Abstract
תאי גידול ספציפי מבודדים טרי אנדותל (TEC) יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה גידול ולשמש כמודל במבחנה לפיתוח מעכבי אנגיוגנזה חדשים לטיפול בסרטן. עם זאת, לטווח ארוך בהרחבת מבחנה של תאי האנדותל עכברי (EC) הוא מאתגר עקב סחיפה פנוטיפי בתרבות (מעבר אנדותל לmesenchymal) וזיהום עם לא-אירופי. זה נכון במיוחד עבור TEC הoutcompeted בקלות על ידי fibroblasts-מטוהר שיתוף או תאים סרטניים בתרבות. הנה, שיטת בידוד איכות גבוהה שמנצלת העשרת immunomagnetic בשילוב עם מבחר מושבה ובהרחבת מבחנה מתוארת. גישה זו יוצרת שברי EC טהורים שהם חופשיים לחלוטין של זיהום תאי סטרומה או גידול. כמו כן הוא הראה שcre Cdh5-לייחס שושלת: העכברים / ליטר ZsGreen s / l כתב, בשימוש עם הפרוטוקול מתואר במסמך זה, הינו כלי רב ערך כדי לוודא תאטוהר כמושבות EC המבודדות מעכברים אלה מראה הקרינה ZsGreen עמידה ומבריקה בתרבות.
Introduction
תאי האנדותל (EC) הם חיוניים במהלך הפיתוח של גידולים מוצקים. מייזום מתג angiogenic בגידולים רדומים להפצה וזריעה של גרורות באתרים מרוחקים, EC ליצור צינורות המספקים דם, חמצן וחומרים מזינים כדי לקיים את צמיחת גידול 1. כפי שהוצע לאחרונה, EC יש גם פונקציות זלוף-עצמאי ויוצר נישה שתומכת בצמיחה של תאי גזע סרטני ותאי סטרומה גידול אחרים 2-5. לפיכך, מטוהר ביותר גידול ספציפי EC (TEC) לתרבות במבחנה מאפשר ללימודים תפקודיים שיגרתי שישפוך אור על מנגנונים מולקולריים רומן תיווך אנגיוגנזה גידול ולדבר לחצות עם תאים סרטניים.
EC הם מאוד מיוחדים בהתאם לרקמת המוצא 6. בשל האופי הטרוגני סוגים שונים של גידול ומייקרו-הסביבה של הגידול, TEC יכול גם להציג תכונות ייחודיות המשקפות את גידול o התמחות ספציפיו בכלי הדם. לדוגמא, יש שונות בולטות בחתימות ביטוי גנים בTEC מבודדות מסוגים או ציונים של גידולי 7,8 שונים. עם זאת, שיתוף טיהור תכופה של אי-EC, במיוחד fibroblasts הקשורים גידול ותאים סרטניים, עם TEC יכולה לבלבל ביטוי הגנום מנתח. סוגי התאים לא רצויים אלה הם בעייתיים במיוחד במחקרים המסתמכים על טווח ארוך בהרחבת מבחנה של תרבויות TEC.
שתואר כאן היא שיטה באיכות גבוהה שמייצרת באופן עקבי תרבויות EC טהורות מגידולים ורקמות אחרות. בעקבות העשרת עמודת immunomagnetic של שברים EC והסרת מטוהר שיתוף הלא-EC, צעד שיבוט-טבעת נוספת כדי ללכוד מושבות EC טהורות משמשת 9. כל מושבה ניתן להרחיב בתרבות לקטעים מרובים ללא ההופעה של זיהום שאינו EC. שיטה זו גם תשואות שיבוטים EC מרובים מהליך בידוד יחיד, שהוא אידיאלי ללימוד אנדוההטרוגניות thelial. בנוסף, הוא הראה כי cre Cdh5: עכברי הכתב / L / L ZsGreen שלהם כלי רב ערך ליצירת EC "ממופה גורל" ובל יימחו-מסומן אשר לשמור על הקרינה ZsGreen בתרבות 10. עם התאמות קלות לפרוטוקול, שיטה זו צריכה להיות להתאמה לסוגי גידולים שונים או רקמות נורמליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הבא מתבצע על פי הנחיות שנקבעו על ידי המחלקה לבעלי חיים במעבדה לרפואה באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.
1. מכין את החומר וריאגנטים הבאים לפני שמתחיל
- הכן תקשורת EC על ידי השלמה הנמוך גלוקוז 400 מיליליטר השתנה בינוני של הנשר (DMEM) עם 50 מיליליטר סרום חום מומת שור עוברי, 50 מיליליטר נו-סרום IV, 5 מיליליטר אנטיביוטיקה antimycotic, (ז 1 / D-גלוקוז או L LG) של Dulbecco וhFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, ורכיבי הפרין מהערכה המסחרית.
- הכן חיץ 500 מיליליטר FACS (BSA 0.5% ו- 2 mM EDTA ב PBS); לסנן באמצעות כוס סינון סטרילי 0.22 מיקרומטר.
- לעקר או לחטא לנתח לוח.
- לעקר סיכות לנתיחה, מספריים כירורגיות, ומבתרים.
2. בידוד EC (יום 1, ~ שעה 5)
- להרדים עכבר עם פחמן דו חמצני או בשיטות אחרות שנינות תואמותמדיניות h ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC).
הערה: גידולי החלב מרובים משתנים בגודלם (5 - 15 מ"מ קוטר) עלולים לפתח בעכבר מהונדס גנטי בודד כגון C3-תג, כדי להיות בטוח לקצור את כולם לבידוד TEC. אם משתמשים בגידולי הengrafted orthotopically בעכברים, בריכה שתיים עד שלוש 1 סנטימטר 3 גידולים לבידוד EC יחיד. כאן אנו משתמשים גידולי החלב כהפגנה, אבל הפרוטוקול יכול להיות שונה עבור סוגים אחרים של גידולים. - לחטא עכבר על ידי ריסוס או לנגב את צד הגחון העכבר עם כמות גדולה של אתנול 75% V / V.
- לכרות גידולים עם זוג אחד של מספריים ומבתרים תוך שימוש בטכניקות אספטיים במנדף סטרילי או בספסל נקי.
- להשתרע ולהצמיד את הגפיים של העכברים על לוח לנתח. לעשות חתך הגחון קו האמצע עם המספריים מבלי לפתוח את הצפק. לנתח רוחבי בין העור והצפק לבלוטות החלב שבו גידולים ממוקמים.אל תפתח את הצפק.
- בלו רק רקמת גידול מבלוטות החלב, ומשאיר את שוליים החלב רגילים. לקצץ בזהירות את רקמות שאינן סרטניים כגון עור ושרירים, ולמקם את הגידולים גזור בצינור חרוטי המכילים 30 מיליליטר של LG-DMEM על קרח.
- להביא דגימות גידול למכסה מנוע תרבית רקמה; לשטוף רקמות עם LG-DMEM סטרילי 1 - 2 פעמים.
- העברת גידולים מצינור חרוטי לצלחת פטרי רקמות תרבות סטרילי, להוסיף 2 מיליליטר של LG-DMEM בצלחת, ובררו עם זוג המספריים סטרילי לחתיכות <5 מ"מ.
- הוסף 5 מיליליטר של collagenase (מניות = 2 מ"ג / מיליליטר במאוזן מלח הפתרון של האנק, להלן HBSS), 1 מיליליטר של dispase (מניות = 2.5 U / ml בHBSS) ו -75 μl של deoxyribonuclease (מניות = 1 מ"ג / מיליליטר PBS ) לצלחת פטרי. נפח כולל הוא עכשיו ~ 10 מיליליטר.
- העבר את תערובת collagenase / רקמות מצלחת פטרי לצינור רקמות Dissociator ולרוץ על Dissociator רקמה למשך 60 שניות פעמיים (שנקבע מראש ניתוק יחסי הציבורogram על Dissociator: 1,270 סיבובים הכולל להפעלה). דגירה עם אור רועד על שייקר במשך 75 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- מסנן מתעכל רקמת דרך מסננת תא 100 מיקרומטר על צינור חרוטי 50 מיליליטר. מסנן לשטוף עם 5 מיליליטר של חיץ FACS לשטוף את כל תאים שנותרו. ספין ב 280 XG במשך 5 דקות ולשאוב supernatant בזהירות מבלי להפריע תא גלולה.
- לדלל 1 מיליליטר של חיץ מניית RBC תמוגה (10x) ב 9 מיליליטר של מים סטריליים. תאי דם אדום Lyse עם 10 מיליליטר של חיץ תמוגה (1x), ומייד ספין 5 דקות ב 280 x גרם. הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם הדם קטן גלוי.
- Resuspend ב 10 מיליליטר של חיץ FACS. מערבבים 10 μl של השעיה תא עם 10 μl של trypan כחול, ולספור תאי חיים באמצעות hemocytometer.
- Resuspend תאים ב ~ 10 7 תאים / μl 100. הוסף 10 μl של בלוק FCR להשעית תא 100 μl, דגירה על קרח למשך 10 דקות.
- הוסף נוגדן CD31 עכברוש אנטי עכבר PE-מצומדות פי. לטבלת 1 לדגור על קרח במשך 10 - 15 דקות וצינור קפיצי מדי פעם.
- להוסיף 10 מיליליטר של חיץ FACS לצינור והספין ב 280 XG במשך 5 דקות. מוציא בזהירות את supernatant, ולשטוף את התא גלולה שוב עם 5 מיליליטר של חיץ FACS. צנטריפוגה לגלולת תאים. לשאוב supernatant ללא תא גלולה מטריד.
- להוסיף microbeads חיץ ואנטי-PE FACS לפי טבלה 2 לדגור על קרח במשך 10 -. 15 דקות. צינור קפיצי מדי פעם.
- להוסיף 10 מיליליטר של דגימות חיץ וספין FACS ב 280 XG במשך 5 דקות; לשטוף פעם אחת עם 5 מיליליטר של חיץ FACS ו צנטריפוגות שוב. לשאוב supernatant בלי גלולה מטרידה.
- תביא נפח 300 μl במאגר FACS. ספין באמצעות 35 דקות צינור 5 כתרים מיקרומטר תא-מסננת ב 280 x גרם. השתמש 2 צינורות ונפח גדול יותר במידת צורך.
- הגדרת multistand מגנטי ועמודות מגנטיות במכסת מנוע, לצרף לעמודה מפרידה ולאזן את העמודה עם 2 מיליליטר של חיץ FACS.
- Aspiratדואר supernatant ו resuspend התא גלולה ב0.5-1 מיליליטר של חיץ FACS.
- להעביר את ההשעיה התא דרך העמודה המגנטית equilibrated.
- לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS, ולאסוף זרימה דרך (FT) בצינור 15 מיליליטר (חלק FT).
- קח את הטור את המפריד וelute עם 2 מיליליטר של חיץ FACS לעוד 15 צינור מיליליטר (חלק eluate). השתמש בוכנה כדי להבטיח את כל התאים מהטור. חזור על elution עוד פעמיים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS בכל פעם.
- ספין eluate ב 280 XG במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של תקשורת EC.
- באותה מידה לחלק את חלק eluate (~ 6 מיליליטר) לתוך מנות ג'לטין מצופה 10 סנטימטר. במשך שלושה 1 סנטימטר 3 גידולים, צלחת eluted תאים בלפחות ארבע צלחות. תאים לחלופין, צלחת eluted בריכוזים שונים בצלחות מרובות (לדוגמא., זרע 0.5 מיליליטר, 1 מיליליטר, 1.5 מיליליטר, ו -3 מיליליטר של eluate לארבע צלחות) כדי להבטיח שצלחת לא לפחות אחד זרע בדלילות עם תאי eluted. בדוק שconfluency של התאים המצורפים הוא ב~ 1% ביום שלמחרת (כלומר, 1.0 כ - 2.0 X 10 5 תאים מצורפים).
הערה: התאים צריכים להיות מצופים דליל כך שמושבות EC יכולות ליצור מבלי שזוהמה על ידי סוגי תאים אחרים. - צלחת שבריר FT בצלחת 10 סנטימטר אחד כדי לאפשר לתאים להתאושש O / N. בדוק שהצלחת היא 80 - 100% ומחוברות למחרת. להקפיא את התאים (-80 ° C) בתקשורת 250 μl הקפאת תאים בcryotube ולאחסן אותם בחנקן נוזלי למחרת. הערה: חלק FT יכול לשמש לבידוד תאים סרטניים בשלב מאוחר יותר ו / או כביקורת שלילית לניתוח ביטוי גני EC של השיבוטים EC המבודדים.
- לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. מושבות מתחילות טופס לאחר 7 - 10 ימים. ניתן לזהות מושבות EC קטנות כבר ביום 3. מארק המושבות עם סמן עדין קצה בתחתית הצלחת.
- לגרד ג אינו ספציפיאמות המקיפות את המושבות המזוהות עם קצה pippet 200 μl סטרילי.
3. טבעות שיבוט שימוש מושבה בחירה
- לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. טוהר EC ניתן לבדוק על ידי ה- LDL (DiI-AC-LDL) בנוסף על כ 5 - 7 ימים. הוסף 50 μl של LDL לכל 10 מיליליטר בינוני EC ודגירה של 3 - 4 שעות לפני בדיקת התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: LDL מרובה + השיבוטים EC יכול להיבחן ב~ יום 7. - התחל קצירת מושבות EC, כאשר הם מגיעים בקטרים של 3 - 5 מ"מ בגודל. (בחר מושבות גדולות כי הם ארוזים עם LDL תאים + קטנים לתוצאות הטובות ביותר.)
- לפני קצירת EC עם טבעות שיבוט, מראש מעיל כמה 6-גם צלחות עם ג'לטין 0.5%. ג'לטין לשאוב, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת EC היטב כל אחד, ולשמור על הצלחות בחממה עד צורך.
- לגרד את הלא-EC בשולי המושבות כדי לוודא שאין סוגי תאים אחרים יהיה לכוד בתוך טבעת השיבוט.
- שימושמיקרוסקופ שלב בניגוד (אובייקטיבי 4X או 10X), מתאר בסמן עדין קצה בתחתית צלחת תרבות האזורים המכילים מושבות EC.
- לשטוף את הצלחת עם 10 מיליליטר של PBS ולהשאיר שכבה דקה מאוד של PBS בצלחת כאשר aspirating. (חשובה: כמות קטנה (~ 0.5 מיליליטר) של PBS ישמור תאי חיים במהלך הליך שיבוט-טבעת; גם, דבק רקמות זקוק למים כדי להתחבר.)
- בחר טבעת שיבוט של גודל מתאים. השתמש זוג המלקחיים לנתח להרים טבעת, ועם קצה pipet 10 μl באופן שווה להחיל כמות קטנה של דבק רקמות על טבעת השיבוט.
הערה: השתמש רק בסכום מינימאלי (~ 0.2 μl לטבעת קטנה) של דבק רקמות על טבעות שיבוט, ולהפוך את דבק רקמות בטוח פרוש באופן שווה סביב המשטח התחתון, כדי להבטיח אטימה טובה. דבק רקמות מוגזם מייצר חום ויוצר סרטים שעלולות להרוג את התאים. - מניחים את הטבעת על שיבוט המושבה EC. לחץ בעדינות את טבעת השיבוט להדביק ריng לצלחת. ודא שהמושבות לא התייבשו לפני הדבקת הטבעת.
- מייד pipet 25 μl של פתרון ניתוק תא האנזימטית לזירת שיבוט דגירה דקות ~ 1 או עד שהתאים מחוברים באופן רופף.
- תאי Pipet בטבעת שיבוט ירידה מבחינת לתוך היטב אחד של צלחת 6 היטב המכילה תקשורת EC המחוממת מראש. (חשוב: אין לטלטל את הצלחת לפזר תאים; EC מעדיף לגדול באשכולות צפופים.) שטוף את טבעת השיבוט עם 50-100 תקשורת EC μl לאסוף תאים רבים ככל האפשר, ולהעביר את כל שטיפות לתוך אותו 6-גם .
- אם כמה מושבות בצלחת 10 סנטימטר קטנות מדי כדי לקצור, להוסיף 10 מיליליטר תקשורת טרי, תן לגדול המושבות לעוד כמה ימים, ולחזור על התהליך שוב טבעת השיבוט.
- לגדול מושבות שנקטפו ב6-גם צלחות עד 80 - ומחוברות 100%, והעברת תאים עד 3 בארות של צלחת 6 היטב, לפני הרחבתם בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. לגרד את תאים מזהמים. חזורסיבוב של הליך טבעת שיבוט אחר (שלבי 3.5-3.10) במידת צורך. שמור את התאים יחסית מחוברות (~ 60 - 70%), כאשר הרחבת. EC יכול להפסיק לגדול אם מצופה דליל מדי.
- לאפיין EC על ידי FACS, צביעה, PCR, וכו 'שים לב שדיל-AC-LDL הוא ניאון ועלול להפריע לPE או נוגדני ניאון אחרים לFACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EC מייצג רק קטין חלק מכלל אוכלוסיית התא ברוב הרקמות בוגרות 11. לכן חשוב לעיכול הרקמה שנקטפו במלואו לתוך השעיה תא בודד שמבטיחה את השחרור המקסימאלי של EC ממטריצה תאית (ECM) ורקמות חיבור. מניסיוננו, בחירת immunomagnetic תיווך CD31 מספקת רק שברי EC מועשר אבל לא טהורים; לכן, עוד צעד מכריע היא ההסרה הפיסית של אי-EC-מטוהר שיתוף ובחירה / הרחבה של מושבות EC באמצעות טבעות שיבוט (איור 1). לדוגמא, כאשר CD31 מועשר EC היו מצופים ללא בחירת מושבה נוספת, במהירות התרבו והתערבב עם EC, הפקת תרבויות EC טמאות כפי שנחשף על ידי + דיל-AC-LDL וDiI-AC-LDL אינו EC - אוכלוסיות (איור 2 א) . עם זאת, כאשר eluates הטור היו מצופים בצפיפות נמוכה, מושבות EC גדלו עם יחסית מעט אי-EC שמסביב, אשר הוסרו על ידי scאונס עם קצה pipet (איור 2). הצמיחה והטוהר של המושבות המורחבות יכולים להיות במעקב עוד יותר על ידי תוספת של דיל-AC-LDL. יכולות להיות שנצפו מושבות EC קטנות ב ~ יום אחרי שבע העשרת טור תיווך CD31 (איור 2, לוחות העליונים). לאחר בחירה והרחבת מושבות EC, דיל-AC-LDL - תאים בוטלו, ואוכלוסיית התא היא טהורה ביותר לדיל-AC-LDL + EC כפי שצוין על ידי ספיגת דיל-AC-LDL (איור 2, לוחות למטה).
כדי לבדוק אם שיטת הבידוד יכולה לייצר תוצאות עקביות, שיבוטים מרובים נובעים משני גידולי החלב כריתה מC3-תג (FVB / N C3 1 -TAg) עכברים או בלוטות החלב נורמליות מעכברי FVB wild-type באותו גיל היו מבודדים והרחיבו 12. טוהר של כל TEC ואוכלוסייה רגילה EC (NEC) היה אז מאופיין בקפידה כדי להבטיח טוהר. Cytometry זרימה ניתוח של שלושה מדגמים בלתי תלויים הראתה יחידה, מדיםCD31 Med + אוכלוסייה שהיה שונה מבקרות אלוטיפ IgG (איור 3 א). ביטוי mRNA של סמני EC, כולל CD31, Cdh5 (VE-cadherin), CD133, וVEGFR2 בכל ארבעת השיבוטים EC נבדק היה גבוה יותר ~ 200 ל -7,000 פעמים יותר מזה של fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) ששימש כביקורת שלילית (איור 3). כצפוי, כל השיבוטים EC הביעו רמות כמעט בלתי ניתנות לגילוי של גני סמן mesenchymal Col1a1 וTagln בהשוואה לMEFs. מכתים Immunofluorescent הראה כי כל התאים בשיבוט TEC נציג היו CD31 אחיד + (איור 3 ג). יתר על כן, השיבוטים EC אלה היו מסוגלים ליצור מבנים כמו כלי-ספונטניים במבחנה, המציין שהם שומרים פונקציות אנדותל לאחר culturing (איור 3D).
שיטת הבידוד קבלה תוקף נוסף באמצעות Cre Cdh5: ZsGreen
איור 1. תרשים זרימה וסקירה כללי של הליך בידוד EC.
איור 2. דיל-AC-LDL הבדלת EC זיהום ללא בר בתרבויות בשידור חי. בניגוד שלב () ותמונות ניאון מראים EC ואינו EC ללא בחירת שיבוט-טבעת של מושבות EC-מבודד שיתוף. לעומת (ב) שלב ותמונות ניאון של מושבות EC בשלבים שונים של בידוד. קווים מקווקווים לסמן boundaries של דיל-AC-LDL + EC ותאי זיהום סביבה. ראשי חץ לבנים מצביעים על אי-EC מחוץ מושבה EC כי יש להסיר עם קצה פיפטה. ברים סולם מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. טבעות שיבוט והסרה פיזית של ללא EC תוצרת תרבויות EC לטווח ארוך טהורים ופונקציונליות. () FACS נציג dot חלקות של מכתים CD31 של שיבוטים EC שונים. שלושה מדגמים מייצגים מוצגים. המלבן השחור הפתוח בכל חלקה מתאר את אוכלוסיית CD31 +. אלוטיפ IgG משמש כביקורת שלילית. מדידה (ב ') של ביטוי גני אנדותל בשיבוטי NEC וTEC נבחרו. רמות ה- mRNA של endothelגני ial CD31, CD133, Cdh5, וVEGFR2 באים לידי ביטוי ביחס לאלו של fibroblasts העכבר העוברי (MEFs), ורמות ה- mRNA של גני mesenchymal Col1a1 וTagln באות לידי ביטוי ביחס לאלו של NEC-1. מכתים immunofluorescent נציג של שיבוט TEC מורחב (C). CD31 מוצג בירוק וגרעינים מוכתמים כחולים עם 4'6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI). (ד) נציג תמונות של היווצרות צינור על ידי שיבוטים EC שונים מצופים על Matrigel. ברים סולם מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. EC מבודד מcre Cdh5: ZsGreen
| מספר פלאפון | מאגר FACS (μL) | נוגדן CD31-PE (μl) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
1. כרכים אנטי-CD31 נוגדני PE-מצומדות שולחן חובה למספרים סלולריים שונים.
| מספר פלאפון | מאגר FACS (μl) | Anti-PE microbeads המגנטי (μl) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
2. כרכים אנטי-PE Microbead שולחן חובה למספרים סלולריים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל הקשיים בהשגת תרבויות TEC העיקרי טהורות, רב במחקרי מבחנה TEC תחליף עם קווים זמינים מסחרי EC או EC העיקרי כגון וריד טבור האנושי EC (HUVEC) 13. עם זאת, אוכלוסיות אלה EC מרקמות נורמליות יכולות רק לשמש כמדד לTEC אשר נבדלים במידה ניכרת מעמיתיהם הרגילים. לדוגמא, TEC הם phenotypically ותפקודי נורמלי in vivo וחלק מהליקויים אלה עשוי להיות transmittable במבחנה 14-18. יש לי TEC צמיחה, נדידה, ויכולות הבחנה חריגות ועשוי להתגבש עם תאי CD31 + גידול כדי ליצור מבנים כמו כלי-16,19,20. מחקרים תוך שימוש בכלי TEC או ללכוד לייזר תרבותי-גזור מייקר גידול הוכיחו שחורגים מTEC EC הרגיל בביטוי גנים, ציטוגנטית, ופרופילים אפיגנטיים 12,18,21-23. למרות העמקת ההבנה של אנגיוגנזה גידול שלנו על העברכמה עשרות שנים, מעט מאוד מחקרים פונקציונליים ומכאניים באמצעות TEC העיקרי התרבותי זמינות.
EC היו מבודד מורידי טבור אדם בשנתי ה -1970 24 המוקדמים. בידוד וculturing של כלי הדם EC מרקמות אנושיות ועכבר אחרים לאחר סיפק כלי רב עוצמה לחקירת פונקציות אנדותל בשתי בריאות ומחלה 25-28. רוב פרוטוקולי בידוד EC כרוכים שלושה שלבים עיקריים: קבלת השעיה תא בודד לאחר ניתוק מכאני או עיכול אנזימטי, תיוג EC עם נוגדן האנדותל ספציפי שמצומדת לmicrobeads או fluorophore או מגנטי, ומעשיר את אוכלוסיית EC באמצעות תא מיון או עמודות מגנטיות. עם זאת, בידוד של העכבר EC, במיוחד מגידולים, הוכיח קשה בשל התשואה הנמוכה של EC קיימא וזיהום תכוף של סוגי תאים אחרים, כולל תאים סרטניים ופיברובלסטים. בנוסף, במבחנה להיסחף פנוטיפי של EC ליתאי senchymal-כמו (מעבר אנדותל לmesenchymal, EndMT) מציבים אתגר נוסף עבור culturing לטווח ארוך של EC מרקמות נורמליות, גידולים, ומבשרי לתכנות מחדש.
האתגר הגדול בבידוד TEC הוא זיהום על ידי תאי גידול, שיכול בקלות לגבור מושבות EC צמיחה איטית המופיעות בדרך כלל לאחר ~ 7 - 10 ימים בתרבות. בנוסף, סמן בחירה נפוץ לבידוד EC הוא CD31 המתבטא בשפע בהאנדותל אלא גם מסמן תאי hematopoietic ובחלק מאוכלוסיות תאים סרטניים מקרי 20,30. יתר על כן, בעוד ההעשרה לEC, בחירת עמודת immunomagnetic תיווך CD31 לא יכולה להסיר את כל תא ותא זיהום שיכול סופו של דבר להשתלט על תרבויות EC אחרי כמה קטעים. על ידי הוספת שלב שיבוט-טבעת, אחד הוא מסוגל לבחור ולהרחיב את אוכלוסיות EC clonally נגזרות טהורות כי הם חופשיים של סוגי התאים מזהמים אלה. אתגר שני הוא עיקרי לטווח הארוךtenance של EC הטהור ללא קידום EndMT. EndMT מתרחש במהלך התפתחות, ניתן סכם בתפקוד כלי דם, והיא נפוצה בEC התרבותי (במיוחד בנוכחות TGFβ) 31-33. כדי למזער EndMT, להסיר תאי זיהום שעלולה לפעול כמקור TGFβ, לשמור תרבויות בצפיפות גבוהה, ולשמור על ריכוז גבוה של bFGF בתקשורת בכל העת. כפי שהראינו לאחרונה, bFGF הוא חיוני כדי לשמור על מפרט EC כפי שעוינות ביטוי מונע TGFβ של אקטין שריר חלק (סמן EndMT) 34.
שימוש במתודולוגיה זו, בידוד של EC מעכברי כתב "ממופה גורל" היה גם לראות. עכברים אלה הם שימושיים במיוחד במחקרים שבם יש צורך בהדמית intravital 35. למרות שחלק תיוג של תאי hematopoietic עלול להתרחש בcre Cdh5: ZsGreen l / s / עכברי l משמשים כאן, מודל זה מספק שיטה מהירה יחסית וקלה ליצירת שפעתorescent בר בvivo. מודל שושלת תיוג חלופי EC הוא עכבר טמוקסיפן-מושרה (cre Cdh5 / ERT2) חצה עם זן עיתונאי floxed עכבר (/ L / L ZsGreen ים) שתהיה לי EC בנאמנות ובאופן בלתי הפיך מסומן 36,37 . EC ניאון מעכברי Cre מושרה עשוי גם להיות מטוהר באמצעות FACS או באמצעות מתודולוגיה אנו מתארים במסמך זה.
EC הוא הטרוגנית פני מיטות כלי דם שונות והטרוגניות "תוך-כלי" גם עשוי להתקיים בין EC בתוך אותו הכלי 38,39. בנוסף, היררכיה של EC עם פוטנציאל שגשוג שונה נצפתה באוכלוסיות EC מבודדות מורידים, וחלק קטן של EC המשובט ניתן passaged מעבר 40 אוכלוסיית הכפלות 40. לכן, מגבלות של השיטה המתוארת כאן כוללות: 1) בחירה אפשרית של EC השגשוג מאוד אלה המתגוררים בדפנות כלי הדם; ו 2) העשרה רק מפרט אחדתת סוג ific כלי דם נובע מעורקים, ורידים, או נימים, אשר עשוי לייצר שיבוטים שאינם מייצגים את כלל אוכלוסיית EC לחלוטין in vivo. עם זאת, כפי שניתן להשיג אוכלוסיות משובטים מרובות מהליך בידוד אחד, שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור ניתוחים תפקודיים וגנטיים של ההטרוגניות EC שקיים בתוך גידולים ורקמות אחרות 12. יחדיו, שתואר כאן הוא שיטת בידוד EC שמייצרת מושבות EC טהורות נטולות זיהום שאינו EC. התאים המבודדים צריכים להיות שימושיים עבור מחקרים במבחנה פונקציונליים, פרופיל ביטוי הגנום, ואפיון מולקולרי של מסלולים חדשים ששולטים אנגיוגנזה גידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C.
- Dudley, A. C.
- Aird, W. C.
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
