Abstract
Свежевыделенные опухолевые специфические эндотелиальные клетки (TEC) может быть использован для изучения молекулярных механизмов ангиогенеза опухоли и служат модели в пробирке для разработки новых ингибиторов ангиогенеза рака. Тем не менее, долгосрочные в пробирке расширения мышиных эндотелиальных клеток (ЭК) является сложной задачей из-за дрейфа в фенотипической культуры (переход эндотелия к мезенхимальных) и загрязнения с не-ЕС. Это особенно верно для TEC, которые легко outcompeted посредством взаимодействующих очищают фибробластов или опухолевых клеток в культуре. Здесь метод изоляции с высокой точностью, что использует иммуномагнитной обогащения в сочетании с выбором колонии и в расширении пробирке описано. Этот подход порождает чистые фракции ЕС, которые полностью свободны от загрязнения стромальных клеток или опухолевых. Он также показал, что клонов-прослеживается Cdh5 CRE: / л репортер мышей ZsGreen л / с, используемые при работе с протоколом, описанным в данном документе, являются ценным инструментом, чтобы проверить ячейкучистота, как изолированных колоний ЕС из этих мышах показывают прочный и блестящий ZsGreen флуоресценции в культуре.
Introduction
Эндотелиальные клетки (ЭК) имеют важное значение при разработке твердых опухолей. Из инициации ангиогенного переключателя в неактивных опухолей к распространению и посева метастазов в отдаленных местах, ЕС образуют трубопроводы, которые обеспечивают крови, кислорода и питательных веществ для поддержания роста опухоли 1. Как недавно предложил, ЕС также перфузии-независимых функций и образуют нишу, которая поддерживает рост раковых стволовых клеток и других опухолевых клеток стромы 2-5. Таким образом, высокой степени очистки опухоли конкретных EC (TEC) для культуры в пробирке позволяет рутинных функциональных исследований, которые проливают свет на новые молекулярные механизмы посредников опухолевый ангиогенез и перекрестные помехи с опухолевыми клетками.
ЕС являются узкоспециализированными в зависимости от ткани происхождения 6. В связи с гетерогенной природы различных типов опухолей и микросреды опухоли, ТЭЦ может также отображать уникальные особенности, которые отражают опухоли конкретных специализации Oе сосудистой. Например, поражает изменчивость сигнатур экспрессии генов в TEC, выделенных из различных типов или классов опухолей 7,8. Тем не менее, часто совместно очистка не-ЕС, особенно опухолеассоциированных фибробластов и опухолевых клеток, с TEC может посрамить выражение генома анализов. Эти нежелательные типы клеток особенно проблематичным в исследованиях, которые полагаются на долгосрочной перспективе в пробирке расширения ТИК культур.
Описанный здесь метод высококачественный, которые последовательно производит чистые культуры ЕС от опухолей и других тканей. После обогащения иммуномагнитный столбца фракций ЕС и удаления совместно очищают не-ЕС, дополнительный шаг клонирования кольцо для захвата чистых колоний ЕС используется 9. Каждая колония может быть расширена в культуре для многих пассажей без возникновения загрязнения не входящих в ЕС. Этот метод также дает несколько клонов ЕС от одной процедуры изоляции, которая идеально подходит для изучения эндоthelial неоднородность. Кроме того, показано, что Cdh5 CRE: / л репортер мышей ZsGreen л / с ценным инструментом для создания "судьба-карту" и неизгладимо-маркировку СЕ которые поддерживают ZsGreen флуоресценции в культуре 10. С незначительными изменениями к протоколу, этот метод должен быть адаптированы к различным типам опухолевых или нормальных тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол осуществляется в соответствии с правилами, установленными Департаментом лабораторных животных медицины в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл.
1. Подготовьте следующие материалы и реактивы Перед началом
- Подготовьте EC носитель путем дополнения 400 мл низкий уровень глюкозы в (1 г / л D-глюкозы или LG) по способу Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM), 50 мл инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 50 мл Nu-сыворотка IV, 5 мл антибиотика-противогрибкового, и hFGF, VEGF, hEGF, R3 ИФР-1, а также компоненты гепарина из коммерческого набора.
- Приготовьте 500 мл FACS буфера (0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА в PBS); фильтруют через стерильный фильтр 0,22 мкм чашки.
- Стерилизовать или дезинфекции рассечения доска.
- Стерилизовать рассечение булавки, ножницы, хирургические и диссекторы.
2. Изоляция ЕС (День 1, ~ 5 ч)
- Эвтаназии мышь с двуокисью углерода или других методов совместимый остроумиеч комитет Уходу за животными и использование (IACUC) политики.
Примечание: Несколько опухоли молочной железы, различающихся по размеру (5 - 15 мм в диаметре), может развиваться в одном генетически модифицированных мышей, таких как C3-тег, убедитесь, что урожай все из них для выделения TEC. При использовании опухоли, которые вживляют в ортотопически мышей, бассейн в два-три см 3 1 опухолей для одного изоляции ЕС. Здесь мы используем опухолей молочной железы в качестве демонстрации, но протокол может быть модифицирован для других типов опухолей. - Лечить мыши путем распыления или протирания мыши брюшной стороне с достаточным количеством 75% об / об этанола.
- Резекцию опухоли с одной парой ножниц и диссекторов использованием асептических методов в стерильных капот или на чистом столе.
- Протяни и приколоть конечности мышей на вскрытии борту. Сделайте срединный разрез брюшной с ножницами, не открывая брюшины. Рассеките в поперечном направлении между кожей и брюшины к молочных желез, где опухоли расположены.Не открывайте брюшины.
- Акцизный только опухолевая ткань из молочных желез, оставляя нормальные молочных поля. Осторожно обрезать неопухолевые тканей, таких как кожа и мышцы, и поместить расчлененные опухоли в конической трубки, содержащей 30 мл DMEM-LG на льду.
- Принесите образцы опухоли ткани капот культуры; мыть тканей стерильной LG-DMEM 1 - 2 раза.
- Передача опухоли от конической трубе в стерильный тканевой культуральной чашке Петри, добавляют 2 мл среды DMEM-LG в чашке, и фарш с парой ножниц в стерильных частей <5 мм.
- Добавить 5 мл коллагеназы (фондовые = 2 мг / мл в Хэнка сбалансированный солевой раствор, далее HBSS), 1 мл диспазу (фондовые = 2,5 U / мл в HBSS) и 75 мкл дезоксирибонуклеазы (акций = 1 мг / мл в PBS ) в чашке Петри. Общий объем теперь ~ 10 мл.
- Передача смесь коллагеназа / ткани от чашки Петри с тканевой трубки диссоциатора и работать на ткани диссоциации в течение 60 сек в два раза (предварительно установлен диссоциации прogram на диссоциатора: 1270 Всего выстрелов в перспективе). Инкубируйте с малой нагрузки на шейкере в течение 75 мин при 37 ° С.
- Фильтр переваривается ткани через сито 100 мкм клеток в течение 50 мл коническую пробирку. Промыть фильтр с 5 мл FACS буфера для мытья любых оставшихся клеток. Спин при 280 мкг в течение 5 мин и тщательно аспирата супернатант, не нарушая клеточный осадок.
- Развести 1 мл исходного буфера для лизиса эритроцитов (10x) в 9 мл стерильной воды. Лизировать эритроциты с 10 мл буфера для лизиса (1x), и сразу же вращаться 5 мин при 280 х г в. Примечание: Этот шаг может быть пропущен, если немного крови видна.
- Ресуспендируют в 10 мл FACS буфера. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего, и рассчитывать живые клетки с помощью гемоцитометра.
- Ресуспендируют клеток в ~ 10 7 клеток / 100 мкл. Добавить 10 мкл FcR блока на 100 мкл клеточной суспензии, и инкубируют на льду в течение 10 мин.
- Добавить крысы против мыши ПЭ-конъюгированного CD31 антитело по. Таблицу 1 Выдержите на льду в течение 10 - 15 мин и вылить трубки иногда.
- Добавьте 10 мл FACS буфера в пробирку и спин при 280 х г в течение 5 мин. Осторожно удалите супернатант и мыть осадок клеток снова 5 мл FACS буфера. Центрифуга для осаждения клеток. Аспирируйте супернатант, не нарушая гранул клеток.
- Добавить FACS буфера и анти-PE микрошариков в соответствии с таблицей 2 Инкубируют на льду в течение 10 - 15 мин.. Флик трубки иногда.
- Добавьте 10 мл буфера и спиновых образцов FACS при 280 х г в течение 5 мин; Промывают один раз 5 мл FACS буфера и центрифугируют снова. Аспирируйте супернатант, не нарушая гранул.
- Принесите объем до 300 мкл в FACS буфера. Спина через 35 клеток фильтра мкм ограничен трубка 5 мин при 280 х г. Используйте 2 трубы и больший объем, если это необходимо.
- Установите магнитный многоклетевые и магнитные колонки в капот, приложите колонку в сепараторе и уравновесить колонку 2 мл FACS буфера.
- Aspiratе супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 0,5 - 1 мл FACS буфера.
- Pass клеточной суспензии через уравновешенную колонку магнитного.
- Промыть колонку три раза с 2 мл FACS буфера, и собирать проточные (FT) в 15 мл пробирку (FT фракции).
- Возьмите колонки вне сепаратора и элюируют с 2 мл FACS буфера в другой 15 мл трубки (элюата фракции). Использование плунжера, чтобы обеспечить все клетки из колонки. Повторите элюирование еще два раза с 2 мл FACS буфера каждый раз.
- Спин элюата при 280 мкг в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл EC сред.
- В равной степени разделить элюата фракции (~ 6 мл) в 10 см покрытые желатином блюд. За три 1 см 3 опухоли, плиты элюировали клетки, по крайней мере четырех пластин. В качестве альтернативы, пластина Элюированные клетки в различных концентрациях в нескольких пластин (например., Семена 0,5 мл, 1 мл, 1,5 мл и 3 мл элюата в четырех пластин), чтобы обеспечить, чтот мере одна пластина негусто затравку элюированных клеток. Убедитесь, что конфлюентности прилагаемых клеток при ~ 1%, то на следующий день (то есть, примерно 1,0 - 2,0 х 10 5 клеток), прикрепленные.
Примечание: Клетки должны быть покрыты редкими, так что колонии EC могут образовывать без загрязненных другими типами клеток. - Плита ФТ фракция в одной 10 см блюдо, чтобы восстановить клетки O / N. Убедитесь, что пластина 80 - 100% сливающийся на следующий день. Замораживание вниз клетки (-80 ° С) в 250 мкл среды клеточной замораживания в криоскопической пробирки и хранить их в жидком азоте на следующий день. Примечание: FT фракция может быть использован для изоляции опухолевых клеток на более поздней стадии и / или в качестве отрицательного контроля для анализа экспрессии генов ЕС выделенных клонов EC.
- Изменить СМИ каждые 2 - 3 дня. Колонии начинают формироваться после 7 - 10 дней. Небольшие колонии ЕС могут быть идентифицированы в начале дня 3. Марка колоний с тонкой наконечником маркера на дно тарелки.
- Соскребите неспецифической Cлоктей, окружающие выявленных колоний стерильным 200 мкл pippet наконечником.
3. Колония выбор с помощью клонирования Кольца
- Изменить СМИ каждые 2 - 3 дня. Чистота ЕС могут быть проверены LDL (DiI-Ас-ЛПНП) Кроме того около 5 - 7 дней. Добавить 50 мкл ЛНП в 10 мл среды EC и инкубировать в течение 3 - 4 ч перед проверкой клетки под флуоресцентным микроскопом.
Примечание: Несколько ЛПНП + клоны EC можно было наблюдать на ~ 7 день. - Начало уборки колонии ЕС, когда они достигают диаметра 3 - 5 мм. (Выберите большие колонии, которые упакованы с маленькими ЛПНП + клеток для достижения наилучших результатов.)
- Перед сбором EC с клонированием кольца, предварительного покрытия несколько 6-луночных планшетах с 0,5% желатина. Аспирируйте желатин, добавить 2 мл ЕС СМИ в каждую лунку, и держать пластины в инкубаторе, пока не требуется.
- Соскребите не входящих в ЕС по краям колоний, чтобы убедиться, нет других типов клеток не будет в ловушке внутри клонирования кольца.
- Использованиефаза-контрастный микроскоп (4X или 10X цель), наметить с тонкой наконечником маркера на дне чашки для культивирования области, содержащие колонии ЕС.
- Промыть пластины с 10 мл PBS и оставить очень тонкий слой PBS в пластине, когда аспирационная. (Важно: небольшое количество (~ 0,5 мл) PBS будет держать клетки живых во время процедуры клонирования кольца, а также, клей ткани нуждается в воде для связывания).
- Выбрать клонирования кольцо соответствующего размера. Используйте пару щипцов рассекающих подобрать кольцо и с пипетки наконечник 10 мкл равномерно нанесите небольшое количество клея ткани на клонирование кольца.
Примечание: используйте только минимальное количество (~ 0.2 мкл для небольшой кольца) клея ткани на клонирования колец, и сделать клей, что ткань распределены равномерно вокруг нижней поверхности, чтобы обеспечить хорошее уплотнение. Клей Чрезмерное ткани производит тепло и образует пленки, которые могут убивать клетки. - Поместите клонирования кольцо на колонии ЕС. Осторожно надавите на клонирование кольцо склеить РИнг на тарелку. Убедитесь, что колонии не высохли перед склеиванием кольцо.
- Сразу пипетки 25 мкл ферментного раствора клеточной отряд в клонирования кольца и инкубировать ~ 1 мин или пока клетки свободно прилагается.
- Внесите клеток в клонирование кольцо каплям в одну лунку 6-луночного планшета, содержащего подогретого СМИ ЕС. (Важно: Не трясите пластины для разгона клетки; ЕК предпочитают расти в плотных скоплениях.) Вымойте клонирования кольцо с 50 - 100 мкл СМИ ЕС, чтобы собрать как много клеток, как это возможно, и передать все моет в те же 6-а ,
- Если некоторые колонии в 10 см блюдо слишком малы, чтобы собрать, добавить 10 мл свежей среды, пусть колонии растут в течение еще нескольких дней, и повторить процедуру клонирования кольцо снова.
- Расти собранные колонии в 6-луночных планшетах до 80 - 100% сплошности, и передача клетки 3 лунки 6-луночного планшета, перед расширением их в 10 см блюдо культуры ткани. Соскребите загрязняющих клетки. Повторениееще один раунд процедуры клонирования кольца (шаги 3.5 - 3.10), если это необходимо. Держите клетки относительно сливной (~ 60 - 70%) при расширении. ЕС может перестать расти, если покрытием слишком мало.
- Охарактеризовать ЕС по FACS, окрашивание, ПЦР и т.д. Обратите внимание, что Дил-Ас-ЛПНП люминесцентные и может помешать PE или других флуоресцентных антител для FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ЕС представляют собой лишь незначительную долю от общего количества клеток в большинстве тканей взрослого 11. Поэтому важно, чтобы в полной мере переварить собранного ткани в одной клеточной суспензии, который обеспечивает максимальную высвобождение EC от внеклеточного матрикса (ЕСМ) и соединительной ткани. По нашему опыту, CD31-опосредованной иммуномагнитный выбор только обеспечивает обогащенные, но не чистые фракции ЕС; Поэтому, еще один важный шаг является физическое удаление совместно очищают, не ЕС и отбора / расширения колоний ЕС с использованием клонирования кольца (рис 1). Например, когда CD31-обогащенный ЕС высевали без дальнейшего отбора колонии, вне Европейского Союза быстро увеличилось, и приобщены к ЕС, производя нечистые культур ЕС как показали Дил-Ас-ЛПНП + и DiI-AC-ЛПНП - популяций (рис 2А) , Однако, когда элюаты столбцов высевали при низкой плотности, колонии ЕС вырос с относительно небольшим окружающей входящих в ЕС, которые были удалены с помощью СКизнасиловании с концом пипетки (Фигура 2В). Рост и чистота расширенных колоний может быть дополнительно контролироваться добавлением разбавленной-AC-ЛПНП. Небольшие колонии ЕС может наблюдаться при ~ седьмой день после обогащения колонка CD31-опосредованный (рис 2B, верхние панели). После выбора и расширения колоний EC, разбавленным-Ac-LDL - клетки будут устранены, и клеточную популяцию весьма чистым для Dil-AC-ЛПНП + EC как указано поглощения Гомотетия-Ac-ЛПНП (Фигура 2В, нижние панели).
Чтобы проверить, если метод изоляции может производить последовательные результаты, несколько клонов, полученных из опухолей либо молочных резецированных от С3-Tag (FVB / N С3 1 -Tag) мышей или нормальные молочные железы соответствует возрасту дикого типа FVB мышей были выделены и расширен 12. Чистоту каждого TEC и нормальной EC (NEC) населения затем осторожно характеризуется обеспечить чистоту. Проточной цитометрии анализ трех независимых выборок показал один, форМед CD31 + популяции, отличалась от контроля IgG изотипа (3А). МРНК экспрессию маркеров EC, включая CD31, Cdh5 (VE-кадгерина), CD133, и VEGFR2 во всех четырех клонов EC испытания был ~ 200 до 7000 раз выше, чем у мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs), который использовали в качестве отрицательного контроля (3В). Как и ожидалось, все клоны EC выразил почти недетектируемые уровни мезенхимальных маркерных генов Col1a1 и Tagln по сравнению с MEFs. Иммунофлуоресцентного окрашивания показал, что все клетки в репрезентативной TEC клона равномерно CD31 + (3С). Кроме того, эти клоны EC смогли сформировать спонтанные сосудов, как структуры в пробирке, указывая они сохраняют эндотелиальные функции после культивирования (рис 3D).
Метод изоляция была дополнительно подтверждена с помощью Cdh5 CRE: ZsGreen
Рисунок 1. Блок-схема и обзор процедуры выделения ЕС.
Рисунок 2. Дил-Ас-ЛПНП Отличает ЕС от загрязняющих не входящих в ЕС живых культур. (А) фазового контраста и флуоресцентные изображения, показывающие EC и со-изолированные, не ЕС без выбора клонирование кольцо колоний ЕС. (B), фазового контраста и флуоресцентные изображения колоний ЕС на разных этапах изолированно. Пунктирные линии отмечают boundariЭС Дил-Ac-ЛПНП + EC и окружающие клетки. загрязняющие Белые наконечники стрел указывают не входящих в ЕС за пределами колонии ЕС, которые должны быть удалены с кончика пипетки. Масштабные бары представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Клонирование Кольца и физическое удаление Non-EC получения чистого и функционального долгосрочные культур ЕС. (A) Характерные FACS точка участки CD31 окрашивания различных клонов ЕС. Три репрезентативные образцы показаны. Открытая черный прямоугольник в каждом участке очерчивает население CD31 +. Изотип IgG используется в качестве отрицательного контроля. (Б) Измерение эндотелиальной экспрессии генов в отдельных NEC и TEC клонов. Уровни мРНК эндотелиIAL гены CD31, CD133, Cdh5 и VEGFR2 выражены по отношению к тем, из эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ), а уровни мРНК генов мезенхимальные Col1a1 и Tagln выражены по отношению к тем, НЭК-1. (С) представитель иммунофлуоресцентного окрашивания расширенном TEC клона. CD31 показано на зеленый и ядра окрашивают синий с 4'6'-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). (D) Типичные изображения формирования трубки различных клонов ЕС посеянных на Matrigel. Масштабные бары представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. ЕС Изолированные от Cdh5 CRE: ZsGreen
| Номер мобильного | FACS-буфера (мкл) | CD31-PE антитела (мкл) |
| 1 х 10 7 | 100 | |
| 2 х 10 7 | 200 | 6 |
| 3 х 10 7 | 300 | 7 |
| 4 х 10 7 | 400 | 8 |
| 5 х 10 7 | 5 часов | 9 |
| 6 х 10 7 | 600 | 10 |
Таблица 1. PE-сопряженных Объемы Анти-CD31 антитела, необходимых для различных номера сотового.
| Номер мобильного | FACS-буфера (мкл) | Анти-РЕ магнитные микрошарики (мкл) | 1 х 10 7 | 80 | 20 |
| 2 х 10 7 | 160 | 40 |
| 3 х 10 7 | 240 | 60 |
| 4 х 10 7 | 320 | 80 |
| 5 х 10 7 | 400 | 100 |
| 6 х 10 7 | 480 | 120 |
Таблица 2. Анти-РЕ MicroBead объемах, необходимых для разных номеров сотовых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Из-за трудностей в получении чистых первичных TEC культур, многие в пробирке исследования заменитель TEC с коммерчески доступных линий ЕС или первичной ЕС, таких как пупочной вены человека (HUVEC ЕС) 13. Тем не менее, эти группы населения ЕС от нормальных тканей может служить только в качестве прокси-сервера для TEC, которые заметно отличаются от своих обычных аналогов. Например, TEC фенотипически и функционально ненормальным в естественных условиях и некоторые из этих аномалий могут быть передаваемый в пробирке 14-18. TEC есть ненормальный рост перелетные и дифференциации способностей и могут сливаться с CD31 + опухолевых клеток с образованием сосудов, как структуры 16,19,20. Исследования с использованием либо культурные TEC или лазерная захвата микро-расчлененный опухолевые сосуды продемонстрировали, что TEC отклоняться от нормального ЕС в экспрессии генов, цитогенетических и эпигенетических профилей 12,18,21-23. Несмотря углубления нашего понимания опухолевого ангиогенеза на прошломНесколько десятилетий, очень мало функциональные и механистические исследования с использованием культурный основной TEC доступны.
ЕС были выделены из человека пупочной вены в начале 1970-х годов 24. Последующее выделение и культивирование микрососудов ЕС от других человеческих и мышиных тканях дала мощный инструмент для исследования эндотелиальных функций в обоих здоровья и болезни 25-28. Большинство протоколов изоляции ЕС включает три основные стадии: получение одного суспензии клеток после механической диссоциации или ферментативного расщепления, маркировка ЕС с эндотелиальной конкретных антител, которые, конъюгированного с либо флуорофорных или магнитных микросфер, и обогащая населения ЕС с помощью сортировки клеток или магнитные колонки. Тем не менее, выделение мыши ЕС, более предпочтительно от опухолей, оказалось трудным из-за низкого выхода жизнеспособных EC и частого загрязнения других типов клеток, включая опухолевых клеток и фибробластов. Кроме того, в пробирке фенотипическая дрейф ЕС в меняsenchymal-подобные клетки (эндотелиальной к мезенхимальных перехода, EndMT) представляет собой дополнительную проблему для долгосрочного культивирования ЕС от нормальных тканей, опухолей, и перепрограммировать предшественников.
Основная задача в процессе выделения TEC является загрязнение опухолевыми клетками, которые могут легко вытеснить с медленнее растущие колонии ЕС, которые обычно появляются после ~ 7 - 10 дней в культуре. Кроме того, обычно используется селективный маркер для выделения ЕК CD31, который в большом количестве экспрессируется в эндотелии, но также отмечает кроветворных клеток, а в некоторых случаях субпопуляций опухолевых клеточных 20,30. Кроме того, в то время как для обогащения ЕС, CD31-опосредованный отбор иммуномагнитный колонка может не удалить каждую ячейку, загрязняющие в конечном итоге может взять на себя культуру ЕС через несколько проходов. При добавлении клонирование кольцо шаг, человек способен выбрать и расширить чистые клонально-популяциях EC, которые свободны от этих загрязняющих типов клеток. Второй проблемой является долгосрочная главныйживанию чистого ЕС без продвижения EndMT. EndMT происходит во время разработки, может быть воспроизводятся при сосудистой дисфункции, и является общим в культуре EC (особенно в присутствии TGF-beta) 31-33. Чтобы свести к минимуму EndMT, удалить загрязняющие клетки, которые могут выступать в качестве источника TGF-beta, держите культур при высоких плотностях и поддерживать высокие концентрации оФРФ в средствах массовой информации на все времена. Как мы уже показали, в последнее время, оФРФ важно сохранить спецификацию ЕС, как это противодействует TGF-beta-приводом выражение гладкой актин (AN EndMT маркер) 34.
Используя эту методику, изоляции ЭК от "рок-карту" репортер мышей также показали. Эти мыши особенно полезны в исследованиях, в которых изображения прижизненной необходима 35. Хотя некоторые маркировка кроветворных клеток может происходить в CRE Cdh5: ZsGreen L / S / L мышей, используемых здесь, эта модель обеспечивает относительно быстрое и простое способ для генерации гриппorescent ЕС в естественных условиях. Альтернативный ЕС Lineage маркировки модель является тамоксифен индуцируемый мыши (Cdh5 CRE / ERT2) пересек со штаммом мыши floxed репортера (ZsGreen л / с / л), что будет иметь ЕС добросовестно и необратимо отмечены 36,37 , Флуоресцентный EC от индуцируемых CRE мышей также могут быть очищены с использованием FACS или с использованием методологии, мы описываем в данном документе.
ЕС являются гетерогенными в различных сосудистых бассейнах и «внутри сосуда" неоднородности могут также существовать среди ЕС в тот же сосуд 38,39. Кроме того, иерархия EC с различной пролиферативного потенциала было отмечено в популяции EC, выделенных из вены, и малая доля клонального EC можно пассировать за 40 удвоений популяции 40. Таким образом, ограничения описанного способа здесь включают в себя: 1) можно выбор из этих высоко пролиферативной ЕС, проживающего в стенке сосуда; и 2) обогащение только одной спецификацииБР сосудистой подтип получены из артерий, вен, или капилляров, которые могут производить клоны, которые не полностью отражают общую популяцию ЕС в естественных условиях. Тем не менее, несколько клоновых субпопуляций могут быть получены из одного методу выделения, этот метод может быть полезен для функциональных и генетических анализов EC неоднородности, которые существуют внутри опухоли и других тканей 12. Взятые вместе, описано здесь является метод изоляции ЕС, который производит чистые колонии ЕС лишенные загрязнения не входящих в ЕС. Выделенные клетки должны быть полезными для в пробирке функциональных исследований, генома выражение профилирования и молекулярной характеристики новых путей, которые контролируют ангиогенез в опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C.
- Dudley, A. C.
- Aird, W. C.
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
