Abstract
Neste trabalho, descrevemos uma nova abordagem que combina ensaios ex vivo de sensibilidade a drogas e análise de imagem digital para estimar chemosensitivity e heterogeneidade de mieloma múltiplo células derivadas de pacientes (MM). Esta abordagem consiste na sementeira de células primárias MM recentemente extraídos a partir de aspirados de medula óssea para as câmaras de microfluidos aplicadas em placas de poços múltiplos, cada um consistindo de uma reconstrução do microambiente da medula óssea, incluindo a matriz extracelular (colagénio ou matriz de membrana basal) e estroma (paciente- as células estaminais mesenquimais derivadas) ou células endoteliais de origem humana (HUVECs). As câmaras são drogados com diferentes agentes e concentrações, e são gravadas sequencialmente durante 96 horas por meio de microscopia de campo claro, em um microscópio motorizado equipado com uma câmera digital. Software de análise de imagem digital detecta as células vivas e mortas da presença ou ausência de movimento da membrana, e gera curvas de alteração da viabilidade como uma função óf concentração de fármaco e o tempo de exposição. Usamos um modelo computacional para determinar os parâmetros de quimio-sensibilidade da população do tumor para cada droga, bem como o número de sub-populações apresentam-se como uma medida da heterogeneidade de tumores. Estes modelos adaptados para o paciente pode, então, ser usado para simular regimes terapêuticos e estimar a resposta clínica.
Introduction
O objectivo deste método é para caracterizar a sensibilidade à droga de mieloma múltiplo (MM), as células primárias a um painel de agentes ex vivo, tão próximo quanto possível das condições fisiológicas, e com suficiente precisão que estes resultados podem ser usados para identificar, resistente à quimioterapia sub populações dentro a carga tumoral e, em última instância, para parametrizar modelos computacionais desenvolvidos para estimar a resposta clínica.
Modelos computacionais são ferramentas poderosas para analisar sistemas complexos, tais como interações cancer-host-terapia. No entanto, os modelos são apenas tão bom quanto os dados utilizados para parametrizar-los. Infelizmente, a maioria dos dados disponíveis na literatura não podem ser utilizados na sua forma actual para parametrizar tais modelos, uma vez que muitas vezes são obtidos em condições experimentais que se excluem mutuamente. Assim, novas experiências são muitas vezes necessários com o objetivo de obter o conjunto de parâmetros experimentais necessários. A maioria dos ensaios de viabilidade, no entanto, são destrutivos e thnos limitada a um pequeno número de pontos de tempo, muitas vezes, apenas um. Isso prejudica enormemente o uso de ensaios quimiossensibilidade para parametrizar modelos computacionais, uma vez que tais experiências não fornecem informações sobre a dinâmica temporal do sistema. Isto é especialmente verdadeiro com as células cancerosas primárias, que são muitas vezes limitadas a alguns milhões por amostra, e têm uma vida útil curta após a biópsia, limitando assim o número de condições experimentais disponíveis. Além disso, a maioria dos ensaios de viabilidade exigir a separação do cancro das não-cancro (estroma), as células no momento da quantificação, o que aumenta o trabalho extra para o protocolo, perturba ainda mais as células, e limita o número de experiências que pode ser realizado .
Há 40 anos, Salmon e colaboradores uma proposta de seu famoso ensaio de formação de colónias vitro para avaliação de chemosensitivity de células tumorais. Infelizmente este ensaio encontrou o sucesso misto, devido ao pequeno número de mye múltiplaloma (MM) amostras de doentes que foram capazes de formar colónias em condições de controlo: Estimou-se que apenas um pequeno subgrupo de 0,001% a 0,1% de culas de MM foram capazes de replicação, sendo denominado como células estaminais mieloma múltiplo 2. Isto limita significativamente a taxa de sucesso do ensaio e do número de fármacos que pode ser testado de uma só vez, até mesmo nos modelos mais recentes 3. Esta questão é muito mais importante agora, quando agentes MM (padrão ou experimentais) são mais numerosos do que há quatro décadas.
Uma das principais limitações destes primeiros ensaios é a sua saída dicotomizada: ou um paciente é "sensível" ou "resistentes" a um fármaco particular. Não são fornecidas informações sobre o grau de sensibilidade e heterogeneidade da população do tumor. Assim, os pacientes com pequenos sub-populações de células de crescimento rápido resistentes seriam classificados como "sensíveis" à terapia, mas recaída em breve, e, portanto, não benAFE do tratamento. Dada a importância da duração da resposta na sobrevida global (OS) de pacientes com câncer de 4,5, é claro como estes ensaios não foram capazes de estimar corretamente OS de forma consistente.
A fim de contornar estas limitações, e para ser capaz de gerar modelos computacionais específicas do paciente que se estimar a resposta clínica personalizado para um painel de drogas, nós desenvolvemos um método para teste de sensibilidade ao fármaco de forma não destrutiva de mieloma múltiplo (MM) linhas celulares e culas do MM primários em uma reconstrução ex vivo do microambiente da medula óssea, incluindo a matriz extracelular e estroma 6. Este ensaio, no entanto, tinha a limitação de depender de um slide microfluídico comercial particular, cujas dimensões e custo restringiu o número de experimentos ou drogas que poderiam ser realizados de uma só vez em uma determinada peça de equipamento.
O sistema aqui descrito estende este ensaio original em um alto-throughput plataforma de dose-resposta organotípica, in vitro para rastreio de drogas, com base num algoritmo de análise de imagem digital para quantificar de forma não destrutiva a viabilidade celular. Cada poço em 384 ou 1536 poços placas é uma reconstrução em 3D do microambiente da medula óssea, incluindo células primárias mM, matriz extracelular, e do estroma e factores de crescimento derivados do paciente. Microscopia vivo e análise de imagem digital são utilizados para detectar acontecimentos de morte celular em diferentes concentrações de fármaco, os quais são utilizados para gerar as superfícies de dose-resposta. A partir dos dados in vitro, um modelo matemático identifica o tamanho e a quimiossensibilidade de sub-populações dentro a carga tumoral do paciente, e pode ser utilizado para simular a forma como o tumor responderá à droga (s) em condições fisiológicas, num regime clínico 6 ( Figura 1).
As principais inovações desta plataforma são: (a) pequeno número de células cancerosas necessários (1.000-10.000 por concent drogaração); (B) avaliação da eficácia do fármaco em condições fisiológicas (matriz extracelular, estroma, fatores de crescimento derivado do paciente); (C) Nenhuma toxicidade de viabilidade marcadores já que apenas 7 de imagens de campo claro é usado, portanto, não há necessidade de transferir células com fluorescência 8 ou 9 bioluminescência; (D) proporciona um efeito de imagem contínua de droga como uma função da concentração e do tempo de exposição (farmacodinâmica); e (e) entre a integração in vitro e modelos computacionais evolutivos, para estimar o resultado clínico 6 (Silva et al., em preparação).
O factor essencial que permite que o algoritmo de análise de imagem digital para discernir cancro a partir de células do estroma é a sua diferente afinidade para o fundo do poço: culas do MM não aderem, e permanecem em suspensão na matriz, enquanto que as células estromais aderir ao fundo do bem e em seguida, alongamento.
Esta separação ocorre mesmo que MM e estroma umre inoculadas ao mesmo tempo, e ocorre durante o processo de S / N de incubação. O girar para baixo no centrifugador seguinte semeadura da placa acelera ainda mais o processo. Como consequência, as células MM aparecem na imagem como discos brilhantes redonda rodeada por um anel de escuro, enquanto que o estroma mantém um perfil baixo e um tom mais escuro (Figura 2). Assim, o ensaio na sua forma actual é o mais adequado para as células de cancro não-aderentes, embora ajustes no algoritmo poderia ser feito para o cancro e estroma separados com base em outras características morfológicas, tais como o tamanho e forma. Neste protocolo, descrevem dois tipos de matriz extracelular (colagénio e da matriz da membrana basal), bem como dois tipos de co-culturas, com (derivadas de medula óssea as células estaminais mesenquimais) BMSC e HUVEC, representando os nichos intersticial e perivascular da medula óssea , respectivamente.
Usando uma placa de 384 poços, 5 concentrações por droga e duas repetições, fomos capazes de test até 31 drogas diferentes com a amostra de um único paciente. Em placas de 1536 poços este número é 127. A Figura 3 ilustra a disposição actualmente usada para a propagação de células Manual, enquanto que a Figura 1 representa uma carta a distribuição óptima utilizando um pipetador robotizado. No desenho da Figura 3, cada placa de 384 poços pode transportar três amostras de doentes com sete drogas diferentes, ou uma amostra de pacientes testados com 21 drogas. Cada droga é representado por 5 concentrações, e cada condição é semeada em duplicado. 4 poços de controlo (sem fármaco adicionado) são semeadas para cada conjunto de sete medicamentos (por exemplo, poços 36-39, 126-129 e 200-203). Para garantir a eficácia dos fármacos utilizados, uma linha de células de mieloma humano (por exemplo, H929 ou MM1.S) também é semeado, e drogados em duplicado na concentração mais elevada de cada um dos fármacos utilizados poços (76-89). O controlo positivo linha celular assegura que as drogas utilizadas têm uma potência adequada, uma vez que as suas curvas de resposta de dose são ac comparávelexperimentos de Ross. Dois poços foram semeadas com uma linha de células de mieloma como controlo para as condições ambientais, em outras palavras, para detectar possíveis problemas na incubadora de bancada durante imagiologia poços (75 e 90). A enumeração dos poços segue um padrão em zigue-zague, a fim de reduzir a distância percorrida pela fase motorizada do microscópio, o que reduz o tempo de aquisição e reduz o desgaste do equipamento.
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Protocol
O uso de células humanas derivadas de biópsias conforme descrito abaixo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Moffitt e conduzidos sob o ensaio clínico MCC # 14745 realizado no H. Lee Moffitt Cancer Center e Instituto de Pesquisa.
1. Seleção de MM Células de Medula Óssea aspirados
- Recolhe aspirados de medula óssea (20 ml) a partir de pacientes em heparina sódica seringa.
- Isolar células mononucleares por centrifugação medula diluído (1: 1 com PBS estéril) ao longo de um gradiente de meio aquoso estéril centrifugação a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente.
- Recolhe-se o interface, que contém as células mononucleares. Lave as células com PBS frio e contar com um hemocitômetro ou contador de células automatizado, usando azul de tripano para a determinação da viabilidade.
- Prepare uma camada fina preparação de células de slides 10 e mancha com Wright-Giemsa para avaliar a percentagem de células de plasma 11.
- Calculara quantidade de grânulos de CD138 para ser utilizada com base no número de células e percentagem de células de plasma. Se a partir da amostra é inferior a 20% de células do plasma, em seguida, re-suspender as células utilizando 90 mL de tampão de separação e 10 ul de pérolas de CD138 por 5 x 10 6 células. Se a partir da amostra é mais do que 20% de células do plasma, ressuspenso usando 80 ul de tampão de separação e 20 ul de pérolas de CD138 por 1 x 10 7 células.
- Incubar as células com esferas, a 4 ° C durante 15 min.
- Passar as células através de um coador 35 uM adicionado separação de pré-humedecido (LS) colunas colocado no separador de campo magnético (ver lista de materiais).
- Remover coluna de ímã. Recolhe-CD138 células seleccionadas por lavagem da coluna 3 vezes com 1 ml de tampão de separação.
- Avaliar CD138 enriquecimento com outra preparação de células em camada fina manchado slide 10.
- Filtro de plasma obtidas a partir de biópsia de medula óssea a partir de cada paciente, com um filtro de seringa de 0,22? M. Use plasma frescoa partir do mesmo paciente que as células CD138 +.
- Prepare meios para a experiência, completando meio RPMI-1640 com 10% de calor de soro fetal de bovino inactivado, 10% de plasma do paciente e 1% de penicilina-estreptomicina.
- Recolhe-se o fluxo através da selecção (CD138-) e seguir o método clássico de aderência 12 para seleccionar as células mesenquimais da medula óssea (BMSC). Uma vez que este processo requer semanas antes BMSC estão prontos para serem utilizados, é necessário dispor de BMSC pronto a partir de pacientes anteriores ou doadores saudáveis.
2. Células Sementeira em placas (usando um Multi-channel Pipetador manual)
- Usar uma placa multi-poços (384 ou 1536) com paredes negras e um fundo plano transparente, preferencialmente um optimizado para aplicações ópticas e de cultura de células.
- Co-cultura BMSCs com células MM em qualquer colágeno tipo I ou matriz da membrana basal, no entanto, exigem HUVECs matriz da membrana basal.
- Mantenha as densidades finais de cada tipo de célulaa seguinte gama: 3 x 10 5 células / ml para as linhas celulares de MM, 2 x 10 5 células / ml para células HUVEC ou BMSC, e 2 x 10 6 células / ml para células derivadas de pacientes de MM.
Nota: Estas densidades são o resultado da optimização experimental para permitir a mais elevada qualidade de imagem e tempo mais longo de imagem possível, mantendo relevância biológica nos ensaios. Linhas celulares de MM foram semeadas a densidades mais baixas do que culas do MM primário devido à sua taxa de replicação mais rápida e maior tamanho. - Co-cultura de culas do MM com BMSC primárias:
- Preparar alíquotas de 100 ul de meio de pré-misturada que consiste em 20 ul de MEM 10x, 20 ul de H2O desionizada, 10 mL de solução de bicarbonato de sódio a 7,5%, e 50 ul de 1x meio RPMI 1640 e armazenar a 4 ° C.
- No momento da sementeira das placas com culas de MM, misturar aliquotas de meio de pré-misturada com 150 ul de 3,1 mg / ml de colagénio tipo I bovino para um volume final de 250 ul.
- Re-suspextremidade 50 ul de células em meio RPMI 1640 em seis vezes a densidade final desejada.
- Misture a suspensão de células com uma mistura de colagénio para criar um volume final de 300 ul usando uma pipeta P200.
- Usando uma pipeta manual ou repetidor, depositar uma gota de 8 ul de mistura final de células / matriz, no centro de cada poço em placas de 384 poços, ou 2 uL em cada poço de placas de 1536 poços (Ver passo 2.6 para um exemplo de arranjo espacial de poços).
- Placa Centrifugar durante 2 minutos a 500 xg para concentrar todas as células para o mesmo plano focal durante o exame.
- Deixar placa numa incubadora (5% de CO2, 37 ° C) durante 1 hora, para a polimerização em gel.
- Adicionar 80 ul de meio de crescimento suplementado (RPMI-1640, 10% de FBS, 10% HI plasma derivado de paciente, 1% P / S) a cada poço em placas de 384 poços, ou 8 ul em placas de 1536 poços.
- Deixar placa S / N na incubadora (5% de CO2, 37 ° C) para a adesão do estroma para o fundo da placa.
- Co-CuLTURE de células primárias com células HUVEC MM:
- Transferência da matriz da membrana basal de -80 ° C a um balde com gelo para descongelar.
- Contagem e re-suspender as células primárias e as células HUVEC em meio RPMI-1640 a 4 vezes a densidade final, cada um, num tubo em separado.
- Misturar as células do paciente e volume de HUVECs em proporção de 1: 1.
- Uma vez matriz da membrana basal é descongelado, mas ainda não polimerizada, mistura 1: 1 com a mistura de células a partir do passo anterior.
- Gotículas de semente com um volume adequado de mistura de células-matriz, no centro de cada poço (8 ul para placas de 384 poços e 2 ul para placas de 1536 poços, ver passo 2.6 para um exemplo de arranjo espacial dos poços).
- Centrifugar a placa a 500 xg durante 10 min.
- Colocar a placa na incubadora (5% de CO 2, 37 o C) durante 1 hora para a polimerização da matriz.
- Adicionar meio de crescimento (RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma do paciente e 1% de P / S) a cada poço (80 uL para placas de 384 poços, 8 ul de 1,5Placas de 36 poços).
- Deixar placa S / N na incubadora (5% de CO2, 37 ° C) para a aderência de HUVECs ao fundo da placa.
- Semente de uma placa de 384 poços. A Figura 3 representa uma distribuição espacial típico de semeadura.
- A partir de bem B2, semear as colunas drogas a serem testadas. No exemplo da Figura 3, utilizar sete drogas.
- Repita sementeira tantas vezes quantas as concentrações a utilizar. No exemplo da Figura 3, usar cinco concentrações.
- Semente mais quatro poços para condições de controle.
- Repita os passos 2.6.1 e 2.6.2 para a segunda repetição.
- Repita os passos 2.6.1 a 2.6.4 para cada amostra de doente a ser testado na placa.
- Propagar uma linha de células de MM em duas linhas de poços, cada um com o máximo de poços como drogas a serem testadas (em duplicado). Cada uma destas cavidades será tratado com a concentração mais elevada de cada fármaco para assegurar que o material utilizado tinha poten adequadacy (ver Figura 3, por exemplo).
- Semente de dois poços com uma linha celular de MM para servir como controlo das condições experimentais, tais como bom funcionamento da incubadora de bancada, meios de crescimento, etc.
3. sementeira de células em placas (Usando um Robotic Pipetador)
Nota: Esta série de passos de sementes de uma placa de 384 poços, utilizando um pipetador robotizado. O design da placa está ilustrado na Figura Suplementar 1, em que as células primárias MM são testados contra um painel de 31 drogas diferentes em cinco concentrações diferentes em duas repetições, para além do controlo negativo. Uma linha celular é também semeadas como controlo positivo para a avaliação da eficácia de drogas e testadas contra todos os 31 medicamentos na concentração mais elevada, em duas repetições. Os ficheiros são fornecidos por uma marca e modelo específico (ver quadro Materiais), mas o algoritmo pode ser adaptado a quaisquer pipetadores robóticos.
- Co-cultura de células MM primários com BMSC:
- Preparar um tubo de 15 ml consistindo em 240 ul de MEM de 10x, 240 ul de H2O desionizada, 120 mL de solução de bicarbonato de sódio a 7,5%, 600 ul de 1x meio RPMI 1640 e 1,8 ml de 3,1 mg / ml de colagénio tipo I bovino etiqueta tubo como "pré-mistura para CD138 +". Colocar em gelo até à utilização.
- Preparar um tubo de 1,5 mL consistindo em 50 ul de MEM 10x, 50 ul de H2O desionizada, 25 mL de solução de bicarbonato de sódio a 7,5%, 125 ul de 1x meio RPMI 1640 e 375 ul de 3,1 mg / ml de colagénio tipo I bovino etiqueta tubo como "pré-mistura para a linha celular". Colocar em gelo até à utilização.
- Re-suspender 300 ul de células CD138 + em RPMI 1640 em seis vezes a densidade final desejado. Re-suspender a 300 ul de células BMSC em meio RPMI 1640 a seis vezes a densidade final desejada. Misturar ambos os volumes em conjunto num tubo de 1,5 ml e rótulo "CD138 +". Colocar na incubadora até à sua utilização.
- Re-suspender 60 ul delinha celular em meio RPMI 1640 a seis vezes a densidade final desejada. Re-suspender 60 ul de células BMSC em meio RPMI 1640 a seis vezes a densidade final desejada. Misturar ambos os volumes em conjunto num tubo de 1,5 ml e rótulo "linha celular". Colocar na incubadora até à sua utilização.
- Usando o software fornecido com a pipeta de robótica, carregue o primeiro arquivo de script, "cell_seedingPt47.PGM". Coloque uma caixa de 200 ul ponta da pipeta, uma placa de microtitulação, e uma placa de 384 poços estéril nas estações A, B e E, respectivamente, do robô.
- Misturar os conteúdos dos tubos de "pré-mistura para CD138 +" e "CD138 +". Transferir 1,5 ml de o seu conteúdo para o bem # 1 da placa de microtitulação. Colocar o tubo com volume restante no gelo. Inicie o programa. O robô vai semear as primeiras 176 poços (11 mais à esquerda colunas) da placa de 384 poços e, em seguida, fazer uma pausa. Transferir o restante do tubo em gelo para assim # 2 da placa de microtitulação. Retomar o programa. Orobot semearão as restantes 144 poços da placa de 384 poços e pausa.
- Misture o conteúdo de tubos "pré-mistura para a linha celular" e "Linha celular" e transferir o conteúdo para o bem nº 3 de placa de microtitulação. Resume programa. O robô vai semear as restantes 64 poços da placa de 384 poços.
- Coloque 384 poços na placa de centrifugação durante 10 min a 500 xg e 4 ° C. Placa de transferência para incubadora (5% de CO2, 37 ° C) durante 1 hora para a polimerização do colagénio.
- Coloque o segundo arquivo de script, "media_layer.PGM". Coloque a caixa da ponteira 120 uL, de um reservatório de reagente com 31 ml de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma do paciente e 1% de P / S, e a placa de 384 poços com células em postos A, B e E, respectivamente. Execute o programa. O robô irá transferir 81 ul de meio para cada poço. Uma vez terminado, transferem placa de 384 poços a incubadora e permitir estroma para aderir ao substrato S / N.
4. Drogas Preparação e drogar Plates (Usando um Multi-channel Pipetador Manual) - Preparar um modelo semelhante ao da Figura 3, a fim de facilitar o processo de adição de droga aos poços e reduzir a probabilidade de confusão.
- Preparar, numa placa de 96 poços, uma diluição em série de cada um dos fármacos a serem testados na placa, por exemplo, para cinco concentrações utilizando uma diluição de 3 vezes:
- Adicionar 120 ul de fármaco a 10x a concentração desejada na concentração mais elevada bem. Por exemplo, usar 500 uM melfalano se a concentração mais elevada as células serão expostas na placa será de 50 uM.
- Adicionar 80 ul de meio de crescimento (meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma derivado do paciente e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S)) para as quatro poços subsequentes.
- Transferir 40 uL da primeira cavidade para o segundo e misturar, para um volume total de 120 ul, a 1/3 da concentração de fármaco do primeiro poço, ou 167? M.
- Repita o passo 4.2.3 para os poços restantes (por exemplo, transferir 40 ul da segunda para a terceira, misturar, em seguida, transferir 40 ul da terceira para a quarta, etc.).
- Transferir 8 ul a partir de cada fármaco que contém a bem o correspondente poço na placa de células. Cada droga contendo também deve ter um volume suficiente para 10 poços da placa de células. No exemplo da Figura 3, cada concentração de fármaco é adicionada a seis poços diferentes, excepto para a concentração mais elevada, a qual é adicionada a 8 poços.
- Adicionar 8 mL de meio de crescimento (meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma derivado do paciente e 1% de P / S) para os poços de controlo.
- Coloque as células em microscópio assim que pronto e virar na bancada de incubação.
- Baixar arquivos de script para pipettor robótico de http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
- Carregar o script "media_layer_DRUGPLATE.PGM" na interface do usuário pipettor robótico. Coloque uma caixa de ponta de pipeta 120 uL, reservatório com 21 ml de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma do paciente e 1% de P / S e uma placa de 384 poços vazios nas estações A, B e E, respectivamente. Executar o programa, o pipetador robotizado irá adicionar 30 ul de meios de comunicação para todas as cavidades na placa de 384 poços.
- Seguindo o modelo da Figura 2 Suplementar adicionar 200 ul de fármaco a 20x a concentração máxima para cada poço de uma placa de microtitulação. Esta instalação acomoda até 31 drogas. Para o controlo do poço (CTRL), adicionar meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma do paciente e 1% de P / S.
- Coloque uma caixa da ponteira 120 ul, de placas de microtitulação com drogas em concentração 20X, e de 384 poços com meios (do passo 5.1) em postos A, B e C, respectivamente. Carregar o programa "drug_plate.PGM". A pipeta robótico irá criar uma diluição em sériede 1: 3, na sequência da distribuição espacial em Suplementar Figura 1.
- Coloque uma caixa de ponta de pipeta 120 uL, a placa de 384 poços com diluição de fármaco (a partir do passo 5.3) e a placa de 384 poços com células (a partir do passo 3.1.9) em postos A, B e C, respectivamente. Carregar e executar o programa "drug_add.PGM". O pipetador robotizado transferirá 8 ul de fármaco a partir de cada poço na placa de droga para a sua contrapartida na placa de células. Uma vez terminado, a transferência de células para a placa da incubadora microscópio digital o mais rapidamente possível.
- Limpar o interior da incubadora de bancada com uma mistura de etanol-esfregão húmido e cuidadosamente remover a tampa da placa, enquanto a colocação da tampa do incubator.
- Siga os passos de software para adicionar as balizas. Este é o termo usado para se referir a pontos de referência para as regiões de interesse, a ser trabalhada, sucessivamente, durante o experimento (veja o guia do usuário do software para obter detalhes).
- Use um objetivo ampliação 5X ou 10X. Certifique-se de que o foco é semelhante à Figura 2: células MM aparecem como discos brilhantes cercadas por um anel escuro e BMSCs ou HUVECs são pouco visíveis. Algumas células MM primários são muito pequenas e, portanto, um ajuste fino pode ser obrigado a encontrar o melhor foco.
- Ajuste o intervalo de aquisição entre 10-30 min e para a duração de pelo menos 96 horas. Enquanto intervalos mais longos entre aquisições são aceitáveis, intervalos de 45 minutos ou mais pode reduzir significativamente a precisão da medição de viabilidade.
- Configure o software para que as imagens de cada poço são armazenados em arquivos separados chamados Beacon-1, Beacon-2, etc. Se foi usada a pipeta de robótica, definir as balizas na ordem descrita naFigura Suplementar 3.
- Certifique-se de que há água suficiente no umidificador incubadora e gás, de modo que as células estarão em melhores condições.
- Após a conclusão do experimento, copie as pastas que contêm as imagens para o computador que irá executar a análise.
- Baixe software ImageJ do site da NIH: http://imagej.nih.gov/ij/
- Baixe roteiro e plugins em http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
- Siga as instruções em http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf para executar o software de análise de imagem digital. O resultado deve ser uma planilha denominada Results.csv que contém as medições de viabilidade em intervalos regulares para each cavidade da placa para a duração da experiência (isto é, 96 horas).
- Se estiver usando uma pipeta multi-canal manual, execute os seguintes passos.
- Baixe o arquivo http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt e modificá-lo para coincidir com o layout da placa definido no passo 3.1 (por exemplo, a Figura 3).
- Faça o download do software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar e executá-lo usando os arquivos criados nos passos 5.3 e 5.4 como o parâmetro de entrada. O resultado será um Relatório de nome da pasta que contém várias planilhas, cada agrupamento dos resultados para um determinado medicamento.
- Copiar e colar o conteúdo em modelo de planilha http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
Nota: O resultado deve ser gráficos, tais como o representado na Figura 4, que representa a quimiossensibilidade da amostra para drogas diferentes como uma função da concentração do fármaco e o tempo de exposição. </ Ol>
- Se estiver usando uma pipeta de robótica, execute os seguintes passos.
- Baixar arquivos de modelo de transferir arquivos de script para pipettor robótico de http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Template Files.zip e extrair arquivos em um diretório.
- Modificar o arquivo DrugList.csv de acordo com a lista de medicamentos e maior concentração da droga na placa com células. Siga o layout de Suplementar Figura 2.
- Execute o programa BuildExperimentalDesign.java passando como parâmetro a pasta que contém os arquivos extraídos na etapa 7.5.1 e os arquivos Results.csv a partir do passo 7.3. O resultado deve ser duas pastas nomear MM1_S e PtSample. O primeiro contém uma descrição dos poços (drogas) e as concentrações para o controlo positivo linha celular. A segunda contém a mesma informação, mas sobre a parte da placa semeada com células do paciente.
- Copie o arquivo Results.csv em cada um dos diretórios criados na etapa 7.5.3. Baixaro software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar e executá-lo usando os arquivos criados nos passos 7.5.3 para ambas as pastas. O resultado será um Relatório de nome da pasta em cada uma das pastas criadas no 7.5.3. A pasta relatório contém várias planilhas, cada agrupamento dos resultados para um determinado medicamento.
- Execute o programa BuildGraphPadFile.java e passar como parâmetro a pasta que contém os arquivos extraídos na etapa 7.5.1 e os arquivos Results.csv a partir do passo 7.3. O resultado será um ficheiro GraphPad contendo as curvas de resposta à dose para cada uma das 31 drogas, e normalizada por controle. Cada gráfico irá conter cinco concentrações de drogas para as células MM primárias e uma concentração para o controlo positivo linha celular.
5. Preparação de drogas e drogar Plates (Usando um Robotic Pipetador)
6. imagens de células em placa
Nota: O procedimento que se segue aplica-se ao microscópio Evos Auto FL, mas pode ser facilmente adaptada a outros microscópios platina motorizada com bancada de incubação ou microscópios embebidos em incubadora.
7. Quantificação de sensibilidade aos fármacos
Nota: Os seguintes instruções orientam o uso da análise de imagem utilizando um computador aglomerado, uma vez que a análise de uma placa multi-poços em um computador pessoal é extremamente demorado.
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Representative Results
O fluxo da experiência é brevemente descrito na Figura 1 Se todas as etapas são completadas com sucesso, as imagens obtidas por microscópio deve ser equivalente à Figura 2:. Vivo culas do MM deve ser claramente visto como discos brilhantes e BMSC ou HUVECs deve ser pouco visível e bem distribuídas no fundo. Como pode ser visto na Figura 2A, culas do MM variam em tamanho de um paciente para outro, mas, em geral, eles são menores do que as linhas celulares. Uma vez que praticamente não se replicam ex vivo, durante o intervalo do ensaio (96 horas) que podem ser semeadas em concentrações elevadas (1-3 milhões de células / mL). Estroma deve ser praticamente indetectável, como BMSC aderir ao fundo do poço e estiramento, apresentando um perfil baixo. A linha de células de mieloma humano H929 é significativamente maior do que as células derivadas de pacientes de MM (Figura 2B), e replica dentro de 24 horas. Para evitar aglomeração da imagem, linhas celulares MM são verded a densidades mais baixas, 0,3 milhões / ml. As Figuras 2C e 2D representam células derivadas de pacientes de MM e linhas celulares de mieloma humano H929, respectivamente, co-cultivados com HUVEC. HUVECS primeiro aderir ao fundo do poço e, em seguida, começa a contactar entre si e formam redes, o que mais tarde se tornam mais espessas e com lúmens.
A Figura 4 exemplifica o que é de se esperar a partir dos vídeos gerados processados pelo algoritmo de análise de imagem, que mostra detectado culas do MM vivo pseudo-coloridas em verde (Figura 4A), com muito pouco ou nenhum sinal em verde e BMSC HUVEC no final da experiência na concentração de fármaco mais elevada, quando todas as culas do MM são mortos (Figura 4B). O software deve agregar os resultados de diferentes poços e construir um gráfico que descreve a perda gradual de viabilidade com o tempo de exposição a diferentes concentrações de fármaco (Figura 4C). A curva de resposta à dose doA linha celular de controlo (por exemplo, H929 ou MM1.S) deve ser a mesma que para as experiências anteriores; desvios significativos podem indicar problemas com a solução de reserva de fármaco utilizado na experiência.
É importante observar cuidadosamente todos os poços semeados antes de iniciar o processo de criação de imagens, como artefatos podem enganar o software de análise de imagem e levar a resultados falsos. Por exemplo, a Figura 5A mostra o resultado de uma excessiva densidade de BMSC no poço ou demasiado tempo decorrido entre tripsinização e semear, levando a essas células que formam aglomerados. A Figura 5B mostra "colónias" de células mm. Se as linhas de células são semeadas a densidades elevadas, eles vão formar colónias como se replicam e isto reduz a precisão do algoritmo de análise de imagem digital, torna-se cada vez mais difícil de discernir uma célula a partir do outro. A Figura 5C é um exemplo da frente, onde muito poucas células MM foram semeadas. Tsua muitas vezes ocorre quando o número de células obtidas a partir do MM aspirado de medula óssea é inferior a 500.000, e o "volume morto" deixado no tubo antes de re-suspensão torna-se comparável ao volume do meio requerido para re-suspender as células mM em altas densidades . Para resolver este problema, determinar o volume morto para o tubo a ser utilizado e inclui-lo nos cálculos de diluição. A Figura 5D é um exemplo de plano focal enviesada. Note como MM células na parte superior esquerda são brilhantes e os da parte inferior direita são escuros. Isso é causado por am placa colocada de forma desigual ou objetivo colocado incorretamente. Isto fará com que células do MM em diferentes secções da imagem a ser contado de forma diferente. Barras de escala (canto inferior direito de cada imagem) representam 500 mm.
Figura 1. Protocolo de descrição geral. (A) Durante uma Marro ósseaw biópsia de um tubo extra aspirado é obtido para o protocolo. (B) células de mieloma múltiplo (MM) está magneticamente separada de outras células do aspirado. (C) três tubos, contendo células MM (MM), células não-mM e de plasma, respectivamente, são obtidos a partir do processo de separação. (D) de osso derivadas de medula células estaminais mesenquimais (BMSC) a partir de aspirados anteriores são co-cultivadas com culas de MM obtidos de fresco, e re-suspenso em matriz extracelular (colagénio ou matriz de membrana basal). (E) A placa é girada para baixo para garantir que o maior número possível MM estão no mesmo plano focal e a BMSC estão prontos a aderir ao fundo do poço. A placa é colocada na incubadora até matriz polimeriza. (F) Cada poço é preenchido com uma mistura de meios de cultura e de plasma derivado do paciente. A placa é colocada num incubador de O / N. (G) Os fármacos são adicionados a cada poço e a placa é colocada num microscópioequipado com uma câmera digital, platina motorizada e bancada incubadora, e fotografada em intervalos regulares durante um período de 96 horas. (H) Os ficheiros de imagem para cada cavidade são analisados utilizando um algoritmo que segmentos vivo culas do MM com base em movimento da membrana (células vivas são pseudo colorida de verde) e cria uma folha de cálculo com alterações na celularidade para cada poço para cada ponto de tempo. Barra de escala (inferior direito) representa 500 mm. (I) grupos de um programa de software dos poços por drogas e concentrações e cria uma planilha com curvas de dose-resposta normalizados para que as medidas iniciais são de 100%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Pré-fármaco aparência esperada de poços. (A) culas de MM co-cultivadas com estroma. (B) A linha de células de mieloma humano H929 co-cultivadas com estroma. (C) Paciente derivado culas de MM em co-cultura com HUVEC. (D) Human linha celular de mieloma H929 em co-cultura com HUVECS. Barras de escala (canto inferior direito de cada figura) representam 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Recomendado distribuição espacial dos poços de uma placa de 384 poços. Cada placa de 384 poços pode transportar três amostras de doentes com sete drogas diferentes, ou uma amostra de pacientes testados com 21 drogas. Wells em verde claro, azul e tan, contêm células MM de três pacientes diferentes. Rx1, Rx2, etc., representam drogas diferentes, cada um em cinco con diferentecentrações e em duplicado. Quatro poços são usados como controles para cada paciente (36-39 para o paciente 1, 126-129 para o paciente 2 e 200-203 para o paciente 3). Wells em laranja contêm linhas celulares na maior concentração de droga de cada droga, em duplicado. Wells em amarelo são controles de linha celular (sem drogas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Exemplo de análise de imagens digitais e gráficos de resposta à dose. (A) culas de MM em co-cultura com BMSC, incorporado em colagénio I, exposto a uma concentração de 50 nM carfilzomib. Algoritmo de análise de imagem detecta células vivas e pseudo-cores em verde. (B) As imagens são adquiridas em intervalos regulares durante todo o período da experiência. Neste concentratina de droga, quase todas as células estão mortas no final de 96 horas. (C) O gráfico mostra as alterações do número de células viáveis para cinco concentrações diferentes de carfilzomib ao longo de um intervalo de 96 h, normalizado para o tempo = 0 horas, como 100%. A linha de células de mieloma humano MM1.S foi utilizado como controlo para a eficácia do fármaco. Barras de escala (canto inferior direito da A e B) representam 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Erros comuns enquanto sementeira ou imagem de placa. (A) células do estroma "Tangled". (B) "colônias" de células mm. (C) É muito poucas células MM. (D) enviesado plano focal. Barras de escala (canto inferior direito de cada imagem) representam 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar 1. distribuição espacial óptima dos poços na placa de 384 poços, utilizando um pipetador robotizado. Nesta configuração 31 diferentes drogas podem ser testados a 5 concentrações diferentes e duas repetições (verde). Além disso, os controlos positivos com uma linha celular pode ser usado para garantir a potência da droga (rosa). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar 2. Distribuição espacial da droga "prato principal". A pipeta robótico usará esta placa em que cada poço contém uma das 31 drogas em 20x concentração, para criar a placa de diluição de drogas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar 3. A numeração dos poços a serem utilizados na preparação de uma placa com uma pipeta de robótica. O software descrito no protocolo requer essa numeração dos poços, a fim de mapear adequadamente os poços às drogas e concentrações. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Suplementar Figura 4. Comparação entre slides microfluídico (Khin et al., 2014) e protocolo atual. Dose de resposta H929 linha de células de mieloma múltiplo medido durante 24 horas no sistema anterior (bortezomib superior esquerdo, melfalano esquerda do meio) e no sistema atual ( bortezomib superior direito e melfalano médio direito). Para fins de comparação, DL50 às 24 horas para ambas as plataformas foi de 3,9 nM e 4,1 nM para bortezomib, e 6,4 mM e 14,65 M para o melfalano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em resumo, este é um método poderoso e alta taxa de transferência para quantificar a quimiossensibilidade de culas do MM primárias e ex vivo farmacodinâmica da droga através de uma reconstrução da medula óssea. Os passos críticos dentro deste protocolo são a semeadura adequada dos poços e concentrando adequada (ver Figura 2 para os resultados esperados): assegurar que as células estromais MM e são distribuídos uniformemente, que as células estromais são aderentes ao fundo do poço, que todos MM células estão no mesmo plano focal, e que as células têm o aspecto de MM de um disco brilhante rodeado por um anel escuro.
Em caso de semeadura imprópria (ver Figura 5), não continue com o experimento, mas sim semear uma segunda placa. Se o problema detectado era de baixa ou alta densidade MM ou células de estroma, verificar a concentração de células no tubo antes da semeadura e ressuspender em intervalos regulares durante o processo de sementeira para assegurar uma distribuição homogénea de célulasnos meios de comunicação. A utilização de uma pipeta multi-canal com a função de repetidor ou dispensador robótico pode reduzir significativamente este problema. A proporção de célula / matriz aos meios de comunicação (01:10) utilizados neste ensaio procurados para maximizar o número de cavidades que pode ser semeado e, portanto, as condições estudadas. No entanto, para estudar fatores solúveis produzidos ou consumidos por células cancerosas ou estroma, recomenda-se que a proporção de células / matriz para a mídia ser 1: 1.
Tal como actualmente aplicado, este sistema quantifica apenas as células não aderentes. A fim de quantificar as alterações na celularidade do estroma o software que necessitam de ser modificados e ajustados para as características morfológicas do estroma. Esta seria uma característica útil para estudar o efeito de células cancerosas ou drogas no compartimento do estroma. O sistema aqui descrito, é igualmente incapaz de quantificar a celularidade de células cancerosas aderentes, especialmente se eles são combinados com estroma aderente. A solução seria modificações na imag digitaisalgoritmo de análise de e para separar o cancro do estroma com base nas características morfológicas, ou para pré-incubar durante população com um corante fluorescente que pode ser utilizado para identificar as células de qualquer população.
O significado deste protocolo em comparação com abordagens anteriores é a capacidade de avaliar a resposta à droga de células de cancro primário em uma reconstrução ex vivo do microambiente da medula óssea de um modo não destrutivo, de modo que as medições sequenciais pode ser feita, fornecendo, assim, muito mais detalhada informações da farmacodinâmica, em vez de pontos fixos de tempo. Uma das limitações do nosso ensaio prévio 6 foi o gradiente linear gerado por difusão da droga, o que só permitiu a avaliação da sensibilidade ao fármaco dentro de uma janela de concentrações linear. O presente ensaio permite a avaliação da viabilidade em qualquer intervalo de concentrações de fármaco, uma vez que cada poço é uma entidade separada. Ambos os ensaios, no entanto, gerar resultados equivalentes ( Entre as múltiplas aplicações futuras desta abordagem, o nosso grupo está focado na utilização de modelos matemáticos para extrapolar as informações farmacodinâmica fornecida por estes ensaios em resposta clínica. Para atingir este objectivo propõe-se encaixar os pontos de dados obtidos (Figura 4C) para cada fármaco a um sistema de equações diferenciais, descrevendo a dinâmica da morte celular induzida por drogas. Em seguida, através da aplicação a esses modelos matemáticos conhecidos as propriedades farmacocinéticas de cada droga num regime clínico, seria possível estimar a resposta real do paciente 6. Ao automatizar semeadura e drogando usando um sistema robotizado, seria possível testar não só padrão de cuidados de drogas, mas também mais de uma centena de drogas experimentais por amostra (1536, em uma placa de bem). Isso abriria a possibilidade de in silico ensaios clínicos, onde centenas de drogas experimentais poderiam ser testados emcoortes de amostras dos pacientes, criando assim as curvas de sobrevida para os ensaios clínicos virtuais 13.
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Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Estado de Bankhead Coley-Science Team Grant da Flórida (2BT03), os Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional do Câncer (1R21CA164322-01) e Equipe de Ciência Grant do Moffitt Cancer Center. Este trabalho foi apoiado em parte pela facilidade de Pesquisa Translacional do núcleo no H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, uma Comprehensive Cancer Center NCI designado (P30-CA076292). O acesso a células primárias só foi possível através do Protocolo de Total Care Cancer no Moffitt Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1 mg/ml Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
References
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