、37°C）をインキュベータに。
- 2番目のスクリプトファイル、「media_layer.PGM "をロードします。 、局A、BおよびEへの細胞と120μlのピペットチップボックス、10％FBSを補充したRPMI-1640の31ミリリットルと試薬槽、10％の患者の血漿および1％P / S、および384ウェルプレートを置きそれぞれ。プログラムを実行します。ロボットは、各ウェルにメディアの81μLを転送します。いったん終了し、O / Nを基板に接着する間質をインキュベーター可能にする384ウェルプレートを転送します。
4.薬剤の調製およびプレートの昏睡（手動マルチチャンネルピペッターを使用） - ウェルに薬物を添加する工程を容易にし、混乱の可能性を低減するために、図3と同様のテンプレートを準備します。
- 96ウェルプレートで、プレートで、例えば、3倍希釈を用いて、5つの濃度について試験されるべき薬剤のそれぞれの連続希釈物を調製します。
- よく10倍で、最も高い濃度の所望の濃度を、薬物の120μlを添加します。細胞がプレートに公開される最高濃度は50μMになる場合例えば、500μMのメルファランを使用しています。
- 増殖培地80μLを加える4後続ウェルに（RPMI、10％FBS、10％の患者由来の血漿および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充しました）。
- 転送秒に第一のウェルから40μlのと第一のウェルの薬物濃度の1/3、または1で120マイクロリットルの全体積に、ミックス67μM。
- 残りのウェルを繰り返しステップ4.2.3（ 例えば、第三、混合するための第二から40μLを転送し、その後、第三の第4 などからの40μlを移します）。
- 細胞プレートに対応するウェルによく含む各薬剤から8μLを転送します。よく含む各薬剤は、細胞プレート中の10ウェルについて十分な容量を持つ必要があります。 図3の例では、各薬物濃度を8ウェルに添加し、最も高い濃度を除いて、6つの異なるウェルに添加します。
- 増殖培地の8μlを対照ウェルへ（RPMI、10％FBS、10％の患者由来の血漿および1％P / Sを補充しました）。
- とすぐに準備として、顕微鏡で場所細胞とベンチトップのインキュベーションをオンにします。
- http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS Fiをロボットピペッター用のスクリプトファイルをダウンロードしますles.zip
- ロボットピペッターのユーザーインターフェイスにスクリプト「media_layer_DRUGPLATE.PGM "をロードします。 120μlのピペットチップボックスを配置し、RPMI-1640の21ミリリットルとリザーバはそれぞれ、局A、BおよびEで10％FBS、10％の患者の血漿および1％P / S、空の384ウェルプレートを補いました。プログラムを実行し、ロボットピペッターは、384ウェルプレート中のすべてのウェルにメディアの30μlのを追加します。
- 補足図2からテンプレート以下のマイクロタイタープレートの各ウェルに20倍の最大濃度で薬物の200μlを添加します。このセットアップでは、31の薬まで収容します。よくコントロール（CTRL）に、10％FBS、10％の患者の血漿および1％P / Sを補充したRPMI-1640を追加します。
- それぞれの局A、BおよびCに（ステップ5.1から）メディアに120μlのピペットチップボックス、20X濃度の薬剤とのマイクロタイタープレート、384ウェルを配置します。プログラム「drug_plate.PGM」をロードします。ロボットピペッターは、連続希釈を作成します。補足図1の空間分布以下、3：1。
- それぞれの局A、BおよびC、に（ステップ3.1.9から）細胞と薬剤（ステップ5.3から）希釈および384ウェルプレートに120μlのピペットチップボックス、384ウェルプレートを置きます。ロードして実行プログラム"drug_add.PGM」。ロボットピペッターは、セルプレートにその対応に薬剤プレートの各ウェルからの薬物の8μLを転送します。いったん終了し、できるだけ早くデジタル顕微鏡のインキュベーターにセルプレートを転送します。
- とベンチトップインキュベータの内部を清掃し、エタノール - ウェットワイプ、慎重株式会社の蓋を配置しながら、プレートの蓋を取り外しubator。
- ビーコンを追加するためのソフトウェアの手順に従ってください。これは、（詳細については、ソフトウェアのユーザーガイドを参照してください）実験中に連続して画像化される、関心領域のための目印を参照するために使用される用語です。
- 5Xや10X倍率の対物レンズを使用してください。焦点は図2と同様であることを確認してください：MM細胞は、暗いリングと骨髄幹細胞またはHUVECをに囲まれた明るいディスクがほとんど見えている表示されます。いくつかの一次MM細胞は非常に小さいため、微調整が最適な焦点を見つけるために必要になることがあります。
- 10〜30分の間に少なくとも96時間の期間のための取得間隔を調整します。買収間の長い間隔が許容されるが、45分以上の間隔が著しく生存率の測定の精度を低下させることができます。
- 各ウェルの画像をビーコン-1、ビーコン-2 などのロボットピペッターを使用した場合という別々のファイルに格納されているように示されている順序でビーコンを設定し、ソフトウェアを構成します補足図3。
- 細胞は最適な条件になるように、十分な水をインキュベーターの加湿器とガスであることを確認してください。
- 実験終了後、分析を実行するコンピュータに画像を含むフォルダをコピーします。
- NIHのウェブサイトからのImageJソフトウェアをダウンロードします。http://imagej.nih.gov/ij/
- http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/でスクリプトやプラグインをダウンロード
- デジタル画像解析ソフトウェアを実行するhttp://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdfの指示に従ってください。結果は、EACのため、定期的に生存率の測定値を含むResults.csvという名前のスプレッドシートであるべきです実験期間中、プレート内の時間だけでなく（ すなわち、96時間）。
- 手動マルチチャンネルピペッターを使用している場合は、次の手順を実行します。
- ファイルhttp://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txtをダウンロードして、ステップ3.1で定義されたプレートのレイアウトに一致するように変更します（ 例えば、 図3）。
- ソフトウェアhttp://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jarをダウンロードして、入力パラメータとしてステップ5.3および5.4で作成したファイルを使用してそれを実行します。結果は、それぞれが特定の薬剤の結果をグループ化し、複数のスプレッドシートを含むフォルダ名のレポートになります。
- スプレッドシートのテンプレートのコピー＆ペーストの内容http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
注：結果は、このような薬物濃度と暴露時間の関数として、異なる薬剤への試料の化学的感受性を示す図4に示されている1、のようにグラフにしてください。 </ OL>
- ロボットピペッターを使用している場合は、次の手順を実行します。
- http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/RoboticテンプレートFiles.zipからロボットピペッターのダウンロードスクリプトファイルからテンプレートファイルをダウンロードして、ディレクトリ内のファイルを抽出します。
- 細胞を有するプレートにおける薬物のリスト、最高薬物濃度に応じDrugList.csvファイルを変更します。 補足図2のレイアウトに従ってください。
- パラメータとしてステップ7.3からステップ7.5.1で抽出したファイルやファイルResults.csvを含むフォルダを渡すプログラムBuildExperimentalDesign.javaを実行します。結果は、2つのフォルダ名MM1_SとPtSampleでなければなりません。最初は、細胞株、ポジティブコントロール用のウェル（薬剤および濃度）の説明が含まれています。第二は、同じ情報が含まれていますが、板の部分に関しては、患者の細胞を播種しました。
- ステップ7.5.3で作成した各ディレクトリにファイルResults.csvをコピーします。ダウンロードソフトウェアhttp://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jarと両方のフォルダのための手順7.5.3で作成したファイルを使用してそれを実行します。結果は7.5.3で作成したフォルダの各フォルダ名のレポートになります。レポートフォルダには、それぞれが特定の薬剤の結果をグループ化する、複数のスプレッドシートが含まれています。
- プログラムBuildGraphPadFile.javaを実行し、パラメータとしてステップ7.5.1で抽出したファイルを含むフォルダを渡し、ファイルは、ステップ7.3からResults.csv。その結果、薬剤31のそれぞれについての用量反応曲線を含むグラフパッドファイルであり、制御によって、正規化されます。各グラフは、一次MM細胞および陽性細胞ライン制御のための1つの濃度について5薬物濃度を含むであろう。
プレートの5薬剤の調製および昏睡（ロボットピペッターを使用）
プレート中の細胞の6イメージング
注：以下の手順はEVOS自動FL顕微鏡に適用されますが、すぐにベンチトップのインキュベーションまたは培養器内蔵型顕微鏡と他の電動ステージ顕微鏡に適合させることができます。
薬剤感受性の7定量
注：パーソナルコンピュータでマルチウェルプレートの分析は非常に時間がかかるため、次の命令は、コンピュータクラスタを用いた画像解析の使用を導きます。
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Representative Results
。実験の流れを簡単に図1に記載されているすべてのステップが正常に完了している場合は、顕微鏡により得られた画像は、 図2に相当する必要があります：MM細胞を生きはっきり明るくディスクおよび骨髄幹細胞またはHUVECをとして見られるべきでかろうじて見えるはずですよく背景に分布。 図2Aに見られるように、MM細胞を、一人の患者から他のサイズの範囲であるが、一般に、それらは、細胞株よりも小さいです。それらは実際に実験の期間中にエクスビボで複製されないので（96時間）は、それらが高濃度（1-3万細胞/ mlで）で播種することができます。 BMSCは、ロープロファイルを提示し、十分にストレッチの底に付着するように間質は、かろうじて検出可能であるべきです。ヒト骨髄腫細胞株H929は、患者由来のMM細胞（ 図2B）よりも有意に大きく、24時間以内に複製します。画像の混雑を防ぐために、MM細胞株を参照してくださいされています低い密度、030万/ mlでDEDは、 図2C及び2Dは 、HUVECSと共培養し、それぞれ、患者由来のMM細胞およびヒト骨髄腫細胞株H929を表す図 。 HUVECSは、第一のウェルの底に付着し、その後、互いに接触し、ネットワークを形成する、後で厚く、ルーメンとなっているし始めます。
図4は、画像解析アルゴリズムにより生成される処理ビデオから予想されるものを例示し、実験の終了時に骨髄幹細胞およびHUVECを内に、または非常に小さな緑の信号と緑色に疑似着色生MM細胞（ 図4A）が検出されない示しますすべてのMM細胞が死んでいる、最高薬物濃度（ 図4B）で。ソフトウェアは、異なるウェルからの結果を集約し、異なる薬物濃度（ 図4C）での露光時に生存能力の漸進的な損失を示すチャートを構築する必要があります。の用量応答曲線コントロール細胞株（ 例えば、H929ま たはMM1.S）は先の実験と同じでなければなりません。著しい逸脱は実験に使用される薬剤の原液に問題がある可能性があります。
これは、慎重にアーチファクトが画像解析ソフトウェアを誤解し、誤った結果をもたらすことができるように、画像形成処理を開始する前に播種したすべてのウェルを観察することが重要です。例えば、 図5（a）は、凝集塊を形成し、これらの細胞につながる、ウェル中の骨髄幹細胞の過剰な密度またはトリプシン処理および播種の間に時間が長すぎた結果を示している。 図5（b）は、MM細胞の「コロニー」を示しています。細胞株は、高い密度で播種される場合、それは他の一つのセルを識別することはますます困難になるように、それらが複製するようにそれらがコロニーを形成し、これは、デジタル画像解析アルゴリズムの精度を低下させる。 図5Cは、反対の例であります少なすぎるMM細胞を播種しました。 T骨髄吸引液から得られたMM細胞の数は、以下の500,000、および再懸濁の前にチューブ内に残っ「デッドボリューム」を高密度でMM細胞を再懸濁するために必要なメディアの量に匹敵するようになるとき、彼はしばしば起こります。この問題を解決するために、使用されるチューブのデッドボリュームを決定し、これを希釈計算に含まれる。 図5Dは、斜め焦点面の一例です。左上のMM細胞は明るく、右下のものが暗いかに注意してください。これは、午前不均一に配置され、プレートまたは正しく配置された対物レンズによって引き起こされます。これは、画像の異なる部分でのMM細胞が異なるカウントされます。スケールバー（各画像の右下）が500ミクロンを表します。
図1.プロトコル全体の説明。（A）骨marro中生検ワット吸引の1つの余分なチューブは、プロトコルのために得られます。 （B）多発性骨髄腫（MM）細胞を磁気吸引中の他の細胞から分離されます。 MM細胞（MM）、非MM細胞と血漿を含有する（C）三管は、それぞれ、分離プロセスから得られます。前の吸引から（D）骨髄由来間葉系幹細胞（骨髄幹細胞）を新たに取得したMM細胞と共培養し、細胞外マトリックス（コラーゲンまたは基底膜マトリックス）中に再懸濁しました。 （E）は 、プレートは、できるだけ多くのMMは、同じ焦点面にあり、BMSCは、ウェルの底に付着する準備ができていることを確実にするためにスピンダウンされます。マトリックスが重合されるまで、プレートをインキュベータ内に配置されます。 （F）各ウェルに培地と患者由来の血漿の混合物で充填されています。プレートをインキュベータO / Nに配置されています。 （G）薬物を各ウェルに添加し、プレートを顕微鏡に配置されますデジタルカメラ、電動ステージと、ベンチトップインキュベータを搭載し、96時間の期間、一定の間隔で画像化しました。 （H）各ウェルについての画像ファイルは、膜の動きに基づいて、セグメントがMM細胞を生きたアルゴリズムを用いて分析した（生細胞は、疑似緑色に着色されている）、各時点での各ウェルのために細胞性の変化とのスプレッドシートを作成しています。スケールバー（右下）が500ミクロンを表します。薬剤および濃度によって（I）ソフトウェアプログラムグループ井戸と初期措置が100％になるように正規化用量反応の曲線とのスプレッドシートを作成しますが。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ウェルの2プレドラッグ期待外観図。（A）間質と共培養したMM細胞。 （B）間質と共培養したヒト骨髄腫細胞株H929。 （C）HUVECSとの共培養でMM細胞を患者に由来します。 （D）HUVECSとの共培養中のヒト骨髄腫細胞株H929。スケールバー（各図の右下）が500ミクロンを表す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3は、384ウェルプレートのウェルの空間的な分布をしてください。各384ウェルプレートは、21の薬剤を用いて試験し、7つの異なる薬物、または一人の患者の試料で3患者サンプルを運ぶことができます。ライトグリーン、ライトブルーと黄褐色のウェルは、三つの異なる患者からのMM細胞が含まれています。 RX1、Rx2と、などが、5の異なるコンでそれぞれ、異なる薬剤を表しますcentrationsと重複しています。 4つのウェルは、各患者のためのコントロール（患者2のために患者1のための36〜39、126-129および200-203患者3用）として使用されています。オレンジ色のウェルを二重に、それぞれの薬物の最も高い薬剤濃度での細胞株が含まれています。黄色のウェルは、細胞株コントロール（薬物なし）である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
デジタル画像解析および用量反応グラフの図4の例。骨髄幹細胞との共培養における（A）MM細胞を、コラーゲンに埋め込 まれたIは、50 nmのカーフィルゾミブの濃度に曝露しました。画像解析アルゴリズムは緑色で生細胞および擬似色、それらを検出します。 （B）画像は、実験期間中一定の間隔で取得されます。このconcentratiで薬物の上に、ほとんど全ての細胞は、96時間の終わりに死んでいます。 （C）のグラフは、100％として= 0時間の時間のための正規化された96時間の間隔に沿っカーフィルゾミブ5つの異なる濃度についての生存細胞の数の変化を示しています。ヒト骨髄腫細胞株MM1.Sは薬効のための対照として使用しました。スケールバー（AおよびBの右下）は500μmを表すが。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5.一般的なエラーは、播種またはイメージングプレート。（A）間質細胞は「もつれ」 しています 。 （B）MM細胞の「コロニー」。 （C）が少なすぎるMM細胞。 （D）は、焦点面を斜め。スケールバー（各画像の右下）は500μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ロボットピペッターを使用して、補足図1. 384ウェルプレート中のウェルの最適空間分布。この構成では31の異なる薬剤は、5つの異なる濃度および2反復（緑）で試験することができます。また、細胞株と陽性対照（ピンク）薬物効力を確実にするために使用することができます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
補足図2の空間分布薬物「マスタープレート」。薬物希釈プレートを作成するために、各ウェルは20倍の濃度で31薬の一つが含まれ、このプレートを使用しますロボットピペッター。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ロボットピペッターでプレートを調製する際に使用される井戸の補足図3の番号。プロトコールに記載されているソフトウェアは適切に薬や濃度に井戸をマッピングするために、ウェルのこの番号が必要になります。 表示するにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
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補足図4.マイクロ流体スライドとの比較（キンら 、2014）、および現在のプロトコル。以前のシステム（左上ボルテゾミブ、中央左メルファラン）で、現在のシステムで24時間測定H929多発性骨髄腫細胞株の用量応答（右上ボルテゾミブと右中央メルファラン）。比較のために、両方のプラットフォームのための24時間でのLD50は3.9 nmおよびボルテゾミブ4.1 nMであり、6.4μMとメルファランのための14.65ミクロンであった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
要約すると、これは、骨髄の再構成において、一次MM細胞と薬剤のex vivoでの薬力学の化学的感受性を定量化するための強力かつ高スループットの方法です。このプロトコル内の重要なステップは、ウェルの適切な播種され、適切な（予期される結果については、図2を参照）フォーカス：MMと間質細胞が均一に分布されていることを確認し、その間質細胞は、ウェルの底に付着しているMMすべてのこと細胞は同じ焦点面にあり、MM細胞は暗いリングに囲まれた明るいディスクの側面を持っていること。
不適切な播種の場合には（ 図5参照）、実験を続けるのではなく、第二のプレートに播種しません。問題は、低いまたは高いMMまたは間質細胞密度は、細胞の均一な分布を確実にするためにシーディング工程中に播種し、定期的に再懸濁する前に、チューブ内の細胞濃度を確認した検出された場合メディアで。リピータ機能またはロボットディスペンサーのマルチチャンネルピペットを使用することは著しく、この問題を軽減することができます。このアッセイで使用される媒体（1:10）への細胞/マトリックスの割合が播種し、従って条件を検討することができ、ウェルの数を最大化しようとしました。 1：しかし、癌細胞又は間質によって産生されるか、または消費可溶性因子を研究するためには、メディアへの細胞/マトリックスの割合は1にすることをお勧めします。
現在実施されるように、このシステムは、非接着細胞を定量化します。ソフトウェアが変更され、間質の形態学的特徴に調整される必要がある間質の細胞性の変化を定量化するために。これは、間質区画における癌細胞または薬剤の効果を研究するための有用な特徴であろう。ここで説明したシステムは、それらが付着し、間質と結合している場合は特に、また、接着性癌細胞の細胞充実性を定量化することができません。ソリューションは、デジタルイメージのままで変更になります電子分析アルゴリズムは形態学的特徴に基づいて、間質のがんを分離する、またはいずれかの集団から細胞を同定するために使用することができる蛍光色素を有する集団のいずれかを事前にインキュベートします。
逐次測定は、したがって、はるかに詳細を提供することができるように、従来のアプローチと比較して、このプロトコルの重要性は、非破壊で、骨髄微小環境のex vivo再構成において一次癌細胞の薬物応答を評価する能力であります薬力学、のではなく、固定された時点での情報です。我々のアッセイ前6の制限の一つは、濃度の線形ウィンドウ内薬物感受性の評価を可能に薬物拡散によって生成直線勾配でした。各ウェルは、別個のエンティティであるため、現在のアッセイは、薬物濃度の任意の範囲にわたって生存能力の評価を可能にします。両方のアッセイは、しかし、（同等の結果を生成します このアプローチの複数の将来のアプリケーションの中で、当社グループは、臨床反応にこれらのアッセイが提供する薬力学情報を推定する数学的モデルを使用して焦点を当てています。この目標を達成するために、我々は、薬物誘発性細胞死の動態を記述する微分方程式のシステムに各薬物について（ 図4C）、得られたデータポイントに適合することを提案します。そして、これらの数学的モデルの臨床療法における各薬剤の既知の薬物動態学的特性のために適用することで、患者6の実際の応答を推定することが可能です。ロボットシステムを用いて播種し、昏睡を自動化することで、介護医薬品のが、また（1,536ウェルプレート中）サンプル当たり百実験薬の上だけでなく、標準をテストすることが可能です。これは実験的な薬の何百もに試験できるインシリコでの臨床試験のための可能性を開くことになります患者試料のコホート、従って仮想臨床試験13の生存曲線を作成します。
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Acknowledgments
この研究は、フロリダのBankhead-コーリーチームサイエンスグラント（2BT03）、健康/米国国立癌研究所（1R21CA164322-01）とモフィットがんセンターのチームサイエンスグラントの国立研究所の状態によって資金を供給されました。この作品は、H·リー·モフィットがんセンター＆研究所、NCI指定の総合がんセンター（P30-CA076292）でのトランスレーショナルリサーチコア施設によって部分的にサポートされています。初代細胞へのアクセスは、モフィットがんセンターで合計がん医療プロトコルを介して可能になりました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1 mg/ml Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
References
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