Abstract
Appena isolate tumore-specifici cellule endoteliali (TEC) possono essere usati per esplorare i meccanismi molecolari di angiogenesi tumorale e servire come un modello in vitro per lo sviluppo di nuovi inibitori dell'angiogenesi per il cancro. Tuttavia, a lungo termine in espansione in vitro di cellule endoteliali murine (EC) è difficile a causa di deriva fenotipica nella cultura (passaggio endoteliale-a-mesenchimale) e la contaminazione con i non-CE. Ciò è particolarmente vero per TEC, che sono prontamente outcompeted da fibroblasti co-purificate o cellule tumorali in coltura. Qui, un metodo di isolamento ad alta fedeltà che sfrutta arricchimento immunomagnetica accoppiato con selezione delle colonie e in espansione in vitro è descritto. Questo approccio genera frazioni pure CE che sono completamente libero di contaminare cellule stromali o tumorali. E 'inoltre dimostrato che lignaggio tracciato Cdh5 cre: / l topi reporter ZsGreen l / s, utilizzati con il protocollo qui descritto, sono un valido strumento per verificare cellularepurezza isolate colonie CE di questi topi mostrano durevole e brillante fluorescenza ZsGreen nella cultura.
Introduction
Le cellule endoteliali (EC) sono essenziali durante lo sviluppo di tumori solidi. Da inizio dello switch angiogenico nei tumori dormienti per la diffusione e la semina delle metastasi a siti distanti, CE formano i condotti che forniscono sangue, ossigeno e sostanze nutritive per sostenere la crescita del tumore 1. Come recentemente suggerito, CE hanno anche funzioni di perfusione indipendente e formano una nicchia che supporta la crescita delle cellule staminali del cancro e di altre cellule stromali del tumore 2-5. Così, altamente purificato CE (TCE) per la cultura in vitro tumore-specifica permette di studi funzionali di routine che faranno luce sui meccanismi molecolari che mediano l'angiogenesi tumorale e diafonia con le cellule tumorali.
CE sono altamente specializzata a seconda del tessuto di origine 6. A causa della natura eterogenea dei diversi tipi di tumore e il microambiente tumorale, TEC può anche visualizzare le caratteristiche uniche che riflettono un tumore-specifica specializzazione of il sistema vascolare. Ad esempio, vi è la variabilità sorprendente nelle firme di espressione genica nel TEC isolate da diversi tipi o categorie di tumori 7,8. Tuttavia, frequenti co-purificazione di non CE, in particolare fibroblasti associati al tumore e le cellule tumorali, con TEC può confondere le analisi di espressione su scala genomica. Questi tipi di cellule indesiderate sono particolarmente problematico in studi che si basano su a lungo termine in espansione in vitro di culture TEC.
Descritto qui è un metodo ad alta fedeltà che produce costantemente le colture pure CE da tumori e di altri tessuti. A seguito di colonna immunomagnetica arricchimento delle frazioni e la rimozione di co-purificato non CE CE, un passo clonazione anello aggiuntivo per catturare colonie puri CE viene utilizzato 9. Ogni colonia può essere espansa in coltura per più passaggi, senza l'emergere di contaminazione non CE. Questo metodo produce anche più cloni CE da una singola procedura di isolamento, che è ideale per lo studio di endoeterogeneità thelial. Inoltre, è dimostrato che Cdh5 cre: / l topi ZsGreen l / s giornalista sono uno strumento prezioso per la generazione EC "destino-mapped" e indelebilmente marcato che mantengono ZsGreen fluorescenza nella cultura 10. Con piccole modifiche al protocollo, questo metodo dovrebbe essere adattabile a diversi tipi di tumore o tessuti normali.
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Protocol
Il protocollo che segue è effettuata secondo le linee guida stabilite dal Dipartimento di Medicina di Laboratorio animali presso la University of North Carolina a Chapel Hill.
1. Preparare il seguente materiale e reagenti prima di iniziare
- Preparare supporti CE, completandola 400 ml glucosio basso (1 g / l D-glucosio o LG) Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM) con 50 ml di siero fetale bovino inattivato al calore, 50 ml di Nu-Siero IV, 5 ml di antibiotico-antimicotico, e la hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, e componenti eparina dal kit commerciale.
- Preparare 500 ml FACS tampone (0,5% BSA e 2 mM EDTA in PBS); filtrare attraverso una sterile 0,22 micron coppa del filtro.
- Sterilizzare o disinfettare dissezione bordo.
- Sterilizzare perni dissezione, forbici chirurgiche e dissettori.
2. Isolamento CE (1 ° giorno, ~ 5 ore)
- Euthanize mouse con anidride carbonica o altri metodi di spirito compatibileh la cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) politiche.
Nota: Più tumori mammari di dimensioni variabili (5 - 15 mm di diametro) possono sviluppare in un singolo mouse geneticamente modificati come C3-Tag, assicurarsi di raccogliere tutti loro per l'isolamento TEC. Se si utilizza tumori che sono ortotopicamente innestato nei topi, piscina due o tre 1 centimetro 3 tumori per un singolo isolamento CE. Qui usiamo tumori mammari come dimostrazione, ma il protocollo può essere modificato per altri tipi di tumori. - Disinfettare topo nebulizzare o passare la parte ventrale mouse con ampie quantità di 75% v / v di etanolo.
- Resecare tumori con un paio di forbici e dissettori utilizzando tecniche asettiche in una cappa sterile o in un banco pulito.
- Stendi e pin le membra del mouse su una scheda di dissezione. Effettuare una incisione ventrale linea mediana con le forbici senza aprire il peritoneo. Sezionare lateralmente tra la pelle ed il peritoneo verso le ghiandole mammarie in cui si trovano i tumori.Non aprire il peritoneo.
- Accise solo tessuto tumorale dalle ghiandole mammarie, lasciando fuori normali margini mammarie. Rifilare con cura off tessuti non tumorali, come la pelle ei muscoli, e il luogo tumori sezionato in una provetta contenente 30 ml di LG-DMEM su ghiaccio.
- Portare campioni di tumore alla cappa coltura di tessuti; lavare i tessuti con sterile LG-DMEM 1 - 2 volte.
- Trasferire i tumori del tubo conico di una capsula di Petri tessuto-cultura sterili, aggiungere 2 ml di LG-DMEM nel piatto, e tritare con un paio di forbici sterili in pezzi <5 mm.
- Aggiungere 5 ml di collagenasi (magazzino = 2 mg / ml in soluzione salina bilanciata di Hank, seguito HBSS), 1 ml di dispasi (magazzino = 2,5 U / ml in HBSS) e 75 ml di deossiribonucleasi (magazzino = 1 mg / ml in PBS ) nella capsula di Petri. Il volume totale è ora ~ 10 ml.
- Trasferire il mix collagenasi / tessuto dal capsula di Petri di un tubo di tessuto-dissociatore ed eseguire su un dissociatore tessuto per 60 secondi per due volte (pre-impostato di dissociazione prOgram sul dissociatore: 1.270 giri totali per corsa). Incubare con la luce agitando su un agitatore per 75 min a 37 ° C.
- Filtro digerito tessuto attraverso un colino cella 100 micron su una provetta conica da 50 ml. Filtro Sciacquare con 5 ml di tampone FACS per lavare tutte le cellule rimanenti. Spin a 280 xg per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet.
- Diluire 1 ml di brodo RBC tampone di lisi (10x) in 9 ml di acqua sterile. Lisare globuli rossi con 10 ml di tampone di lisi (1x), e subito girare 5 min a 280 x g. Nota: Questo passaggio può essere saltato se po 'di sangue è visibile.
- Risospendere in 10 ml di tampone FACS. Miscelare 10 ml di sospensione cellulare con 10 ml di trypan blu, e contare le cellule vive con un emocitometro.
- Risospendere le cellule a ~ 10 7 cellule / 100 ml. Aggiungere 10 ml di FcR blocco per 100 ml di sospensione cellulare e incubare in ghiaccio per 10 min.
- Aggiungere anticorpi CD31 ratto anti topo PE coniugato secondo. alla Tabella 1 Incubare in ghiaccio per 10-15 minuti e tubo flick di tanto in tanto.
- Aggiungere 10 ml di tampone FACS al tubo e girare a 280 xg per 5 minuti. Rimuovere con attenzione il surnatante, e lavare il pellet cellulare nuovo con 5 ml di tampone FACS. Centrifuga a pellet cellule. Aspirare il surnatante senza pellet inquietante.
- Aggiungere FACS tampone e anti-PE microsfere secondo la Tabella 2 Incubare in ghiaccio per 10 -. 15 min. Flick tubo di tanto in tanto.
- Aggiungere 10 ml di FACS tampone e di spin campioni a 280 xg per 5 minuti; Risciacquare una volta con 5 ml di tampone FACS e centrifugare nuovamente. Aspirare il surnatante senza disturbare pellet.
- Portare il volume a 300 ml in tampone FACS. Spin attraverso 35 micron cellula-filtro ricoperto tubo 5 min a 280 x g. Utilizzare 2 tubi e un volume maggiore, se necessario.
- Impostare multistand magnetica e colonne magnetici in cappuccio, collegare una colonna al separatore ed equilibrare la colonna con 2 ml di tampone FACS.
- Aspirate il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 - 1 ml di tampone FACS.
- Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna magnetica equilibrata.
- Lavare la colonna tre volte con 2 ml di tampone FACS, e raccogliere flow-through (FT) in un tubo di 15 ml (frazione FT).
- Prendere colonna fuori il separatore ed eluire con 2 ml di tampone FACS in un altro tubo 15 ml (frazione di eluato). Utilizzare stantuffo per garantire tutte le cellule sono fuori dalla colonna. Ripetere la eluizione altre due volte con 2 ml di tampone FACS ogni volta.
- Spin l'eluato a 280 xg per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di media CE.
- Altrettanto dividere la frazione di eluato (~ 6 ml) in 10 piatti cm rivestiti di gelatina. Per tre 1 cm 3 tumori, le cellule piastra eluita in almeno quattro piatti. Cellule alternativa, piatto eluito a diverse concentrazioni in più lastre (ad es., Seminare 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml e 3 ml di eluato in quattro piatti) per garantire che unat almeno una piastra è scarsamente seminato con le cellule eluite. Verificare che la confluenza delle cellule attaccate è ~ 1% il giorno dopo (cioè, circa 1,0 - 2,0 x 10 5 cellule allegate).
Nota: le cellule devono essere placcato sparso in modo che le colonie CE possono formarsi senza essere contaminato da altri tipi di cellule. - Piastra frazione FT in un piatto 10 centimetri di lasciare le cellule recuperare O / N. Controllare che il piatto è 80-100% confluenti il giorno successivo. Congelare le cellule (-80 ° C) a 250 supporti cellulari congelamento microlitri in un cryotube e conservarli in azoto liquido il giorno successivo. Nota: frazione FT può essere utilizzato per l'isolamento delle cellule tumorali in una fase successiva e / o come controllo negativo per l'analisi di espressione genica CE dei cloni isolati CE.
- Modificare i media ogni 2 - 3 giorni. Colonies cominciano a formarsi dopo 7 - 10 giorni. Colonie piccole CE possono essere individuati prima giornata 3. Mark le colonie con un pennarello fine punta sul fondo del piatto.
- Raschiare non specifico cells circondano le colonie identificate con una sterile, punta Pippet 200 microlitri.
3. Colony selezione Anelli Usare Clonazione
- Modificare i media ogni 2 - 3 giorni. Purezza CE può essere controllato da LDL (DII-Ac-LDL), oltre a circa 5-7 giorni. Aggiungere 50 ml di LDL per 10 ml di mezzo CE e incubare per 3-4 ore prima di controllare le cellule al microscopio a fluorescenza.
Nota: Multiple LDL + cloni CE possono essere osservati a ~ 7 giorni. - Inizia la raccolta colonie CE quando raggiungono diametri di 3 - 5 mm di dimensione. (Scegliere grandi colonie che sono pieni di piccoli LDL + cellule per ottenere i migliori risultati.)
- Prima della raccolta CE con anelli di clonazione, pre-coat alcune 6 pozzetti con 0,5% di gelatina. Aspirare gelatina, aggiungere 2 ml di media CE per ogni bene, e tenere le piastre in un incubatore fino al momento.
- Raschiare non CE sui bordi delle colonie per assicurarsi che non altri tipi di cellule saranno intrappolati all'interno dell'anello clonazione.
- Utilizzando unmicroscopio a contrasto di fase (4X o 10X obiettivo), contorno con un pennarello fine-tip sul fondo del piatto cultura delle aree contenenti colonie CE.
- Lavare la piastra con 10 ml di PBS e lasciare uno strato molto sottile di PBS nella piastra durante l'aspirazione. (Importante: una piccola quantità (~ 0,5 ml) di PBS manterrà cellule vive durante la procedura di clonazione-ring, anche, tessuto adesivo ha bisogno di acqua per legare.)
- Scegliere un anello di clonazione di dimensioni adeguate. Utilizzare un paio di dissettore a prendere un anello, e con una punta di pipetta 10 microlitri uniformemente applicare una piccola quantità di tessuto adesivo sull'anello clonazione.
Nota: utilizzare solo minima quantità (~ 0,2 microlitri per un piccolo anello) di tessuto adesivo su anelli di clonazione, e assicurarsi che il tessuto adesivo è distribuito in modo uniforme intorno alla superficie di fondo per garantire una buona tenuta. Tessuto adesivo eccessivo produce calore e forma film che possono uccidere le cellule. - Posizionare l'anello di clonazione sopra la colonia CE. Premere delicatamente verso il basso l'anello di clonazione per incollare i ring sul piatto. Assicurarsi che le colonie non sono asciugato prima di incollare l'anello.
- Immediatamente pipettare 25 ml di soluzione di distacco delle cellule enzimatica sul ring clonazione e incubare ~ 1 min o fino a quando le cellule sono vagamente collegati.
- Cellule pipetta sul ring clonazione goccia a goccia in un pozzetto di un 6-pozzetti contenenti supporti CE pre-riscaldato. (Importante: Non agitare la piastra per disperdere le cellule, CE preferiscono crescere in ammassi stretti.) Lavare l'anello di clonazione con 50 - 100 supporti CE microlitri di raccogliere il maggior numero di cellule possibile e trasferire tutti i lavaggi nello stesso 6-bene .
- Se alcune colonie nel piatto 10 centimetri sono troppo piccoli per raccogliere, aggiungere 10 ml di mezzi freschi, lasciare che le colonie crescono per qualche giorno in più, e ripetere la procedura di clonazione anello.
- Crescere colonie raccolte in 6 pozzetti fino a 80-100% confluenti, e il trasferimento di cellule a 3 pozzetti di una 6-pozzetti, prima di espandersi in un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Raschiare le cellule contaminanti. Ripetereun altro giro di procedura anello clonazione (i passaggi 3,5-3,10) se necessario. Mantenere le cellule relativamente confluenti (~ 60 - 70%) durante l'espansione. CE può smettere di crescere se placcato troppo scarsa.
- Caratterizzare CE da FACS, la colorazione, la PCR, ecc Si noti che Dil-Ac-LDL è fluorescente e può interferire con PE o altri anticorpi fluorescenti per FACS.
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Representative Results
CE rappresentano soltanto una frazione minore della popolazione cellulare totale nella maggior parte dei tessuti adulti 11. È quindi importante digerire completamente il tessuto raccolto in una cella singola sospensione che assicura il rilascio massimo CE da matrice extracellulare (ECM) e dei tessuti connettivi. Nella nostra esperienza, la selezione immunomagnetica CD31-mediata prevede solo arricchite, ma non puri frazioni CE; Pertanto, un altro passo fondamentale è la rimozione fisica di co-purificata non CE e selezione / espansione di colonie CE utilizzando anelli di clonazione (Figura 1). Ad esempio, quando CD31 arricchita CE sono state placcato senza ulteriore selezione colonia, non CE rapidamente moltiplicate e mescolate con CE, producendo culture CE impuri come rivelato da Dil-Ac-LDL + e DII-AC-LDL - popolazioni (Figura 2A) . Tuttavia, quando eluati colonna sono stati placcati a bassa densità, le colonie CE sono cresciuti con relativamente pochi circostante non CE, che sono stati rimossi da scviolentare con una punta di pipetta (Figura 2B). La crescita e la purezza delle colonie espansi possono essere ulteriormente controllati mediante aggiunta di Dil-Ac-LDL. Colonie piccole CE possono essere osservati a ~ sette giorni dopo CD31-mediata colonna arricchimento (Figura 2B, pannelli superiori). Dopo la selezione e l'espansione delle colonie della CE, Dil-Ac-LDL - le cellule vengono eliminate, e la popolazione cellulare è altamente puro per Dil-Ac-LDL + CE, come indicato dal Dil-Ac-LDL assorbimento (Figura 2B, pannelli inferiori).
Per verificare se il metodo di isolamento in grado di produrre risultati coerenti, più cloni derivati da entrambi i tumori mammari asportati da C3-tag (FVB / N C3 1 -tag) topi o normali ghiandole mammarie di topi wild-type FVB pari età sono stati isolate ed espanse 12. La purezza di ogni TEC e normale (NEC) Popolazione CE è stata poi accuratamente caratterizzata per garantire la purezza. Citometria a flusso analisi di tre campioni indipendenti hanno mostrato un unico, UniforCD31 + med popolazione che era distinta dai controlli isotipici IgG (Figura 3A). L'espressione di mRNA di marcatori CE, tra CD31, Cdh5 (VE-caderina), CD133, e VEGFR2 in tutte le quattro cloni CE testato era ~ 200 a 7000 volte superiore a quella di fibroblasti embrionali di topo (MEF) che è stato usato come controllo negativo (Figura 3B). Come previsto, tutti i cloni CE espressi livelli quasi non rilevabili di geni marcatori mesenchimali COL1A1 e Tagln rispetto al MEF. Immunofluorescenza hanno dimostrato che tutte le cellule di un clone TEC rappresentante erano CD31 + uniformemente (Figura 3C). Inoltre, questi cloni comunitari sono stati in grado di formare strutture vasi simili spontanee in vitro, indicando che mantengono le funzioni endoteliali dopo coltura (Figura 3D).
Il metodo di isolamento è stato ulteriormente convalidato utilizzando Cdh5 cre: ZsGreen
Figura 1. Flow Chart e Panoramica sulla procedura di isolamento CE.
Figura 2. Dil-Ac-LDL Distingue CE da contaminanti non CE in Culture Live. Contrasto (A) Fase e immagini fluorescenti mostrano CE e co-isolato non CE senza selezione clonazione-anello di colonie CE. (B) contrasto di fase e le immagini fluorescenti di colonie CE in diverse fasi di isolamento. Le linee tratteggiate segnano la boundaries di Dil-Ac-LDL + EC e cellule contaminanti circostanti. Frecce bianche indicano non CE fuori una colonia CE che deve essere rimosso con un puntale. Barre di scala rappresentano il 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. clonazione Anelli e rimozione fisica di non CE Produce colture pure e funzionali a lungo termine della CE. (A) FACS Rappresentante punteggiano appezzamenti di CD31 colorazione di diversi cloni CE. Sono mostrati tre campioni rappresentativi. Il rettangolo nero aperto in ogni appezzamento delinea la popolazione CD31 +. Un isotipo IgG è usato come controllo negativo. (B) Misura dell'espressione genica endoteliale selezionati NEC e TEC cloni. I livelli di mRNA di endothelgeni IAL CD31, CD133, Cdh5 e VEGFR2 sono espressi rispetto a quelli dei fibroblasti embrionali di topo (MEF), ed i livelli di mRNA dei geni mesenchimali COL1A1 e Tagln sono espressi rispetto a quelli di NEC-1. (C) Rappresentante immunofluorescenza di un clone TEC espanso. CD31 viene evidenziato in verde e nuclei sono macchiati blu con 4'6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI). (D) Immagini rappresentative della formazione del tubo di diversi cloni CE placcato su Matrigel. Barre di scala rappresentano il 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. CE Isolato da Cdh5 cre: ZsGreen
| Numero di cellulare | Tampone FACS (ml) | CD31-PE anticorpi (ml) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
Tabella 1. Volumi Anti-CD31 Anticorpo PE-coniugato necessarie nelle diverse numero di cellule.
| Numero di cellulare | Tampone FACS (ml) | Anti-PE microsfere magnetiche (ml) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
Tabella 2. I volumi di Anti-PE microperla necessarie nelle diverse numero di cellule.
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Discussion
A causa delle difficoltà di ottenere colture TEC primaria pure, molti studi in vitro TCE sostituto con le linee disponibili in commercio CE o primaria CE, come vena ombelicale umano CE (HUVEC) 13. Tuttavia, queste popolazioni CE dai tessuti normali possono servire solo come un proxy per TEC che si differenziano nettamente dalle loro controparti normali. Ad esempio, TEC sono fenotipicamente e funzionalmente anormale in vivo e alcune di queste anomalie può essere trasmissibile in vitro 14-18. TEC ha aberranti crescita, migratori, e capacità di differenziazione e può fondersi con le cellule CD31 + tumorali di formare strutture di navi simili a 16,19,20. Gli studi che utilizzano sia TEC o catturare laser vasi tumorali micro-sezionato in coltura hanno dimostrato che la TEC si discostano dal normale CE espressione genica, citogenetica, e profili epigenetici 12,18,21-23. Nonostante approfondire la nostra comprensione di angiogenesi tumorale negli ultimipochi decenni, pochissimi studi funzionali e meccanicistici utilizzando colta TEC primaria sono disponibili.
CE sono stati isolati dalle vene ombelicale umano nei primi anni del 1970 24. Isolamento e la successiva coltura di microvascolare CE da altri tessuti umani e di topo ha fornito un potente strumento per studiare le funzioni endoteliali sia in salute e malattia 25-28. La maggior parte dei protocolli di isolamento CE prevedono tre fasi principali: l'ottenimento di una cella singola sospensione dopo dissociazione meccanica o digestione enzimatica, etichettatura CE con un anticorpo specifico per endoteliale che è coniugato, o un fluoroforo o magnetici microsfere, e arricchendo la popolazione CE mediante separazione delle cellule o colonne magnetiche. Tuttavia, l'isolamento di topo CE, in particolare da tumori, è dimostrato difficile a causa della bassa resa di vitale CE e frequente contaminazione di altri tipi di cellule tumorali comprese le cellule e fibroblasti. Inoltre, in vitro fenotipica deriva della CE in mecellule senchymal-like (endotelio-a-mesenchimale transizione, EndMT) rappresenta una sfida aggiuntiva per la coltura a lungo termine della CE da tessuti normali, tumori, e precursori riprogrammate.
La sfida maggiore durante l'isolamento TEC è la contaminazione da parte delle cellule tumorali, che possono facilmente outcompete i più lenta crescita colonie CE che compaiono in genere dopo ~ 7 - 10 giorni in cultura. Inoltre, un marcatore di selezione comunemente usato per isolare CE è CD31 che è abbondantemente espresso nell'endotelio ma segna anche cellule ematopoietiche e in alcuni casi sottopopolazioni di cellule tumorali 20,30. Inoltre, arricchendo per CE, selezione della colonna immunomagnetica CD31-mediata non può rimuovere ogni singola cellula contaminazione che può eventualmente assumere culture comunitarie, dopo alcuni passaggi. Con l'aggiunta di un passo clonazione anello, uno è in grado di selezionare ed espandere popolazioni pure clonale derivati CE che sono privi di questi tipi di cellule contaminanti. Una seconda sfida è il principale a lungo terminemanutenzione di puro CE senza promozione EndMT. EndMT verifica durante lo sviluppo, può essere riassunta durante disfunzione vascolare, ed è comune in coltura CE (soprattutto in presenza di TGFβ) 31-33. Per minimizzare EndMT, rimuovere le cellule contaminanti che possono agire come fonte TGFβ, tenere colture ad alte densità, e mantenere elevate concentrazioni di bFGF in media in ogni momento. Come abbiamo mostrato di recente, bFGF è essenziale per preservare le specifiche CE, in quanto espressione antagonizza TGFβ-driven di actina muscolo liscio (un marcatore EndMT) 34.
Usando questa metodologia, l'isolamento di EC da un topo giornalista "destino mappato" è stato anche mostrato. Questi topi sono particolarmente utili negli studi in cui l'imaging intravitale è necessario 35. Anche se alcuni etichettatura delle cellule ematopoietiche si può verificare nel cre Cdh5: ZsGreen l / s / l topi utilizzati qui, questo modello offre un metodo relativamente rapido e facile per la generazione di influenzaorescent CE in vivo. Un modello alternativo lignaggio etichettatura CE è un mouse tamoxifene-inducibile (Cdh5 cre / ERT2) incrociata con un ceppo di topi giornalista floxed (ZsGreen l / s / l) che avrà CE fedelmente e irreversibilmente segnata 36,37 . Fluorescente CE dai topi CRE inducibile può anche essere purificato mediante FACS o utilizzando la metodologia che descriviamo qui.
CE sono eterogenei attraverso diversi letti vascolari e "intra-nave" eterogeneità può anche esistere tra CE all'interno della stessa nave 38,39. Inoltre, una gerarchia di CE con differente potenziale proliferativo è stato osservato nelle popolazioni CE isolati dalle vene, e una piccola frazione di clonale CE possono essere diversi passaggi oltre 40 popolazione raddoppi 40. Pertanto, le limitazioni del metodo descritto qui includono: 1) eventuale selezione di questi altamente proliferative CE residente nella parete del vaso; e 2) l'arricchimento di una sola specific sottotipo vascolare derivato da arterie, vene, o capillari, che può produrre cloni che non rappresentano completamente la popolazione totale CE in vivo. Tuttavia, come più sottopopolazioni clonali possono essere ottenuti da una procedura di isolamento, questo metodo può essere utile per analisi funzionali e genetici di eterogeneità CE che esiste all'interno tumori e altri tessuti 12. Nel loro insieme, qui descritto è un metodo di isolamento CE che produce colonie pure CE privi di contaminazione non CE. Le cellule isolate dovrebbero essere utili per gli studi in vitro funzionali, tutto il genoma profilo di espressione, e la caratterizzazione molecolare di nuovi percorsi che controllano l'angiogenesi tumorale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
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