Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

Abstract

In dit werk beschrijven we een nieuwe aanpak die ex vivo drug gevoeligheid assays en digitale beeldanalyse combineert chemogevoeligheid en heterogeniteit van de patiënt afgeleid multiple myeloma (MM) cellen te schatten. Deze bestaat eruit zaaien primaire MM cellen vers gewonnen uit beenmergaspiraten in microfluïdische kamers uitgevoerd in multi-well platen, elk bestaande uit een reconstructie van beenmerg micro-omgeving, waaronder extracellulaire matrix (collageen of basaal membraan matrix) en stroma (patiëntspecifieke afgeleide mesenchymale stamcellen) of afgeleide humane endotheelcellen (HUVEC). De kamers worden verdoofd met verschillende middelen en concentraties en worden afgebeeld achtereenvolgens gedurende 96 uur via helderveld microscopie in een gemotoriseerde microscoop uitgerust met een digitale camera. Digitale beeldanalyse software herkent levende en dode cellen van de aanwezigheid of afwezigheid van membraan beweging en worden curven verandering in levensvatbaarheid als functie of geneesmiddel concentratie en de belichtingstijd. We gebruiken een rekenmodel voor de parameters van chemosensitiviteit van de tumor bevolking elk geneesmiddel, alsmede het aantal aanwezige als maat voor tumor heterogeniteit subpopulaties te bepalen. Deze geïndividualiseerde modellen kunnen vervolgens worden gesimuleerd therapeutische regimes en schatten klinische respons.

Introduction

Het doel van deze methode is de geneesmiddelgevoeligheid van multiple myeloma (MM) te karakteriseren primaire cellen om een panel van middelen ex vivo, zo dicht mogelijk bij fysiologische omstandigheden en voldoende nauwkeurig dat deze resultaten kunnen worden gebruikt voor het identificeren chemoresistente sub- bevolkingen in de tumor lasten en, uiteindelijk, te parametriseren rekenmodellen ontwikkeld om de klinische respons te schatten.

Rekenmodellen zijn krachtige instrumenten om complexe systemen, zoals kanker-gastheer-therapie interacties analyseren. Maar modellen zijn slechts zo goed als de gegevens die worden gebruikt om ze te parametriseren. Helaas kunnen de meeste gegevens in de literatuur niet worden gebruikt in de huidige vorm dergelijke modellen parametriseren, omdat ze vaak verkregen in elkaar uitsluitende experimentele omstandigheden. Zo worden nieuwe experimenten vaak nodig met het doel het verkrijgen van het stel experimentele parameters vereist. Het meest levensvatbaarheid assays zijn echter destructief en thons beperkt tot een klein aantal tijdstippen, vaak slechts één. Dit sterk benadeelt het gebruik van chemosensitiviteit assays te parametriseren rekenmodellen, aangezien dergelijke experimenten niet om informatie over de temporele dynamiek van het systeem. Dit geldt vooral bij primaire kankercellen, die vaak beperkt tot een paar miljoen per monster, en hebben een korte levensduur na biopsie, waardoor het aantal beschikbare experimentele omstandigheden beperken. Daarnaast hebben de meeste levensvatbaarheid-assays vereisen de scheiding van de kanker van de niet-kanker (stroma) cellen bij de kwantificering, die extra werk toevoegt aan het protocol verder verstoort de cellen en beperkt het aantal experimenten die kunnen worden uitgevoerd .

40 jaar geleden, zalm en collaborateurs ¹ voorgesteld hun beroemde in vitro kolonievorming assay voor de beoordeling van chemosensitiviteit van tumorcellen. Helaas is deze test gevonden wisselend succes vanwege het kleine aantal meervoudige myeloma (MM) patiëntenmonsters die kunnen vormen kolonies onder controle condities waren: Er werd geschat dat slechts een kleine subgroep van 0,001% tot 0,1% van MM cellen die in staat zijn tot replicatie, waarbij genoemd als multiple myeloma stamcellen ^2. Dit beperkt aanzienlijk de slaagkans van de assay en het aantal geneesmiddelen die kunnen worden getest op een bepaald moment, zelfs in recente modellen ^3. Deze kwestie is nu veel belangrijker als MM middelen (standaard of experimenteel) zijn talrijker dan vier decennia geleden.

Een belangrijke beperking van deze vroege testen is hun dichotome output: ofwel een patiënt is "gevoelig" of "bestand" om een ​​bepaalde drug. Geen informatie wordt verschaft met betrekking tot de gevoeligheid en heterogeniteit van de tumor bevolking. Zo zou patiënten met kleine subpopulaties van snelgroeiende resistente cellen worden ingedeeld als "gevoelig" voor therapie, maar zou binnenkort recidief, en dus niet benEFIT van de behandeling. Gezien het belang van de duur van de respons in overall overleving (OS) van kankerpatiënten ^4,5, is het duidelijk hoe deze assays niet goed kunnen inschatten OS constant.

Om deze beperkingen te omzeilen, en kunnen patiëntspecifieke computermodellen die aangepast klinische respons op een panel van drugs zou schatten genereren, hebben wij een werkwijze voor niet-destructief testen drug gevoeligheid van multiple myeloma (MM) cellijnen ontwikkeld en primaire MM cellen in een ex vivo reconstructie van het beenmerg micro-omgeving, met inbegrip van extracellulaire matrix en stroma ^6. Deze test had echter de beperking van te vertrouwen op een bepaalde commerciële microfluidic slide, waarvan de afmetingen en de kosten beperkt aantal experimenten of geneesmiddelen die tegelijkertijd in een gegeven apparaat kunnen worden uitgevoerd.

Het hier beschreven systeem breidt deze originele test in een hoog-throughput organotypische dosis-response platform, in vitro screenen van geneesmiddelen op basis van een digitale beeldanalyse-algoritme voor niet-destructieve kwantificeren cellevensvatbaarheid. Elk goed in 384 of 1536 putjes is een 3D-reconstructie van het beenmerg micro-omgeving, met inbegrip van primaire MM cellen, extracellulaire matrix en patiënt afgeleide stroma en groeifactoren. Live microscopie en digitale beeldanalyse gebruikt om celdood gebeurtenissen in verschillende geneesmiddelconcentraties, die worden gebruikt om dosis-respons oppervlakken genereren detecteren. Uit de in vitro data, een mathematisch model identificeert de grootte en de chemosensitiviteit van subpopulaties binnen tumorlast van de patiënt, en kan worden gebruikt om te simuleren hoe de tumor zal reageren op het geneesmiddel (en) in fysiologische omstandigheden in een klinisch regime ⁶ ( Figuur 1).

De belangrijkste vernieuwingen van dit platform zijn: (a) kleine aantal kankercellen vereist (1.000-10.000 per drug concentrantsoen); (B) evaluatie van de werkzaamheid van het geneesmiddel in fysiologische omstandigheden (extracellulaire matrix, stroma, patiënt afgeleide groeifactoren); (C) Geen toxiciteit van levensvatbaarheid markers ⁷ omdat alleen helderveld imaging wordt gebruikt, dus geen noodzaak om cellen met fluorescentie ⁸ of bioluminescentie ⁹ transfecteren; (D) continue beeldvorming verschaft geneesmiddelwerking als functie van de concentratie en de blootstellingstijd (farmacodynamica); en (e) de integratie van in vitro en computationele evolutiemodellen te schatten klinische resultaat ⁶ (Silva et al., in voorbereiding).

De belangrijkste factor waardoor de digitale beeldanalyse algoritme om kanker te onderscheiden van stromale cellen hun verschillende affiniteit aan de bodem van de put: MM cellen niet hechten, en in suspensie blijven in de matrix, terwijl stromale cellen hechten aan de bodem van de goed en dan strekken.

Deze scheiding gebeurt zelfs al MM en stroma eenopnieuw geënt op hetzelfde moment, en treedt in de O / N proces van incubatie. Het stoppen met draaien in de centrifuge na zaaien van de plaat verder versnelt dit proces. Bijgevolg MM cellen blijken in het beeld als round heldere disks omgeven door een donkere ring, terwijl de stroma handhaaft een laag profiel en een donkere kleur (Figuur 2). Aldus was de zuiverheid in zijn huidige vorm is het meest geschikt voor niet-hechtende kankercellen, hoewel correcties in het algoritme kunnen worden gedaan afzonderlijke kanker en stroma op basis van andere morfologische kenmerken, zoals grootte en vorm. In dit protocol beschrijven we twee soorten extracellulaire matrix (collageen en basaalmembraan matrix) en twee typen co-culturen met (beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen) BMSC en HUVEC, die de interstitiële en perivasculaire nissen van het beenmerg respectievelijk.

Met behulp van een 384-wells plaat, 5 concentraties per drug en twee herhalingen, waren we in staat om te test tot 31 verschillende geneesmiddelen met het monster van een patiënt. In 1536 putjes dit aantal 127. Figuur 3 toont de layout momenteel gebruikt voor handmatige zaaien van cellen, terwijl Supplemental Figuur 1 geeft de optimale verdeling met een robot pipet. In het ontwerp van figuur 3, kan elke 384-wells plaat dragen 3 monsters van patiënten met 7 verschillende drugs, of één patiënt monster getest met 21 drugs. Elk geneesmiddel wordt voorgesteld door 5 concentraties, en elke conditie geënt in duplo. 4 controleputjes (geen geneesmiddel toegevoegd) worden gezaaid voor elke set van 7 geneesmiddelen (bv putten 36-39, 126-129 en 200-203). Om de potentie van de gebruikte geneesmiddelen te waarborgen, een humane myeloma cellijn (bijvoorbeeld H929 of MM1.S) is gezaaid en verdoofd in duplo bij de hoogste concentratie van elk van de middelen die gebruikt worden (wells 76-89). De positieve cellijn zorgt ervoor dat de medicijnen die gebruikt worden over voldoende potentie, omdat hun dosis-respons curves zijn vergelijkbaar across experimenten. Twee putjes worden geënt met een myeloma cellijn als controle voor de omgevingsomstandigheden, met andere woorden, om mogelijke problemen op het werkblad incubator (wells 75 en 90) ontdekt gedurende beeldvorming. De opsomming van de putjes volgens een zigzagpatroon om de afstand die het gemotoriseerde fase van de microscoop, die acquisitietijd wordt verminderd en de slijtage van de apparatuur.

Protocol

Het gebruik van menselijke cellen afkomstig van biopten zoals hieronder beschreven werd goedgekeurd door Moffitt de Institutional Review Board en uitgevoerd onder de klinische proef MCC # 14745 uitgevoerd op het H. Lee Moffitt Cancer Center en Research Institute.

1. Het sorteren van MM Cellen van beenmergaspiraten

1. Verzamel beenmergaspiraten (20 ml) van patiënten in natriumheparine spuit.
2. Isoleer mononucleaire cellen door centrifugeren verdund beenmerg (1: 1 met steriel PBS) in een steriele waterige drager gradiënt centrifugatie bij 400 xg gedurende 30 min bij omgevingstemperatuur geroerd.
3. Verzamel de interface, die de mononucleaire cellen bevat. Was de cellen met koude PBS en te tellen met een hemocytometer of geautomatiseerde cel tegen te gaan, met behulp van trypan blauw voor de bepaling van de levensvatbaarheid.
4. Bereid een dunne laag celpreparaat slide ¹⁰ en vlek met Wright-Giemsa vlek plasma cel percentage ¹¹ beoordelen.
5. Berekenende hoeveelheid CD138 kralen worden gebruikt, indien het aantal cellen en plasmacellen percentage. Wanneer aanhechten monster ten hoogste 20% plasmacellen, dan resuspendeer cellen middels 90 pl buffer en gescheiden 10 pl CD138 kralen per 5 x 10 ⁶ cellen. Wanneer aanhechten monster meer dan 20% plasmacellen, geresuspendeerd door middel van 80 pl buffer en gescheiden 20 pl CD138 korrels per 1 x 10 ⁷ cellen.
6. Incubeer de cellen met kralen bij 4 ° C gedurende 15 min.
7. Pass cellen door een 35 micrometer zeef toegevoegd aan pre-bevochtigd scheiding (LS) kolommen geplaatst in het magnetisch veld separator (zie de lijst van materialen).
8. Verwijder kolom uit magneet. Collect-CD138 geselecteerde cellen door wassen van de kolom 3 maal met 1 ml scheidingsbuffer.
9. Beoordelen CD138 verrijking met een ander gekleurd dunne laag celpreparaat schuiven ^10.
10. Filter plasma verkregen uit beenmerg biopsie van elke patiënt met een 0,22 pm spuitfilter. Gebruik verse plasmavan dezelfde patiënt als de CD138 + -cellen.
11. Bereid media voor experiment door aanvulling RPMI-1640 met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum, 10% patiënt plasma en 1% penicilline-streptomycine.
12. Verzamel de doorstroom van de selectie (CD138-) en volg de klassieke adhesie werkwijze ¹² voor het selecteren van beenmerg mesenchymale cellen (BMSCs). Omdat dit proces vereist weken voor BMSCs klaar voor gebruik, moet worden BMSCs aanpassen van eerdere patiënten of gezonde donoren.

2. Seeding Cellen in Plates (met behulp van een handleiding Multi-channel Pipettor)

1. Gebruik een multi-well plaat (384 of 1536) met zwarte wanden en een transparante vlakke bodem, bij voorkeur één geoptimaliseerd voor optische toepassingen en celkweek.
2. Co-cultuur BMSCs met MM cellen in ofwel collageen type I of basaal membraan matrix echter HUVEC nodig basaal membraan matrix.
3. Houd de uiteindelijke dichtheid van elk celtypehet volgende bereik: 3 x 10 ⁵ cellen / ml voor MM cellijnen, 2 x 10 ⁵ cellen / ml voor HUVECs of BMSCs, en 2 x 10 ⁶ cellen / ml voor de patiënt afgeleid MM cellen.
   Opmerking: Deze dichtheden zijn het resultaat van experimentele optimalisatie om de hoogst mogelijke beeldkwaliteit en langst mogelijke beeldvormingstijd behoud van biologische relevantie in de assays. MM cellijnen worden gezaaid bij lagere dichtheden dan primaire MM cellen vanwege hun snellere replicatie snelheid en grotere omvang.
4. Co-cultuur van primaire MM cellen met BMSCs:
   1. Bereid 100 ul aliquots van pre-mixed media bestaande uit 20 gl 10x MEM, 20 ui gedeioniseerd H ₂ O, 10 pl 7,5% natriumbicarbonaatoplossing en 50 pl 1 x RPMI 1640 en bewaar bij 4 ° C.
   2. Op het moment van zaaien de platen met MM cellen, meng monsters van pre-mixed media met 150 pl 3,1 mg / ml Bovine collageen type I tot een eindvolume van 250 pl.
   3. Re-suspend 50 pi cellen in RPMI 1640 op zes maal de uiteindelijke gewenste dichtheid.
   4. Mengen om celsuspensie met collageen mix tot een eindvolume van 300 pl met een P200 pipet maken.
   5. Met behulp van een handleiding of repeater pipet, stort een 8 ul druppel eindcelconcentratie / matrix mengsel in het midden van elk putje in 384-well platen of 2 pl in elk putje van 1536 putjes (zie stap 2.6 voor een voorbeeld van ruimtelijke rangschikking putten).
   6. Centrifugeer platen voor 2 minuten bij 500 xg om alle cellen dezelfde focal plane concentreren tijdens beeldvorming.
   7. Laat plaat in een incubator (5% _CO2, 37 ° C) gedurende 1 uur, bij gel-polymerisatie.
   8. Voeg 80 ul van gesupplementeerd groeimedia (RPMI-1640, 10% FBS HI, 10% patiënt afgeleide plasma, 1% P / S) aan elk putje in 384-well platen of 8 pl in 1536 putjes.
   9. Laat plate O / N in incubator (5% _CO2, 37 ° C) voor de aanhechting van stroma op de bodem van het schaaltje.
5. Co-culture van primaire MM cellen met HUVECs:
   1. Transfer basaalmembraan matrix van -80 ° C een emmer met ijs te ontdooien.
   2. Telling en resuspendeer primaire cellen en HUVEC in RPMI-1640 medium bij 4 maal de uiteindelijke dichtheid, elk in een afzonderlijke buis.
   3. Meng patiënt cellen en HUVECs volumes bij een 1: 1 verhouding.
   4. Zodra basaalmembraan matrix ontdooid, maar niet gepolymeriseerd, meng 1: 1 met celmengsel uit de vorige stap.
   5. Seed druppels met voldoende volume van intercellulaire matrix mix in het midden van elke put (8 ul van 384 putjes en 2 gl van 1.536 putjes, zie stap 2.6 voor een voorbeeld van de ruimtelijke rangschikking van wells).
   6. Centrifuge plaat bij 500 xg gedurende 10 min.
   7. Plaats plaat incubator (5% _CO2, 37 ^{° C)} gedurende 1 uur gedurende matrix polymerisatie.
   8. Voeg groeimedium (RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 10% patiëntenplasma en 1% P / S) aan elk putje (80 pl van 384 putjes, 8 gl 1,536-well platen).
   9. Laat plate O / N in incubator (5% _CO2, 37 ° C) voor de aanhechting van HUVECs aan de onderkant van de plaat.
6. Seed een 384-wells plaat. Figuur 3 toont een typische ruimtelijke verdeling van zaaien.
   1. Vanaf goed B2, zaad zoveel kolommen als drugs worden getest. In het voorbeeld van figuur 3, gebruikt zeven drugs.
   2. Herhaal enten zo vaak als concentraties te gebruiken. In het voorbeeld in figuur 3, gebruikt vijf concentraties.
   3. Seed vier putten voor de controle omstandigheden.
   4. Herhaal stap 2.6.1 en 2.6.2 voor de tweede repliceren.
   5. Herhaal de stappen 2.6.1 tot 2.6.4 voor elke patiënt te testen monster in de plaat.
   6. Seed een MM cellijn twee lijnen putjes met elk evenveel putten drugs te testen (in duplo). Elk van deze putten worden behandeld met de hoogste concentratie van elk geneesmiddel te voorkomen dat de gebruikte had voldoende potency (zie figuur 3 bijvoorbeeld).
   7. Seed twee putjes met een MM cellijn om te dienen als controle van de experimentele condities, zoals de goede werking van het werkblad incubator, groeimedia, enz.

3. Seeding Cellen in Plates (Met behulp van een Robotic Pipettor)

Opmerking: Deze serie stappen zaden van een 384-wells plaat met behulp van een robot pipet. Het ontwerp van de plaat is weergegeven in figuur 1 Hulp, waarbij primaire MM cellen worden getest tegen een panel van 31 verschillende geneesmiddelen op vijf verschillende concentraties in twee replicaten, plus negatieve controle. Cellijn ook geënt als positieve controle voor de beoordeling van de werkzaamheid van drugs en getoetst alle 31 geneesmiddelen bij de hoogste concentratie in twee herhalingen. De bestanden zijn bedoeld voor een bepaald merk en model (zie Materialen tabel), maar het algoritme kan worden aangepast aan elke robot pipetten.

1. Co-cultuur van primaire MM cels met BMSCs:
   1. Bereid een 15 ml buisje, bestaande uit 240 gl 10x MEM, 240 pl gedeïoniseerd H ₂ O, 120 gl 7,5% natriumbicarbonaatoplossing, 600 ui 1 x RPMI 1640 en 1,8 ml van 3,1 mg / ml Bovine collageen type I. Label buis als "pre-mix voor CD138 +". Plaats op ijs tot gebruik.
   2. Bereid een 1,5 ml buisje, bestaande uit 50 gl 10x MEM, 50 ui gedeioniseerd H ₂ O, 25 gl 7,5% natriumbicarbonaatoplossing, 125 ui 1 x RPMI 1640 en 375 pl 3,1 mg / ml Bovine collageen type I. Label buis als "pre-mix voor Cell Line". Plaats op ijs tot gebruik.
   3. Resuspendeer 300 gl CD138 + cellen in RPMI 1640 op zes maal de uiteindelijke gewenste dichtheid. Resuspendeer 300 gl BMSC cellen in RPMI 1640 op zes maal de uiteindelijke gewenste dichtheid. Meng beide volumes samen in een 1,5 ml tube en label "CD138 +". Plaats in incubator tot gebruik.
   4. Re-schorten 60 picellijn in RPMI 1640 op zes maal de finale gewenste dichtheid. Resuspendeer 60 gl BMSC cellen in RPMI 1640 op zes maal de uiteindelijke gewenste dichtheid. Meng beide volumes samen in een 1,5 ml tube en label "Cell Line". Plaats in incubator tot gebruik.
   5. Met behulp van de software die bij de robot pipet, plaatst u het eerste script, "cell_seedingPt47.PGM". Plaats een 200 ul pipetpunt box, een microtiterplaat, en een steriele 384 wells plaat in de stations A, B en E, respectievelijk van de robot.
   6. Meng tubes "voormengsel voor CD138 +" en "CD138 +". Breng 1,5 ml van de inhoud naar de bron # 1 van de microtiterplaat. Plaats de buis met de resterende volume op het ijs. Start het programma. De robot zal het zaad van de eerste 176 putten (11 meest linkse kolommen) van de 384-wells plaat en dan pauzeren. Breng de resterende van de buis op het ijs om goed # 2 van microtiterplaat. Hervat het programma. Derobot zal zaad de resterende 144 putjes van de 384-wells plaat en pauze.
   7. Meng tubes "voormengsel voor cellijn" en "cellijn" en breng de inhoud goed # 3 van microtiterplaat. Hervat programma. De robot zal het zaad van de resterende 64 putjes van de 384-wells plaat.
   8. Plaats 384-wells plaat in centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 xg en 4 ° C. Overdrachtplaat incubator (5% _CO2, 37 ° C) gedurende 1 uur voor collageen polymerisatie.
   9. Laad het tweede script, "media_layer.PGM". Plaats 120 ul pipetpunt box, een reagensreservoir met 31 ml RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 10% patiëntenplasma en 1% P / S, en de 384-well plaat met cellen in stations A, B en E, respectievelijk. Start het programma. De robot zal 81 ul van media en dragen elk. Eenmaal klaar, overdragen 384-wells plaat incubator en laat stroma te houden aan O substraat / N.
4. Drug Voorbereiding en drogeren van Platen (met behulp van een handleiding Multi-channel Pipettor)
1. Bereid een template overeenkomstig figuur 3 teneinde het toevoegen geneesmiddel aan putjes vergemakkelijken en kans op verwarring.
2. Bereid in een 96-wells plaat, een seriële verdunning van elk van de middelen te testen in de plaat, bijvoorbeeld vijf concentraties met een 3-voudige verdunning:
   1. Voeg 120 ul geneesmiddel 10x de gewenste concentratie in de hoogste concentratie ook. Gebruik bijvoorbeeld 500 uM melfalan als de hoogste concentratie van de cellen worden blootgesteld in de plaat wordt 50 uM.
   2. Voeg 80 pi groeimedium (RPMI gesupplementeerd met 10% FBS, 10% patiënt afgeleide plasma en 1% penicilline / streptomycine (P / S)) aan de vier opeenvolgende putjes.
   3. Breng 40 gl van de eerste put de tweede en meng tot een totaal volume van 120 pl bij 1/3 van geneesmiddelconcentratie eerste put of 167 uM.
   4. Herhaal stap 4.2.3 om de resterende putjes (bijvoorbeeld overdracht 40 pi van de tweede naar de derde, mengen, vervolgens over 40 pi van de derde naar de vierde, etc.).
3. Breng 8 pi van elk geneesmiddel putje op de overeenkomstige put van de celplaat. Elk geneesmiddel goed met dient voldoende volume voor 10 putten in de cel plaat hebben. In het voorbeeld van figuur 3, wordt elke geneesmiddelconcentratie toegevoegd aan 6 verschillende wells, behalve de hoogste concentratie, die wordt toegevoegd aan 8 putjes.
4. Voeg 8 pi groeimedium (RPMI gesupplementeerd met 10% FBS, 10% patiënt afgeleide plasma en 1% P / S) aan de controleputjes toegevoegd.
5. Plaats cellen in microscoop zo snel klaar en zet op de bank top incubatie.

5. Drug Voorbereiding en drogeren van Platen (met behulp van een Robotic Pipettor)

1. Download script-bestanden voor robotic pipet uit http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
2. Laad het script "media_layer_DRUGPLATE.PGM" in de robotic pipet gebruikersinterface. Plaats een 120 ul pipetpunt box, reservoir met 21 ml RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 10% patiëntenplasma en 1% P / S en een lege 384-wells plaat in stations A, B en E, resp. Start het programma, zal de robot pipettor 30 ul van de media toe te voegen aan alle putjes in de 384-wells plaat.
3. Na de sjabloon Supplemental figuur 2 voeg 200 pl geneesmiddel op 20x maximale concentratie aan elk putje van een microtiterplaat. Deze opstelling is geschikt voor maximaal 31 drugs. Om het controleputje (CTRL), voeg RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 10% patiëntenplasma en 1% P / S.
4. Plaats een 120 ul pipetpunt box, microtiterplaat met drugs 20X concentratie en 384 putjes met medium (uit stap 5.1) in de stations A, B en C, respectievelijk. Laad het programma "drug_plate.PGM". De robot pipettor zal een seriële verdunning creërenvan 1: 3, na de ruimtelijke verdeling Supplemental figuur 1.
5. Plaats een 120 ul pipetpunt box, de 384-well plaat met geneesmiddelverdunning (uit stap 5.3) en de 384-well plaat met cellen (uit stap 3.1.9) in stations A, B en C, respectievelijk. Laad en run-programma "drug_add.PGM". De robot pipet zal 8 ul van drugs te brengen van elk putje in de drug plaat met zijn tegenhanger in de cel plaat. Zodra dit voltooid is, overbrengen celplaat naar de incubator van de digitale microscoop zo spoedig mogelijk.

6. Imaging van Cellen in Plate

Opmerking: De onderstaande procedure geldt voor de Evos Auto FL microscoop, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan andere gemotoriseerde fase microscoop met een werkblad of incubatie-incubator ingebedde microscopen.

1. Reinig de binnenkant van de bank top incubator met een ethanol-nat vegen en verwijder voorzichtig het deksel van de plaat, terwijl het plaatsen van het deksel van de incubator.
2. Volg de software stappen om de bakens te voegen. Dit is de term die wordt gebruikt om te verwijzen naar oriëntatiepunten voor de regio van belang zijn, achtereenvolgens worden afgebeeld tijdens het experiment (zie software handleiding voor details).
3. Gebruik een 5x of 10x vergroting doelstelling. Zorg ervoor dat de focus is vergelijkbaar met Figuur 2: MM cellen verschijnen als heldere schijven omgeven door een donkere ring en BMSCs of HUVECs zijn nauwelijks zichtbaar. Sommige eerste MM cellen zijn zeer klein en dus een fijnafstelling kan nodig zijn om de optimale scherpstelling vinden.
4. Stel de overname interval tussen 10-30 min en duur van ten minste 96 uur. Hoewel langere intervallen tussen verwervingen aanvaardbaar is, tussenpozen van 45 min of meer significant de nauwkeurigheid van de meting van de levensvatbaarheid verlagen.
5. Configureer de software, zodat de beelden van elk putje worden opgeslagen in afzonderlijke bestanden genaamd Beacon-1, Baken-2, etc. Als de robot pipet gebruikt, zet de bakens in de volgorde weergegeven inAanvullende Figuur 3.
6. Zorg ervoor dat er voldoende water in de couveuse luchtbevochtiger en gas, zodat de cellen zal worden in optimale omstandigheden.
7. Na voltooiing van het experiment, kopieert u de mappen met de beelden naar de computer dat de analyse wordt uitgevoerd.

7. Kwantificering van Drug Gevoeligheid

Opmerking: De volgende instructies helpen het gebruik van de beeldanalyse met behulp van een computer-cluster, aangezien de analyse van een plaat met meerdere holtes in een personal computer is zeer tijdrovend.

1. Download ImageJ software van de website van de NIH: http://imagej.nih.gov/ij/
2. Download script en plugins op http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
3. Volg de instructies in http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf digitale beeldanalyse software te draaien. Het resultaat moet een spreadsheet genoemd Results.csv met de levensvatbaarheid metingen op regelmatige tijdstippen voor EAC zijnh putje in de plaat gedurende de duur van het experiment (dat wil zeggen, 96 uur).
4. Bij gebruik van een handmatige multi-channel pipet, de volgende stappen uitvoeren.
   1. De file http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt en aanpassen aan de layout van de plaat bepaald in stap 3,1 overeenkomt (bijvoorbeeld figuur 3).
   2. Download de software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar en voer het uit met behulp van de bestanden die zijn gemaakt in de stappen 5.3 en 5.4 als parameter ingang. Het resultaat zal een mapnaam rapport met meerdere spreadsheets, elke groepering de resultaten voor een bepaald geneesmiddel zijn.
   3. Kopieer en plak de inhoud in spreadsheetsjabloon http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
      Opmerking: Het resultaat moet grafieken zoals degene getoond in figuur 4, die de chemosensitiviteit van het monster op verschillende drugs als functie van de geneesmiddelconcentratie en de blootstellingsduur.
   </ Ol>
   4. Bij gebruik van een robot pipet, de volgende stappen uitvoeren.
      1. Download template bestanden van Download script-bestanden voor robotic pipet uit http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Template Files.zip en bestanden uitpakken in een directory.
      2. Wijzig het bestand DrugList.csv volgens de lijst van geneesmiddelen en de hoogste geneesmiddelconcentratie in de plaat met cellen. Volg de layout van Supplemental figuur 2.
      3. Start het programma BuildExperimentalDesign.java doorgeven als parameter de map met de in stap 7.5.1 uitgepakte bestanden en de bestanden Results.csv vanaf stap 7.3. Het resultaat moet zijn twee mappen naam MM1_S en PtSample. De eerste bevat een beschrijving van de putten (drugs en concentraties) voor de cellijn positieve controle. De tweede bevat dezelfde informatie, maar over het gedeelte van de plaat geënt met cellen van een patiënt.
      4. Kopieer het bestand Results.csv in elk van de mappen aangemaakt in de stap 7.5.3. Downloadde software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar en voer het uit met behulp van de bestanden die zijn gemaakt in de stappen 7.5.3 voor beide mappen. Het resultaat zal een mapnaam rapport in elk van de mappen die in 7.5.3 zijn. De map Report bevat meerdere spreadsheets, elke groepering de resultaten voor een bepaald geneesmiddel.
      5. Start het programma BuildGraphPadFile.java en geef als parameter de map met de bestanden die in stap 7.5.1 gewonnen en de bestanden Results.csv vanaf stap 7.3. Het resultaat zal een GraphPad bestand met de dosis respons curven voor elk van de 31 drugs, en genormaliseerd door de controle. Elke grafiek wordt 5 drug concentraties voor de primaire MM cellen en één concentratie voor de positieve cellijn controle bevatten.

Representative Results

De stroom van het experiment wordt kort beschreven in figuur 1 of alle stappen met succes zijn voltooid, worden de beelden verkregen door de microscoop moet gelijk zijn Figuur 2:. Leef MM cellen worden duidelijk gezien als lichte schijven en BMSCs of HUVEC moeten nauwelijks zichtbaar en goed verdeeld in de achtergrond. Zoals blijkt uit figuur 2A, MM cellen zijn tussen de ene patiënt naar de andere, maar over het algemeen zijn ze kleiner dan cellijnen. Omdat ze praktisch niet ex vivo gerepliceerd tijdens het interval van het experiment (96 uur) kunnen worden geënt bij hogere concentraties (1-3 miljoen cellen / ml). Stroma zou nauwelijks detecteerbaar zijn, zoals BMSC zich aan de bodem van de put en rek, die een laag profiel. De menselijke myeloomcellijn H929 is aanzienlijk groter dan de patiënt afgeleid MM cellen (Figuur 2B) en repliceert binnen 24 uur. Om verdringing van het beeld te voorkomen, worden MM cellijnen ziended een lagere dichtheden, 0,3 miljoen / ml. De figuren 2C en 2D vertegenwoordigen-patiënt afgeleide MM cellen en menselijke myeloma cellijnen H929, respectievelijk co-gekweekt met HUVEC. HUVECs eerst hechten aan de bodem van de put en dan beginnen met elkaar in contact en vormen netwerken die later dikker en lumens worden.

Figuur 4 een voorbeeld van wat wordt verwacht van de verwerkte video geproduceerd door beeldanalyse algoritme toont gedetecteerd levende MM cellen pseudo-kleur groen (figuur 4A) met geen of zeer weinig groene signaal BMSCs en HUVECs aan het einde van het experiment in de hoogste geneesmiddelconcentratie, wanneer alle MM cellen dood (figuur 4B). De software moet de resultaten van verschillende bronnen verzamelen en bouwen van een grafiek beeltenis geleidelijk verlies van de levensvatbaarheid met de tijd van blootstelling aan verschillende concentraties van geneesmiddelen (Figuur 4C). De curve van de dosisrespons van decontrolecellijn (bijvoorbeeld H929 of MM1.S) dezelfde zijn als bij eerdere experimenten; aanzienlijke afwijkingen kan problemen de voorraadoplossing van geneesmiddel dat bij de proef vermeld.

Het is belangrijk om alle putjes geënt voordat het belichtingsproces zorgvuldig te observeren, zoals artefacten de beeldanalyse software kan misleiden en leiden tot foutieve resultaten. Bijvoorbeeld, Figuur 5A toont het resultaat van een overmatige dichtheid van BMSCs in de put of teveel tijd tussen behandeling met trypsine en zaaien, waardoor deze cellen vormen klonten. Figuur 5B toont "kolonies" MM cellen. Als cellijnen worden gezaaid met een hoge dichtheid, zullen zij kolonies vormen ze repliceren en dit vermindert de nauwkeurigheid van de digitale beeldanalyse algoritme wordt het steeds moeilijker om een cel te onderscheiden van elkaar. Figuur 5C is een voorbeeld van het andere, waarbij te weinig MM-cellen werden gezaaid. Thij komt vaak voor wanneer het aantal MM cellen verkregen uit de beenmergpunctie beneden 500.000 en het "dood volume" links in de buis voor resuspensie vergelijkbaar wordt de hoeveelheid dragers die aan resuspendeer MM cellen in hoge dichtheden . Om dit probleem op te lossen, bepaalt het dode volume van de buis wordt gebruikt en opnemen in de verdunningslucht berekeningen. Figuur 5D is een voorbeeld van asymmetrische focal plane. Merk op hoe MM cellen op linksboven zijn licht en die in de rechtsonder zijn donker. Dit wordt veroorzaakt door uur ongelijk geplaatst plaat of verkeerd geplaatst doelstelling. Hierdoor gaat MM cellen in verschillende delen van het beeld verschillend te tellen. Schaal bars (rechtsonder van elke afbeelding) vertegenwoordigen 500 pm.

Figuur 1. Protocol globale beschrijving. (A) tijdens een been marrow biopsie een extra buis van aspiraat wordt verkregen voor het protocol. (B) Multiple myeloom (MM) cellen magnetisch gescheiden van andere cellen in het aspireren. (C) Drie buizen gemaakt met MM cellen (MM), non-MM cellen en plasma respectievelijk worden verkregen uit het scheidingsproces. (D) Beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BMSCs) van het vorige aspiraten worden samen gekweekt met vers verkregen MM cellen en opnieuw gesuspendeerd in de extracellulaire matrix (collageen of basaal membraan matrix). (E) De plaat wordt afgedraaid zodat zoveel MM mogelijk in hetzelfde beeldvlak en BMSC klaar te houden aan de bodem van de put. De plaat wordt geplaatst in de incubator tot matrix polymeriseert. (F) Elke goed is gevuld met een mix van cultuur en media-patiënt afgeleid plasma. De plaat wordt geplaatst in een incubator O / N. (G) Geneesmiddelen worden toegevoegd aan elk putje en de plaat wordt geplaatst in een microscoopuitgerust met een digitale camera, gemotoriseerde fase en werktafel incubator, en afgebeeld regelmatig gedurende 96 uur. (H) De beeldbestanden voor elk putje worden geanalyseerd met een algoritme segmenten leven MM cellen op basis van membraan motion (levende cellen pseudo gekleurd in groen) en stelt een spreadsheet veranderingen in de cellulariteit van elk putje voor elk tijdstip. Scale bar (rechtsonder) vertegenwoordigt 500 pm. (I) Een softwareprogramma groepen de putten door drugs en ​​concentraties en creëert een spreadsheet met bochten van de dosis respons genormaliseerd zodat de oorspronkelijke maatregelen zijn 100%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Pre-drug verwachte optreden van putten. (A) MM cellen samen gekweekt met stroma. (B) Het menselijk myeloomcellijn H929 co-gekweekt met stroma. (C) Patient-afgeleide MM cellen in co-cultuur met HUVEC. (D) Human myeloomcellijn H929 in co-cultuur met HUVEC. Schaal bars (rechtsonder in elk figuur) vertegenwoordigen 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Aanbevolen ruimtelijke verdeling van putten in een 384-wells plaat. Elke 384-wells plaat kan 3 monsters van patiënten uit te voeren met 7 verschillende drugs, of één patiënt monster getest met 21 drugs. Wells in lichtgroen, lichtblauw en tan, bevatten MM cellen van drie verschillende patiënten. Rx1, Rx2, etc., vertegenwoordigen verschillende drugs, elk op vijf verschillende concentraties en in tweevoud. Vier putjes worden gebruikt als controles voor elke patiënt (36-39 patiënt 1, 126-129 patiënt 2 en 200-203 patiënt 3). Wells in oranje bevatten cellijnen ten hoogste drug concentratie van elk geneesmiddel, in tweevoud. Wells in het geel zijn cellijn controles (geen geneesmiddel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Voorbeeld van digitale beeldanalyse en dosisrespons diagrammen. (A) MM cellen in co-kweek met BMSCs, ingebed in collageen I, blootgesteld aan een concentratie van 50 nM carfilzomib. Beeldanalyse algoritme detecteert levende cellen en pseudo-kleuren ze in groen. (B) beelden werden periodiek gedurende de duur van het experiment. In dit concentratibetreffende geneesmiddel vrijwel alle cellen dood eind 96 uur. (C) De grafiek toont veranderingen in het aantal levensvatbare cellen voor vijf verschillende concentraties van carfilzomib langs een interval van 96 uur, genormaliseerd voor de tijd = 0 uur als 100%. De humane myeloma cellijn MM1.S werd als controle voor de werkzaamheid van het geneesmiddel. Schaal bars (rechtsonder in A en B) te vertegenwoordigen 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Gemeenschappelijke fouten tijdens het zaaien of imaging plaat. (A) stroma cellen "verward". (B) "Kolonies" van de MM cellen. (C) te weinig MM cellen. (D) Skewed focal plane. Schaal bars (rechtsonder van elke afbeelding) vertegenwoordigen 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1. Optimale ruimtelijke verdeling van putjes in 384-wells plaat met een robot pipet. In deze configuratie 31 verschillende geneesmiddelen kunnen worden getest in 5 verschillende concentraties en 2 herhalingen (groen). Bovendien kan positieve controles met een cellijn worden gebruikt om drug potentie (roze) te verzekeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 2. ruimtelijke verdeling van drug "master plate". De robot pipettor zal gebruik maken van deze plaat, waar elk putje bevat één van de 31 drugs op 20x concentratie, om de drug verdunning plaat te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 3. Nummering van de putten moet worden gebruikt bij het ​​opstellen van een plaat met een gerobotiseerde pipet. De in het protocol beschreven software vereist deze nummering van de putten om de putten aan de drugs en ​​de concentraties voldoende in kaart. Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.

/ftp_upload/53070/53070fig4sup.jpg "/>
Aanvullende Figuur 4. Vergelijking tussen microfluïdische dia (Khin et al., 2014) en het huidige protocol. Dosis respons van H929 multiple myeloma cellijn gemeten gedurende 24 uur in het vorige systeem (linksboven bortezomib, midden links melphalan) en in de huidige systeem ( rechtsboven bortezomib en midden rechts melphalan). Ter vergelijking, LD50 bij 24 uur voor beide platforms was 3,9 nM en 4,1 nM voor bortezomib, en 6,4 uM en 14.65 uM voor melphalan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Kortom, dit is een krachtige en high throughput methode chemogevoeligheid van primaire MM cellen en ex vivo farmacodynamiek van drugs kwantificeren in een reconstructie van het beenmerg. De kritische stappen in dit protocol de juiste zaaien van de putten en adequate gericht (zie Figuur 2 voor verwachte resultaten) waarborgen dat MM en stromale cellen gelijkmatig verdeeld, dat stromale cellen hechtend aan de bodem van de put, dat alle MM cellen in hetzelfde beeldvlak, en MM cellen het aspect van een heldere disc omgeven door een donkere ring.

In het geval van onjuiste zaaien (zie figuur 5), niet doorgaan met het experiment, maar het zaad van een tweede plaat. Als het probleem ontdekt was laag of hoog MM of stroma celdichtheid, controleert de cel concentratie in de buis voor het zaaien en resuspendeer op regelmatige tijdstippen gedurende het zaaien proces om homogene verdeling van de cellen te verzekerenin media. Het gebruik van een multi-channel pipet met repeaterfunctie of apotheekrobot dit probleem aanzienlijk verminderen. Het percentage cellen / matrix medium (01:10) die in deze test getracht het aantal putjes dat kan worden gezaaid en derhalve condities bestudeerd maximaliseren. Echter, om oplosbare factoren geproduceerd of geconsumeerd door kankercellen of stroma bestuderen, verdient het aanbeveling een deel van cellen / matrix media 1: 1.

Zoals momenteel uitgevoerd, dit systeem kwantificeert alleen het niet-hechtende cellen. Om veranderingen in celeigenschappen van stroma kwantificeren software zou moeten worden gewijzigd en aangepast aan de morfologische kenmerken van de stroma. Dit zou een nuttige functie om het effect van kankercellen of geneesmiddelen in het stroma compartiment bestuderen. De hier beschreven systeem is ook in staat om de cellulariteit van aanhangend kankercellen te kwantificeren, vooral als ze worden gecombineerd met aanhangend stroma. De oplossing modificaties in de digitale imag wordene analysealgoritme om de kanker te scheiden van stroma op basis van morfologische kenmerken, op vooraf incuberen hetzij populatie met een fluorescerende kleurstof die kan worden gebruikt om cellen te identificeren van ofwel populatie.

De betekenis van dit protocol vergeleken met eerdere benaderingen het vermogen van geneesmiddelrespons primaire kankercellen in een ex vivo reconstructie van beenmerg micro op niet-destructieve wijze te evalueren, zodat opeenvolgende metingen kunnen worden uitgevoerd, waardoor veel gedetailleerder verstrekken Informatie van de farmacodynamiek, plaats op vaste tijdstippen. Een van de beperkingen van onze eerdere test ⁶ was lineair gradiënt gegenereerd door geneesmiddeldiffusie, die verboden beoordeling van geneesmiddelgevoeligheid in een lineaire venster van concentraties. De huidige test laat de beoordeling van de levensvatbaarheid over elk bereik van drug concentraties, omdat elke put is een aparte entiteit. Beide testen, echter, het genereren van gelijkwaardige resultaten (

Onder de diverse toekomstige toepassingen van deze aanpak is de groep gericht op het gebruik van wiskundige modellen om de farmacodynamische informatie van deze testen in de klinische respons extrapoleren. Om dit doel wordt voorgesteld de gegevenspunten verkregen (Figuur 4C) voor elk geneesmiddel geschikt voor een stelsel van differentiaalvergelijkingen, de dynamiek van geneesmiddel-geïnduceerde celdood te beschrijven bereiken. Vervolgens, door vermenigvuldiging van deze mathematische modellen bekende farmacokinetische eigenschappen van elk geneesmiddel in klinisch regime, zou het mogelijk zijn een schatting van de werkelijke respons van de patiënt ^6. Door het automatiseren zaaien en drogeren gebruik van een robotsysteem, zou het mogelijk zijn naast standaard van zorg drugs te testen, maar ook meer dan honderd experimentele geneesmiddelen per monster (in een 1.536 wells plaat). Dit zou de mogelijkheid in silico klinische trials, waar honderden experimentele geneesmiddelen kunnen worden getest openenpatiëntencohorten monsters, waardoor overlevingscurves virtuele klinische proeven ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system