Abstract
Vers geïsoleerde tumorspecifieke endotheelcellen (TEC) kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van tumorangiogenese staand en dienen als een in vitro model voor de ontwikkeling van nieuwe angiogeneseremmers voor kanker. Echter, de lange-termijn in vitro expansie van muis endotheelcellen (EC) is een uitdaging vanwege fenotypische drift in kweek (endotheel-to-mesenchymale overgang) en verontreiniging met niet-EC. Dit geldt vooral voor TEC die gemakkelijk worden weggeconcurreerd door co-gezuiverd fibroblasten of tumorcellen in kweek. Hier wordt een high fidelity isolatiewerkwijze die gebruik maken van immunomagnetische verrijking gekoppeld kolonieselectie en in vitro expansie neemt beschreven. Deze aanpak levert pure EG fracties die volledig vrij zijn van verontreinigende stromale of tumorcellen. Ook is aangetoond dat lineage getraceerd Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter muizen gebruikt met de hierin beschreven protocol, een waardevol hulpmiddel om cellen te controlerenzuiverheid van de geïsoleerde EG kolonies van deze muizen tonen duurzaam en briljante ZsGreen fluorescentie in cultuur.
Introduction
Endotheelcellen (EC) zijn essentieel tijdens de groei van grote tumoren. Vanaf de start van de angiogene switch in slapende tumoren verspreiding en het zaaien van metastasen op afgelegen locaties, EG vormen de leidingen die het bloed, zuurstof en voedingsstoffen om 1 tumorgroei ondersteunen. Zoals onlangs gesuggereerd, EC ook perfusie-onafhankelijke functies en vormen een nis die de groei van kanker stamcellen en andere tumorale stromacellen 05/02 ondersteunt. Zo sterk gezuiverd tumor-specifieke EG (TEC) voor in vitro cultuur zorgt voor routine functionele studies die licht zal werpen op nieuwe moleculaire mechanismen bemiddelen tumor angiogenese en overspraak met tumorcellen.
EC zijn zeer gespecialiseerde afhankelijk van het weefsel van oorsprong 6. Vanwege de heterogeniteit van verschillende tumortypes en de tumor micro-omgeving, kan TEC ook unieke eigenschappen die een tumor-specifiek specialisatie o weerspiegelen tonenf het vaatstelsel. Zo is er opvallende variatie in genexpressie handtekeningen TEC geïsoleerd van verschillende types of klassen van tumoren 7,8. Echter, kunnen frequente co-zuivering van niet-EG, in het bijzonder tumor-geassocieerde fibroblasten en tumorcellen, met TEC verwarren genoom-wijde expressie analyses. Deze ongewenste celsoorten zijn bijzonder problematisch studies die afhankelijk lange termijn in vitro expansie van TEC culturen.
Hier beschreven is een high-fidelity methode die consistent produceert zuivere cultures van EC tumoren en andere weefsels. Volgende kolom immunomagnetische verrijking van EG-fracties en verwijdering van co-gezuiverde niet-EG, een extra klonen-ring stap om pure EG kolonies wordt gebruikt 9 vast te leggen. Elke kolonie kan in de cultuur voor meerdere passages uit te breiden zonder de opkomst van verontreinigende niet-EG. Deze werkwijze levert ook meerdere EC klonen uit een isolatiewerkwijze, die ideaal is voor de studie van endothelial heterogeniteit. Daarnaast wordt aangetoond dat Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter muizen zijn een waardevol instrument voor het genereren van "-lot in kaart gebracht" en onuitwisbaar gemarkeerde EG, die ZsGreen fluorescentie in cultuur 10 te handhaven. Met kleine aanpassingen aan het protocol, moet deze methode aan te passen aan verschillende soorten tumoren of normale weefsels zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol wordt uitgevoerd op basis van door het ministerie van Laboratory Animal Geneeskunde aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill richtlijnen.
1. Bereid het volgende materiaal en reagentia Voordat u begint
- Bereid EC media door aanvulling 400 ml lage glucose (1 g / l D-glucose of LG) Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 50 ml hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 50 ml Nu-Serum IV, 5 ml antibioticum-antimycoticum, en hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1 en heparine componenten uit de commerciële kit.
- Bereid 500 ml FACS-buffer (0,5% BSA en 2 mM EDTA in PBS); filteren door middel van een steriel 0,22 pm filter beker.
- Steriliseren of desinfecteren ontleden boord.
- Steriliseren dissectie pinnen, chirurgische schaar en dissectors.
2. EG-Isolatie (Day 1, ~ 5 uur)
- Euthanaseren muis met kooldioxide of andere methoden compliant with de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) beleid.
Opmerking: Meerdere borsttumoren variërend in grootte (5-15 mm in diameter) kunnen ontwikkelen in een enkel genetisch gemodificeerde muis, zoals C3-Tag, zeker om ze allemaal te oogsten voor TEC isolement. Bij gebruik van tumoren die orthotopically worden geënt in muizen, zwembad 2-3 1 cm 3 tumoren voor een enkele EG isolement. Hier gebruiken we borsttumoren als demonstratie, maar het protocol kan worden aangepast voor andere typen tumoren. - Desinfecteren muis door sproeien of vegen de muis buikzijde met een ruime hoeveelheid van 75% v / v ethanol.
- Reseceren tumoren met een schaar en dissectors met behulp van aseptische technieken in een steriele kap of op een schone bank.
- Strek en speld de ledematen van de muizen op een dissectie bord. Maak een middellijn ventrale incisie met de schaar zonder het openen van het buikvlies. Prepareer zijwaarts tussen de huid en het buikvlies naar de melkklieren waar de tumoren zich bevinden.Heeft het buikvlies niet openen.
- Accijnzen alleen tumorweefsel van de melkklieren, het weglaten van normale borstklier marges. Trimmen voorzichtig van niet-tumor weefsels zoals huid en spieren, en plaats ontleed tumoren in een conische buis met 30 ml van de LG-DMEM op ijs.
- Breng tumor monsters weefselkweek kap; wassen weefsels met steriele LG-DMEM 1-2 keer.
- Transfer tumoren met het conische buis een steriele cultuur petrischaal, voeg 2 ml DMEM-LG in de schaal en gehakt met een paar steriele schaar in stukken <5 mm.
- Voeg 5 ml collagenase (voorraad = 2 mg / ml in Hank's Balanced Salt Solution, hierna HBSS), 1 ml van dispase (voorraad = 2,5 U / ml in HBSS) en 75 pl desoxyribonuclease (voorraad = 1 mg / ml in PBS ) in de petrischaal. Totaalvolume nu ~ 10 ml.
- Breng de collagenase / weefsel mix van de petrischaal op een tissue-dissociator buis en draaien op een tissue dissociator gedurende 60 seconden tweemaal (pre-set dissociatie program op de dissociator: 1270 totaal rondes per run). Incubeer met licht schudden op een schudder gedurende 75 min bij 37 ° C.
- Filter verteerd weefsel door een 100 micrometer cel zeef in een 50 ml conische buis. Filter spoelen met 5 ml FACS-buffer om eventuele resterende cellen te wassen. Spin bij 280 xg gedurende 5 min en het supernatant voorzichtig te zuigen zonder de celpellet.
- Verdun 1 ml van de voorraad RBC lysisbuffer (10x) in 9 ml steriel water. Lyse rode bloedcellen met 10 ml lysis buffer (1x), en onmiddellijk draaien 5 min bij 280 x g. Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen als weinig bloed zichtbaar is.
- Resuspendeer in 10 ml FACS-buffer. Meng 10 pl celsuspensie met 10 pi van trypan blauw en levende cellen te tellen met een hemocytometer.
- Resuspendeer cellen op ~ 10 7 cellen / 100 ul. Voeg 10 ul van FcR blok per 100 gl celsuspensie, en incubeer op ijs gedurende 10 min.
- Add rat-anti-muis PE-geconjugeerd CD31 antilichaam volgens. Tabel 1 Incubeer op ijs gedurende 10 - 15 min en flick buis af en toe.
- Voeg 10 ml FACS-buffer aan de buis en centrifugeren bij 280 g gedurende 5 min. Verwijder voorzichtig het supernatant en was de cel pellet opnieuw met 5 ml FACS buffer. Centrifugeer cellen te pelleteren. Zuig supernatant zonder storende celpellet.
- Voeg FACS buffer en anti-PE microbolletjes volgens tabel 2 Incubeer op ijs gedurende 10 -. 15 min. Flick de buis af en toe.
- Voeg 10 ml FACS buffer en centrifugeren monsters bij 280 xg gedurende 5 min; eenmaal met nogmaals 5 ml FACS buffer en centrifugeer. Zuig supernatant zonder storende pellet.
- Breng volume op 300 pl in FACS buffer. Draaien door middel van 35 micrometer cel zeef bedekte buis 5 minuten bij 280 x g. Gebruik 2 buizen en een groter volume als dat nodig is.
- Instellen multistand magnetische en magnetische kolommen in hood, hechten een kolom scheider en equilibreren van de kolom met 2 ml FACS-buffer.
- Aspirate het supernatant en resuspendeer de celpellet in 0,5 - 1 ml FACS-buffer.
- Leid de celsuspensie door de magnetische kolom geëquilibreerd.
- Was de kolom driemaal met 2 ml FACS-buffer en verzamel doorstroom (FT) in een 15 ml buis (FT fractie).
- Neem de kolom van de separator en elueer met 2 ml FACS-buffer in een 15 ml buis (eluaat fractie). Gebruik zuiger te zorgen dat alle cellen uit de kolom. Herhaal de elutie twee maal met 2 ml FACS buffer per keer.
- Draai het eluaat bij 280 xg gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml van EC media.
- Even verdelen het eluaat fractie (~ 6 ml) in 10 cm gelatine beklede schalen. Drie 1 cm 3 tumoren plaat uitgewassen cellen in ten minste vier platen. Alternatief plate geëlueerde cellen bij verschillende concentraties in meerdere platen (bijv., Zaad 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml en 3 ml van het eluaat in vier platen) om tegen eent minste één plaat is dun bezaaid met geëlueerd cellen. Controleer de confluentie van de aangehechte cellen bij ~ 1% van de volgende dag (dat wil zeggen, ongeveer 1,0 - 2,0 x 10 5 cellen gevoegd).
Opmerking: De cellen moeten schaars worden verzilverd, zodat EG kolonies zonder te worden verontreinigd door andere celtypen kunnen vormen. - Plaat FT fractie in een 10 cm schotel te laten cellen herstellen O / N. Controleer of de plaat is 80-100% confluent de volgende dag. Bevries de cellen af (-80 ° C) in 250 gl cellen bevriezen media in een cryotube en opslaan in vloeibare stikstof de volgende dag. Opmerking: FT fractie kan voor tumorcel isoleren later en / of als een negatieve controle voor EC genexpressie analyse van de geïsoleerde klonen EC.
- Veranderen media elke 2-3 dagen. Kolonies beginnen te vormen na 7 - 10 dagen. Kleine EC kolonies al op dag 3. Markeer de kolonies met een fijne punt marker op de bodem van de schaal worden geïdentificeerd.
- Schraap niet-specifieke cells rond de geïdentificeerde kolonies met een steriele 200 ul Pippet tip.
3. Colony Selectie Met behulp van Klonen Rings
- Veranderen media elke 2-3 dagen. EC zuiverheid worden gecontroleerd met LDL (Dil-Ac-LDL) toevoeging bij ongeveer 5 - 7 dagen. Voeg 50 ul van LDL per 10 ml medium EC en incubeer gedurende 3 - 4 uur voor het controleren van de cellen onder fluorescentiemicroscoop.
Opmerking: Meerdere LDL + EG klonen kon worden waargenomen bij ~ dag 7. - Start oogsten EG kolonies wanneer ze diameters van 3 bereikt - 5 mm. (Kies grote kolonies die zijn verpakt met kleine LDL + cellen voor de beste resultaten.)
- Voordat oogsten EG met klonen ringen, pre-coat een paar 6-well platen met 0,5% gelatine. Aspireren gelatine, voeg 2 ml van EC media aan elk putje, en houden de platen in een incubator totdat het nodig is.
- Schraap niet-EG over de randen van de kolonies om ervoor te zorgen dat er geen andere celtypes worden gevangen binnen het klonen ring.
- Met behulp van eenfasecontrastmicroscoop (4x of 10x objectief) schetsen met een fijne punt marker op de bodem van de kweekschaal de gebieden met EC kolonies.
- Was de plaat met 10 ml PBS en een zeer dun laagje PBS in de plaat bij het opzuigen. (Let op: kleine hoeveelheid (~ 0,5 ml) PBS zullen cellen levend gedurende het kloneren-ring procedure houden, ook, weefselhechtmiddel dient water te binden.)
- Kies een klonen ring van de juiste grootte. Gebruik een paar van ontleden pincet te halen een ring, en met een 10 pi pipet tip gelijkmatig een kleine hoeveelheid weefsel lijm op het klonen ring.
Let op: gebruik alleen minimale hoeveelheid (~ 0,2 ul voor een kleine ring) weefsel lijm op het klonen van ringen, en zorg ervoor dat weefsel lijm wordt verspreid gelijkmatig rond de onderkant om een goede afdichting te waarborgen. Overmatige weefsel lijm produceert warmte en vormt films die cellen kunnen doden. - Plaats het klonen ring over de EG-kolonie. Druk voorzichtig naar beneden het klonen ring aan de ri lijmenng op de plaat. Zorg ervoor dat de kolonies niet worden gedroogd voordat het lijmen van de ring.
- Onmiddellijk Pipetteer 25 ul van enzymatische cel losraken oplossing in de ring klonering en incubeer ~ 1 min of totdat de cellen losjes bevestigd.
- Pipet cellen in het klonen ring druppelsgewijs in een putje van een 6-wells plaat met voorverwarmde EC media. (Belangrijk: Schud de plaat naar de cellen te verspreiden; EG liever groeien in nauwe clusters.) Was het klonen ring met 50 - 100 ul EC media om zoveel mogelijk cellen te verzamelen als mogelijk, en de overdracht van alle wasbeurten in dezelfde 6-well .
- Als sommige kolonies in de 10 cm schotel zijn te klein om te oogsten, voeg 10 ml vers medium, laat de kolonies te kweken voor een paar dagen, en herhaal het klonen ring procedure.
- Groeien kolonies geoogst in 6-well platen tot 80 - 100% confluent, en overdracht cellen 3 putjes van een 6-wells plaat, voordat expanderen in een 10 cm weefselkweek schaaltje. Schraap verontreiniging cellen. Herhalingeen nieuwe ronde van het klonen ring procedure (Stappen 3,5-3,10) indien nodig. Houd cellen relatief confluent (~ 60 - 70%), bij uitbreiding. EG kunnen stoppen met groeien als vergulde te schaars.
- Karakteriseren EG van FACS-kleuring, PCR, etc. Merk op dat Dil-Ac-LDL fluorescerend en kunnen interfereren met PE of andere fluorescente antilichamen FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EG vormen slechts een kleine fractie van de totale celpopulatie in de meeste volwassen weefsels 11. Het is daarom belangrijk om volledig te verteren het geoogste weefsel in een enkele-celsuspensie die de maximale afgifte van EG extracellulaire matrix (ECM) en bindweefsel zorgt. In onze ervaring, CD31-gemedieerde immunomagnetische selectie biedt alleen verrijkt, maar niet zuiver EG fracties; dus een cruciale stap is fysische verwijdering van co-gezuiverde niet-EC en selectie / expansie van EG kolonies gebruik kloneringsringen (figuur 1). Wanneer bijvoorbeeld CD31-verrijkte EC werden uitgeplaat zonder verdere kolonieselectie, non-EC snel uitbreidden en vermengd met EG produceren onzuivere EC culturen zoals blijkt uit Dil-Ac-LDL + en Dil-Ac-LDL - populaties (Figuur 2A) . Echter, wanneer de kolom eluaten werden uitgeplaat bij lage dichtheid, de EC kolonies groeiden met relatief weinig omringende niet-EC, die werden verwijderd door scverkrachten met een pipet tip (Figuur 2B). De groei en zuiverheid van het geëxpandeerde kolonies kan verder worden gecontroleerd door toevoeging van Dil-Ac-LDL. Kleine EG kolonies kunnen worden waargenomen bij ~ dag zeven na-CD31 gemedieerde kolom verrijking (Figuur 2B, bovenste panelen). Na de selectie en de uitbreiding van de EG-kolonies, Dil-Ac-LDL - cellen worden geëlimineerd, en de cel bevolking is zeer zuivere voor Dil-Ac-LDL + EC zoals aangegeven door Dil-Ac-LDL-opname (Figuur 2B, bodempanelen).
Om te testen of de isolatiemethode consistente resultaten, verschillende klonen afkomstig van ofwel borsttumoren weggesneden uit C3-TAg produceren (FVB / N C3 1 -tag) muizen of normale borstklieren van vergelijkbare leeftijd wildtype FVB-muizen werden geïsoleerd en geëxpandeerd 12. De zuiverheid van elke TEC en normale EC (NEC) populatie werd vervolgens voorzichtig kenmerk de zuiverheid te waarborgen. Flow cytometrie analyse van drie onafhankelijke monsters vertoonde een enkele, Uniformed CD31 + populatie die verschilt van IgG isotype controles (figuur 3A) was. De mRNA-expressie van EG merkers, waaronder CD31, Cdh5 (VE-cadherine), CD133 en VEGFR2 in vier EG geteste klonen was ~ 200 tot 7000 maal hoger dan die van muis embryonale fibroblasten (MEF) dat werd gebruikt als een negatieve controle (Figuur 3B). Zoals verwacht, alle EG-klonen uitgedrukt bijna niet op te sporen niveaus van de mesenchymale merkergenen COL1A1 en Tagln vergelijking met MEF. Immunofluorescentiekleuring bleek dat alle cellen in een TEC representatieve kloon uniform CD31 + (Figuur 3C). Bovendien zijn deze EC klonen konden spontane vatachtige structuren in vitro, wat aangeeft dat ze endotheliale functie verloren na kweken (Figuur 3D).
De isolatie methode werd verder gevalideerd met Cdh5 cre: ZsGreen
Figuur 1. Stroomschema en Overzicht van het EG-Isolation Procedure.
Figuur 2. Dil-Ac-LDL Onderscheidt EG Verontreinigende niet-EG Live culturen. (A) Fase contrast en fluorescerende beelden die EG en co-geïsoleerde niet-EG, zonder klonen-ring selectie van EG-kolonies. (B) Fase contrast en fluorescentie afbeeldingen EG kolonies in verschillende stadia van isolatie. Stippellijnen markeren de boundaries van Dil-Ac-LDL + EC en de omliggende vervuilende cellen. Witte pijlpunten wijzen op niet-EG buiten een EG kolonie die moeten worden verwijderd met een pipet tip. Schaal balken geven 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Klonen Ringen en fysieke verwijdering van niet-EG-Produce Puur en Functionele lange termijn EC culturen. (A) Vertegenwoordiger FACS dot plots van CD31 kleuring van verschillende EG-klonen. Drie representatieve monsters worden getoond. De open zwarte rechthoek in elk perceel schetst de CD31 + populatie. Een IgG isotype wordt gebruikt als een negatieve controle. (B) Meting van endotheliale genexpressie in geselecteerde NEC en TEC klonen. De mRNA-niveaus van endothelial genen CD31, CD133, Cdh5 en VEGFR2 tot expressie ten opzichte van die van muis embryonale fibroblasten (MEF) en de mRNA niveaus van mesenchymale genen COL1A1 en Tagln zijn ten opzichte van die van de NEC-1 tot expressie. (C) Vertegenwoordiger immunofluorescentiekleuring van een uitgebreide TEC kloon. CD31 wordt getoond in groen en kernen zijn blauw gekleurd met 4'6'-diamidino-2-fenylindool (DAPI). (D) Vertegenwoordiger beelden van de buis vorming door verschillende EG klonen geplateerd op Matrigel. Schaal balken geven 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. EG Geïsoleerd van Cdh5 cre: ZsGreen
| Gsm-nummer | FACS buffer (pl) | CD31-PE antilichaam (pl) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
Tabel 1. PE-geconjugeerde anti-CD31 Antibody Volumes Vereist voor Verschillende Cell Numbers.
| Gsm-nummer | FACS buffer (pl) | Anti-PE magnetische microparels (pl) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
Tabel 2. Anti-PE microbeads Volumes Vereist voor Verschillende Cell Numbers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege de moeilijkheden bij het verkrijgen van zuivere primaire kweken TEC, veel in vitro studies TEC vervanging met commercieel verkrijgbaar EC lijnen of primaire EC zoals humane navelstreng EC (HUVEC) 13. Echter, kunnen deze EC populatie van normale weefsels alleen dienen als een proxy voor de TEC, die sterk afwijken van hun normale tegenhangers. Zo TEC fenotypisch en functioneel abnormale in vivo en sommige van deze afwijkingen kunnen overdraagbare in vitro 14-18 zijn. TEC hebben afwijkende groei, migratie en differentiatie vaardigheden en kunnen samensmelten met CD31 + tumorcellen schip-achtige structuren 16,19,20 vormen. Studies met behulp van gekweekte TEC of laser capture micro-ontleed tumor schepen die TEC afwijken van de normale EC in genexpressie, cytogenetische, en epigenetische profielen 12,18,21-23 aangetoond. Ondanks de verdieping van ons begrip van de tumor angiogenese de afgelopendecennia heel weinig functioneel en mechanistische studies met gekweekte primaire TEC zijn beschikbaar.
EC werden geïsoleerd uit menselijke navelstreng aders in de vroege jaren 1970 24. Daaropvolgende isolatie en kweken van microvasculaire EC van andere humane en muis weefsels is voorzien in een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van endotheliale functies zowel gezondheid en ziekte 25-28. De meeste EG-isolatie protocollen omvatten drie belangrijke stappen: het verkrijgen van een single-cell suspensie na mechanische dissociatie of enzymatische vertering, etikettering EG met een endotheel-specifiek antilichaam dat is geconjugeerd aan ofwel een fluorofoor of magnetische microbolletjes, en het verrijken van de EG-bevolking met behulp van mobiele sorteren of magnetische kolommen. Echter, isolatie van muizen EC, vooral van tumoren is moeilijk gebleken vanwege de lage opbrengst van levensvatbare EG en frequente besmetting van andere celtypen zoals tumorcellen en fibroblasten. Daarnaast is in vitro fenotypische drift van EC in mijsenchymal-achtige cellen (endotheelcellen naar mesenchymale overgang EndMT) vormt een extra probleem voor langdurig kweken van EG normale weefsels, tumoren en geherprogrammeerd precursors.
De grootste uitdaging tijdens TEC isolatie besmetting door tumorcellen, die gemakkelijk kan verdringen de langzamer groeiende EC kolonies die gewoonlijk verschijnen na ~ 7 - 10 dagen in kweek. Bovendien is een veel gebruikte selectiemerker voor het isoleren EG CD31 welke overvloedig tot expressie wordt gebracht in het endotheel, maar markeert ook hematopoietische cellen en in sommige gevallen tumorcel subpopulaties 20,30. Bovendien, terwijl het verrijken van EG-CD31 gemedieerde immunomagnetische column selectie kan niet elke besmetting van cellen die uiteindelijk EG culturen kunnen overnemen na een paar passages te verwijderen. Door een kloneren-ring stap is men in staat om te selecteren en uit te breiden pure klonaal afgeleide EC populaties die vrij van die verontreinigende celtypen. Een tweede uitdaging is de lange termijn belangrijksteonderhoud van pure EG zonder bevordering van EndMT. EndMT optreedt tijdens de ontwikkeling, in het vasculaire disfunctie kan worden gerecapituleerd en is gebruikelijk in gekweekte EC (vooral in de aanwezigheid van TGFp) 31-33. Om EndMT minimaliseren, verwijdert contaminerende cellen die kunnen fungeren als een bron TGFB, houdt kweken bij hoge dichtheden en hanteren hoge concentraties van bFGF in de media te allen tijde. Zoals we onlangs hebben laten zien, bFGF is essentieel om EG-specificatie te behouden als het antagoniseert TGF-driven expressie van gladde spier actine (een EndMT marker) 34.
Met behulp van deze methode, isolatie van EG van een "lot in kaart gebracht" reporter muizen werd ook getoond. Deze muizen zijn bijzonder nuttig in studies waar intravitale beeldvorming nodig 35. Hoewel sommige kenmerken van hematopoietische cellen kan optreden in de Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l muizen hier gebruikt, dit model levert een relatief snelle en eenvoudige werkwijze voor het genereren grieporescent EG in vivo. Een alternatieve EC lineage-labeling model is een tamoxifen induceerbare muis (Cdh5 cre / ERT2) gekruist met een floxed reporter muizenstam (ZsGreen l / s / l) dat EG trouw zal hebben en onomkeerbaar gemarkeerd 36,37 . Fluorescerende EG de induceerbare cre muizen kunnen ook worden gezuiverd met behulp van FACS en met behulp van de methodologie die we hierin beschrijven.
EG zijn heterogeen in verschillende vasculaire bedden en "intra-schip" heterogeniteit kan ook bestaan tussen EG binnen hetzelfde vat 38,39. Bovendien heeft een hiërarchie van EC met verschillende proliferatieve potentie waargenomen bij EC populaties geïsoleerd uit aderen, en een klein deel van klonale EC kan worden gepasseerd dan 40 populatieverdubbelingen 40. Derhalve beperkingen van de hier beschreven werkwijze zijn: 1) mogelijke selectie van deze zeer proliferatieve EC die in de vaatwand; en 2) verrijking van één specific vasculaire subtype afgeleid van slagaders, aders, of haarvaten, die klonen die niet volledig de totale EG-bevolking vertegenwoordigen in vivo kan produceren. Niettemin, als meerdere klonale subpopulaties kunnen worden verkregen uit één isolatiewerkwijze, deze werkwijze kan bruikbaar zijn voor functionele en genetische analyse van EC heterogeniteit in tumoren en andere weefsels 12 bestaat. Samen genomen, hier beschreven is een EG-isolatie methode die pure EG kolonies verstoken van verontreinigende niet-EG produceert. De geïsoleerde cellen moet nuttig zijn voor in vitro functionele studies, genoom-brede genexpressie en moleculaire karakterisatie van nieuwe routes die tumor angiogenese controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C.
- Dudley, A. C.
- Aird, W. C.
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
