Abstract
갓 절연 종양 특이 내피 세포 (TEC)는 종양 혈관 신생의 분자 메커니즘을 탐구 및 암에 대한 새로운 혈관 신생 억제제를 개발하기위한 시험 관내 모델로서 기능 할 수있다. 그러나 쥐의 내피 세포 (EC)의 체외 확장에 장기적으로 인해 비 EC와 표현형 문화 드리프트 (내피 - 투 - 중간 엽 전환) 및 오염에 도전한다. 이것은 쉽게 문화의 공동 정제 섬유 아 세포 또는 종양 세포에 의해 outcompeted된다 TEC 특히 사실이다. 여기서, 콜로니를 선택하여 시험 관내 확장에 결합 면역 자기 농축 활용 고음질 분리 방법이 설명된다. 이 접근법은 기질 또는 종양 세포를 오염 완전히 무료 EC 순수한 분획을 생성한다. 또한 그 혈통 추적 Cdh5의 CRE 주심 : 프로토콜 사용의 ZsGreen 리터 / S / L 기자 마우스는, 여기에 기술, 세포를 확인하는 유용한 도구입니다이 마우스에서 분리 된 EC의 식민지로 순도는 문화의 내구성과 화려한 ZsGreen이 형광을 보여줍니다.
Introduction
내피 세포 (EC)는 고형 종양의 개발 과정에서 필수적이다. 보급과 먼 부위에서 전이의 파종에 휴면 종양에서 혈관 신생 스위치의 시작에서, EC는 종양 성장 1을 유지하기 위해 혈액, 산소를 공급 도관과 영양분을 형성한다. 최근에 제안 된 바와 같이, EC는 관류 독립 펑션이 암 줄기 세포 및 다른 종양 간질 세포 2-5의 성장을 지원하는 틈새를 형성한다. 따라서, 높은 종양 특이 체외 문화에 대한 EC (TEC)는 종양 혈관 신생 및 종양 세포와 혼선을 매개하는 새로운 분자 메커니즘을 밝혀됩니다 루틴 기능 연구를 허용 정제.
EC는 기원 6의 조직에 따라 고도의 전문이다. 때문에 다른 종양 유형의 이질적인 성격과 종양 미세 환경에, TEC는 또한 종양 특이 전문화 O를 반영하는 고유의 기능이 표시 될 수 있습니다혈관 F. 예를 들어, 다른 유형의 종양 또는 7,8의 성적으로부터 격리 TEC에서 유전자 발현 서명에 현저한 변화가 존재한다. 그러나, TEC 비-EC, 특히 종양 관련 섬유 아 세포와 종양 세포의 빈번한 공동 정화는 게놈 전체의 발현 분석을 혼동 할 수 있습니다. 이러한 원치 않는 세포 유형은 TEC 배양 시험관 팽창 장기에 의존 연구에서 특히 문제가된다.
여기에 설명이 지속적으로 종양과 다른 조직에서 순수한 EC 문화를 생산하는 고품질의 방법이다. EC의 분수와 공동 정제 비 EC의 제거의 면역 자기 열 농축에 따라, 추가 복제 링 단계 9를 사용하는 순수한 EC 식민지를 촬영합니다. 각 콜로니 비 EC 오염의 발생없이 여러 통로 용 배양에서 확장 될 수있다. 이 방법은 엔도의 연구를위한 이상적인 단일 분리 과정에서 다중 EC 클론을 수득상피 이질성. ZsGreen이 리터 / S / L 기자 마우스 문화 10 ZsGreen이 형광을 유지 "운명 매핑"과 지워지지 표시된 EC를 생성하기위한 유용한 도구입니다 : 또한, Cdh5 CRE는 것을 알 수있다. 프로토콜에 약간의 조정으로,이 방법은 다른 유형의 종양 또는 정상 조직에 적용 할 수 있어야합니다.
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Protocol
다음 프로토콜은 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 실험 동물 의학의 부에 의해 설립 된 지침에 따라 수행된다.
1. 시작하기 전에 다음 재료 및 시약 준비
- 400 ml의 낮은 혈당 보충에 의해 EC 미디어를 준비 (1g / L의 D- 글루코스 또는 LG) 둘 베코의 수정 50 ml의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청, 5 ml의 항생제 항진균제 50 ㎖ 뉴 - 세럼 IV, 독수리의 매체 (DMEM) 상업 키트에서 hFGF의, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, 헤파린 구성 요소.
- 500㎖의 FACS 완충액 (0.5 % BSA 및 PBS 2 mM의 EDTA)을 제조; 멸균 0.22 μm의 필터 컵을 통해 필터링합니다.
- 소독 또는 보드를 해부 소독.
- 해부 핀, 외과 가위, 및 dissectors을 소독.
2. EC 절연 (1 일 ~ 5 시간)
- 이산화탄소 또는 다른 방법과 호환 재치 마우스를 안락사H 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 정책.
참고 : 크기가 다양한 여러 유방 종양 (5 - 직경 15 mm의), 같은 C3-태그와 같은 단일 유전자 변형 마우스의 개발 TEC의 격리를 위해 그들 모두를 수확해야 할 수 있습니다. 하나의 EC 격리를위한 세 가지 1cm 3 종양 동소 마우스에 접목되어 종양, 수영장 두를 사용하는 경우. 여기서 우리는 데모로 유방 종양을 사용하지만, 프로토콜은 다른 유형의 종양에 대해 변형 될 수있다. - 분무 또는 75 % V / V 에탄올의 충분한 양의 마우스 복부 측면을 닦아 마우스를 소독.
- 멸균 후드 나 클린 벤치에서 무균 기술을 사용하여 가위와 dissectors 일쌍로 종양을 절제.
- 스트레칭과 해부 보드에 마우스의 사지를 고정. 복막을 열지 않고 가위로 중간 선 복부 절개를합니다. 피부 종양이있는 유선으로 복막 사이에 옆으로 해부.복막을 열지 마십시오.
- 소비세 만 종양 유선에서 조직, 일반 유선 마진을 떠나. 조심스럽게 피부와 근육 등 비 종양 조직을 손질하고, 얼음에 LG-DMEM 30 ml의를 포함하는 원뿔 튜브에 해부 종양을 배치합니다.
- 조직 문화 후드에 종양 샘플을 가져와; 2 회 - 멸균 LG-DMEM 1 조직을 씻는다.
- 멸균 조직 문화 배양 접시에 원뿔 튜브에서 전송 종양, 접시에 LG-DMEM 2 ㎖를 추가하고, 조각으로 멸균 가위 <5mm 말하다.
- PBS에서, 디스 파제 1 ㎖를 (주 = 행크의 균형 소금 솔루션에 2 mg을 / ㎖, HBSS를 이하) 콜라게나 제 5 mL를 추가 (재고 = HBSS에 2.5 U / ㎖) 및 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 75 μL (주 = 1 ㎎ / ㎖ ) 페트리 접시에. 총 부피는 지금 ~ 10 ㎖이다.
- (미리 설정된 해리 홍보 조직 dissociator 튜브에 페트리 접시에서 콜라겐 / 조직 믹스를 전송하고 두 번 60 초 동안 조직 dissociator에서 실행dissociator에 ogram : 실행 당 1,270 총 라운드). 빛은 37 ° C에서 75 분 동안 진탕 기에서 진탕 배양한다.
- 필터를 50 ㎖ 원뿔형 튜브 위에 100 ㎛ 세포 스트레이너를 통해서 조직을 분해. FACS 버퍼 5 ㎖와 린스 필터가 남아있는 세포를 씻어. 5 분 동안 280 XG에 스핀 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 멸균 수 9 ml의 스톡 RBC 용해 완충액 (10 배)의 1 mL로 희석. 바로 10 용해 완충액 (1X)의 용액과 함께를 Lyse 적혈구는 280 x g에서 5 분간 스핀. 참고 : 약간의 피가 보이는 경우에는이 단계를 건너 뛸 수 있습니다.
- FACS 완충액 10ml에 재현 탁. 트리 판 블루 10 μL와 세포 현탁액의 10 μl를 혼합하고, 혈구를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다.
- ~ 10 7 세포 / 100 μL에서 세포를 재현 탁. 세포 현탁액 100 ㎕ 당 FcRγ 쇄 블록의 10 μl를 추가하고 10 분 동안 얼음에 품어.
- 따라 쥐 방지 마우스 PE - 복합 CD31 항체 추가. 때때로 15 분, 영화 튜브 - 표 1 (10) 얼음에 품어.
- 5 분 동안 280 XG에 튜브와 스핀에 외과 버퍼의 10 ML을 추가합니다. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 FACS 버퍼의 5 ㎖로 다시 세포 펠렛을 씻는다. 원심 분리기는 세포 펠렛합니다. 방해 세포 펠렛없이 기음 뜨는.
- . 표 2에 따라 외과 버퍼 및 안티 체육 마이크로 비드를 추가 (10) 얼음에 품어 - 15 분. 가끔 톡 관.
- 5 분 동안 280 XG에 외과 버퍼와 스핀 샘플의 10 ML을 추가; 다시 FACS 완충액 원심 5 ㎖로 한번 세척 하였다. 방해 펠렛없이 대기음 뜨는.
- FACS 버퍼 300 μL에 볼륨을 가져와. G X 280에 35 μm의 셀 스트레이너 덮인 관 5 분을 통해 스핀. 필요한 경우 2 튜브와 더 큰 볼륨을 사용합니다.
- , 후드에서 자기 multistand 및 자기 열을 설정 분리기에 열을 연결하고 FACS 버퍼 2 ㎖로 열을 평형.
- AspiratFACS 완충액 1 ㎖ - E 상등액 및 0.5에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 평형 자기 칼럼을 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
- FACS 버퍼 2 ㎖로 열 세 번 세척하고, 15 ML 튜브 (FT 분율)의 흐름을 통해 (FT)를 수집합니다.
- 분리 떨어져 열을 가지고 또 다른 15 ML 튜브 (용출액 부분)에 외과 버퍼의 2 ㎖로 용출. 모든 세포는 열 떨어져 있습니다 보장하기 위해 플런저를 사용합니다. 마다 버퍼 외과의 2 mL로 용출을 두 번 더 반복합니다.
- 5 분 동안 280 XG에서 용출액 스핀.
- 상층 액을 제거하고 EC 미디어 10ml에 펠렛을 재현 탁.
- 마찬가지로 용출액 부분을 분할 (~ 6 ㎖) 10cm 젤라틴 코팅 요리에. 세 1cm 3 종양, 플레이트는 적어도 네 개의 플레이트에서 세포를 용출시켰다. 여러 판에 다른 농도 또는 플레이트가 용출 세포 (예. 0.5 ml의 1 ml의 1.5 ml의, 4 판에 용출액을 3 ml의 씨앗)을 보장하기 위하여t 적어도 하나의 플레이트는 띄엄 띄엄 용출 세포 시딩된다. (- 2.0 X 10 5 부착 된 세포 즉, 약 1.0) 첨부 된 세포의 생장이 ~ 1 %에서 다음날 있는지 확인합니다.
주 : EC 콜로니가 다른 세포 유형에 의해 오염되지 않고 형성 할 수 있도록 세포가 부족한 도금 될 필요가있다. - 한 10cm 접시에 플레이트 FT 분율은 세포가 O / N을 복구 할 수 있습니다. 다음날 컨 플루 언트 100 % - 플레이트 (80)가 있는지 확인합니다. (-80 ° C) 250 μL 세포 동결 cryotube 미디어 및 액체 질소에 보관 다음날 세포를 동결. 주 : FT 분획 나중 단계에서 및 / 또는 절연 EC 클론 EC 유전자 발현 분석을위한 음성 대조구로 종양 세포 분리를 위해 사용될 수있다.
- 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. 10 일 - 식민지 7 후 형성하기 시작합니다. 작은 EC의 식민지가 빠르면 접시의 바닥에 미세 팁 마커와 식민지 일 3. 표시로 식별 할 수 있습니다.
- 비 특정 C를 쳤어요멸균을 200㎕ pippet 팁이 식별 된 콜로니 주변의 ELL.
3. 식민지 선택하여 복제의 반지
- 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. 7 일 - EC 순도는 약 5에서 LDL (DII-AC-LDL) 또한 확인할 수 있습니다. 10 ml의 EC 매체 당 LDL의 50 μl를 추가하고 3 부화 - 형광 현미경으로 세포를 확인하기 전에 4 시간.
참고 : 여러 LDL + EC 클론이 7 일 ~에서 관찰 할 수있다. - 크기가 5 ㎜ - 그들은 3의 직경에 도달하면 EC의 식민지를 수확 시작합니다. (최상의 결과를 위해 작은 LDL + 세포로 포장되어 큰 식민지를 선택합니다.)
- 복제 반지, 프리 코트 0.5 % 젤라틴으로 몇 6 웰 플레이트와 EC를 수확하기 전에. 대기음 젤라틴, 각 웰에 EC 미디어 2 ㎖를 추가하고, 필요할 때까지 인큐베이터에서 접시를 유지한다.
- 다른 세포 유형이 클로닝 링 내에 포획되지 않는다 확인 콜로니의 에지에 비 EC 긁어.
- 사용위상차 현미경 (10X 대물 또는 4X)를 배양 접시의 바닥에 미세한 팁 마커의 개요 EC 콜로니를 포함한 영역.
- PBS 10 mL로 판을 씻고 흡입 할 때 판에 PBS의 매우 얇은 층을 둡니다. (중요 : 소량 (~ 0.5 ㎖) PBS의 복제 링 절차를 수행하는 동안 살아있는 세포를 유지하는 것입니다 또한, 조직 접착제는 접착 물을 필요로한다.)
- 적절한 크기의 복제 링을 선택합니다. 반지를 데리러 해부 포셉 한 쌍을 사용하여 10 μL 피펫 팁으로 균등하게 복제 링에 조직 접착제의 작은 금액을 적용합니다.
참고 : 복제 반지에 조직 접착제 (작은 반지 ~ 0.2 μl를) 최소한의 양을 사용하고 있는지 조직 접착제가 좋은 밀봉을 보장하기 위해 바닥면 주위에 균일하게 확산되어 있는지 확인합니다. 과도한 조직 접착제는 열을 생성하고 세포를 죽일 수있다 필름을 형성한다. - EC 식민지를 통해 복제 링을 놓습니다. 부드럽게 리 접착제하기 위해 복제 링을 아래로 눌러접시에 겨. 식민지가 반지를 접착하기 전에 건조되지 않도록해야합니다.
- 즉시 복제 링에 효소 세포 분리 솔루션의 25 μl를 피펫과 ~ 1 분을 품어 또는 세포를 느슨하게 부착 될 때까지.
- 미리 예열 EC 미디어를 포함하는 6 웰 플레이트 잘 하나에 복제 링 드롭 현명한에 피펫 세포. (중요 : 세포를 분산 할 수있는 판 흔들지 마십시오; EC 꽉 클러스터에서 성장하는 것을 선호합니다.) 50 복제 반지를 세척 - 가능한 한 많은 세포를 수집하기 위해 100 μL EC 미디어와 같은 6 자에 모든 세척을 전송 .
- 10cm 접시에 일부 식민지 수확하기에 너무 작은 경우, 식민지 더 며칠 동안 성장하자, 10 ml의 신선한 미디어를 추가, 다시 복제 링 절차를 반복합니다.
- 10cm 조직 배양 접시에 그들을 확장하기 전에, 6 웰 플레이트의 3 우물에 세포를 100 % 합류 및 전송 - 80까지 6 웰 플레이트에서 수확 식민지를 성장. 오염 물질의 세포를 긁어. 반복필요한 경우 - 복제 링 절차의 또 다른 라운드 (3.10 3.5 단계). 확장 할 때 - (70 % ~ 60) 상대적으로 합류 세포를 유지합니다. EC는 너무 부족한 도금 경우 성장을 중지 할 수 있습니다.
- 등 외과, 염색, PCR에 의해 EC의 특징은 DIL-AC-LDL이 형광 및 외과 용 PE 또는 다른 형광 항체를 방해 할 수 있습니다.
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Representative Results
EC는 대부분의 성인 조직 (11)의 전체 세포 인구의 작은 부분을 나타냅니다. 그것은 완전히 세포 외 기질 (ECM) 및 결합 조직에서 EC의 최대 방출을 보장 단일 세포 현탁액으로 수확 된 조직을 소화하는 것이 중요하다. 우리의 경험에 의하면, CD31 매개 면역 자기 선택은 풍부한하지만 순수한 EC의 분수를 제공하며, 따라서, 또 다른 중요한 단계는 클로닝 링 (도 1)를 사용하여 EC 콜로니의 공동 정제 EC와 비 선택 / 팽창의 물리적 제거이다. 예를 들어, EC를 CD31 농축 때하는 것이 더 식민지 선택, 비 EC 빠르게 증식과 DIL-AC-LDL +와 DII-AC-LDL에 의해 계시 된 순수 EC 문화를 생산, EC과 혼합하지 않고 도금했다 - 인구 (그림 2A) . 컬럼 용출액은 낮은 밀도로 플레이 팅 하였다 그러나, EC 콜로니 SC 제거함으로써 상대적으로 적은 비 주변 EC와 성장피펫 팁 (그림 2B)와 강간. 확장 된 콜로니의 성장 및 순도는 또한 DIL-AC-LDL을 첨가하여 모니터링 할 수있다. 작은 EC의 식민지 CD31 매개 열 농축 (그림 2B, 상단 패널) 후 하루 일곱 ~에서 관찰 할 수있다. 선택 및 EC 콜로니, DIL-AC-LDL의 전개 후 - 세포가 제거되고, DIL-AC-LDL 섭취 (도 2B, 하부 패널)로 나타낸 바와 같이 세포 집단은 DIL-AC-LDL + EC를위한 고순도이다.
분리 방법은 일관된 결과, C3-태그에서 절제된 유방 종양 중 하나에서 파생 된 여러 클론을 생성 할 수 있는지 테스트하기 위해 (FVB / N C3 1 -tag) 마우스 또는 연령대 야생 형 FVB 생쥐에서 일반 유선을 분리하고 확장했다 (12). 각각의 TEC 정상 EC (NEC) 인구의 순도는 신중 순도를 확인하기 위해 분석되었다. 유동 세포 계측법 3 개의 독립적 인 샘플의 분석은 유니폼의 하나를 보여 주었다의 IgG 아이소 타입 컨트롤 (그림 3A)과 구별했다 메드 CD31 + 인구. 테스트 한 모든 네 EC 클론에서 CD31, Cdh5 (VE-cadherin의), CD133 및 VEGFR2 포함 EC 마커의 mRNA 발현은 음성 대조군으로 사용 하였다 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs에)보다 ~ 200에 7000 배 높았다 (그림 3B). 예상대로 MEFs에 비교했을 때, 모든 EC 클론은 중간 엽 마커 유전자 Col1a1 및 Tagln 거의 발견 할 수없는 수준을 나타냈다. 면역 형광 염색을 대표하는 TEC 클론의 모든 세포가 균일하게 CD31 + (그림 3C)는 것으로 나타났다. 또한, 이들 EC 클론들은 (도 3d)를 배양 한 후 내피 세포의 기능을 유지 나타내는 시험 관내에서 자발적인 용기와 같은 구조를 형성 할 수 있었다.
분리 방법은 상기의 Cdh5 CRE를 이용하여 검증 하였다 ZsGreen이
그림 1. 플로우 차트 및 EC 격리 절차의 개요.
그림 2. DIL-AC-LDL 라이브 문화에 비 EC를 오염 EC를 구별한다. (A) 단계의 대비와 EC를 보여주는 형광 이미지와 공동 고립 EC 식민지의 복제 링을 선택하지 않고 비 EC. (B) 위상차 및 아이솔레이션의 다른 단계에서 EC 콜로니의 형광 이미지. 점선은 boundari 표시DIL-AC-LDL + EC의 ES 및 주변 오염 세포. 화이트 화살촉은 피펫 팁으로 제거해야 EC 식민지 외부 비 EC를 나타냅니다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 복제 반지와 비 EC의 물리적 제거는 순수 및 기능 장기 EC 문화를 생성합니다. (A) 대표 FACS는 다른 EC 클론의 CD31 염색의 플롯을 점. 세 대표 샘플이 표시됩니다. 각각의 플롯에서 열린 검은 사각형은 CD31 + 인구를 설명합니다. IgG의 이소 타입은 음성 대조군으로 사용된다. 선택된 클론 TEC NEC 및 내피 유전자 발현의 (B) 측정. endothel의 mRNA 수준IAL 유전자 CD31, CD133, Cdh5 및 VEGFR2는 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)의 것과 상대를 표현하고 있으며, 중간 엽 유전자 Col1a1 및 Tagln의 mRNA 수준은 NEC-1과를 기준으로 표시됩니다. (C) 확장 TEC 클론의 대표적인 면역 염색. CD31은 녹색으로 표시되고, 핵 4'6'-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 파란색 염색. (D)를 Matrigel에 도금 다른 EC 클론에 의해 관 형성의 대표 이미지. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. EC는 Cdh5의 CRE에서 분리 : ZsGreen이
| 휴대폰 번호 | FACS 완충액 (μL) | CD31-PE 항체 (μL) |
| 1 × 10 (7) | (100) | |
| 2 × 10 7 | (200) | (6) |
| 3 × 10 (7) | (300) | 7 |
| 4 × 10 (7) | (400) | 8 |
| 5 × 7 | (500) | 9 |
| 6 × 10 (7) | (600) | (10) |
표 1. PE - 복합 항 CD31 항체의 볼륨은 다른 세포 수에 필요합니다.
| 휴대폰 번호 | FACS 완충액 (μL) | 안티 - PE 자기 마이크로 비드 (μL) | 1 × 10 (7) | (80) | (20) |
| 2 × 10 7 | (160) | (40) |
| 3 × 10 (7) | (240) | (60) |
| 4 × 10 (7) | (320) | (80) |
| 5 × 7 | (400) | (100) |
| 6 × 10 (7) | (480) | (120) |
표 2. 안티 - PE 마이크로 비드 볼륨은 다른 세포 수에 필요합니다.
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Discussion
때문에 순수 차 TEC의 문화, 인간 제대 정맥 EC (HUVEC) 13 상업적으로 이용 가능한 EC 라인 또는 기본 EC와 시험관 연구에서 많은 대체 TEC를 얻기에 어려움. 그러나, 정상 조직에서 이러한 EC의 인구는 정상적인 대응에서 크게 차이가 TEC에 대한 프록시 역할을 할 수있다. 예를 들어, TEC는 생체 내에서 표현형 및 기능적 이상이며, 이러한 이상 중 일부는 체외 14-18에서 전송 가능한 수있다. TEC는 비정상적인 성장, 이동성 및 분화 능력을 가지고 용기 같은 구조 16,19,20를 형성하는 CD31 + 종양 세포를 병합 할 수 있습니다. 배양 TEC 또는 레이저 캡처 마이크로 해부 종양 혈관을 사용하여 연구는 유전자 발현, 세포 유전 학적 및 후생 유전 학적 프로파일 12,18,21-23 정상 EC에서 해당 TEC의 일탈을 증명하고있다. 과거를 통해 종양 혈관 신생에 대한 우리의 이해를 심화에도 불구하고배양 차 TEC를 사용하여 몇 십 년, 거의 기능과 기계론의 연구를 사용할 수 있습니다.
EC는 1970 년대 초 24에 인간 제대 정맥에서 분리되었다. 이후 고립과 다른 인간과 마우스 조직에서 미세 혈관 EC의 배양은 건강과 질병 25-28 모두 내피 기능을 조사하기위한 강력한 도구를 제공하고 있습니다. 가장 EC 분리 프로토콜 세 가지 주요 단계를 포함한다 : 기계적 분해 또는 효소 소화 후, 단일 세포 현탁액을 얻는, 형광 또는 자성 중 마이크로 비드에 접합 된 내피 세포 특이 적 항체와 EC 라벨링 및 분류 셀을 사용 EC 인구 농축 또는 자기 열. 그러나, 특히 종양에서 마우스 EC, 단리는 인해 EC 생존 및 종양 세포 및 섬유 아세포를 포함하는 다른 세포 유형의 빈번한 오염 저수율 어려운 입증되었다. 또한, EC의 시험 관내 형질 드리프트 나로senchymal 유사 세포 (내피 - 투 - 중간 엽 전환, EndMT)는 정상 조직, 종양 및 재 프로그램 전구체에서 EC의 장기 배양을위한 추가 도전을 포즈.
10 일 문화 - TEC 분리 동안 주요 과제는 쉽게 일반적으로 7 ~ 후 나타나는 느린 성장 EC의 식민지를 outcompete 수있는 종양 세포에 의해 오염입니다. 또한, EC를 단리하기위한 일반적으로 사용되는 선별 마커 풍부 내피 세포에서 발현되는 CD31이지만 또한 조혈 세포를 표시하고 어떤 경우에는 종양 세포 아 집단 (20), (30)이다. EC에 대한 풍부하면서 또한, CD31 매개 면역 자기 열 선택은 결국 몇 구절 후 EC 문화를 인수 할 수있는 모든 단일 오염 세포를 제거 할 수 없습니다. 클로닝 링 단계를 추가하여, 하나의 선택은 이러한 오염 된 세포 유형의 클론 적으로 순수한 자유 유래 EC 개체군을 확장 할 수있다. 두 번째 과제는 장기 인 메인EndMT의 홍보없이 순수한 EC의 보수. EndMT 개발하는 동안, 혈관 기능 장애시 효과적으로 요약 할 수있다 발생, 배양 EC에서 31-33 (특히 TGFβ의 존재) 일반적이다. TGFβ 소스로서 작용할 수있는 세포 오염을 제거 EndMT을 최소화하기 위해, 항상 매체의 bFGF의 농도가 높은 고밀도로 배양 물을 유지하고, 유지한다. 우리가 최근에 도시 한 바와 같이, bFGF를는 평활근 액틴 (EndMT 마커) (34)의 TGFβ 구동 식으로 길항 EC 규격을 유지하는 것이 필수적이다.
"운명 매핑"기자 마우스에서이 방법론, EC의 격리를 사용하는 것은도 표시했다. 이들 마우스는 생체 내에 촬상 35을 필요 연구에서 특히 유용하다. 조혈 세포의 일부 라벨이 Cdh5의 CRE 생길 수 있으나 여기에 사용 ZsGreen이의 L / s의 / ℓ의 쥐를,이 모델은 독감 발생하는 비교적 빠르고 쉬운 방법을 제공orescent EC는 생체 내에서. 다른 EC 혈통 라벨링 모델 (Cdh5의 CRE / ERT2)이 충실 EC있을 것이다 floxed 기자 마우스 스트레인 (ZsGreen이 리터 / S / L)로 넘어와 비가 역적 (36, 37)을 표시 타목시펜 유도 마우스입니다 . CRE 유도 생쥐에서 형광 EC는 FACS를 사용하여 또는 본원에 서술 우리 방법론을 사용하여 정제 할 수있다.
EC는 같은 용기 (38, 39)에서 EC 사이에 존재할 수있는 다른 혈관 침대와 "내 용기"이질성에서 이기종입니다. 또한, 다른 증식 잠재력 EC의 계층은 정맥으로부터 격리 EC 집단에서 관찰되었으며, 40 (40)의 인구가 세포 분열을 넘어 클론 EC의 작은 분획은 계대 될 수있다. 따라서, 여기에 기술 된 방법의 제한 사항은 다음과 같습니다 : 혈관 벽에 거주하는이 높은 증식 EC의 1) 가능한 선택; 하나의 스펙과 2) 농축완전히 생체 내에서 총 EC 인구를 대표하지 않는 클론을 생성 할 수 동맥, 정맥, 또는 모세 혈관에서 파생 된 IFIC 혈관 하위 유형. 그럼에도 불구하고, 다중 클론 개체군 한 분리 과정에서 얻어 질 수있는 한, 이러한 방법은 종양 및 다른 조직 (12) 내에 존재하는 EC 이질성 유전자의 기능 분석을 위해 유용 할 수있다. 여기에 설명, 함께 촬영하는 것은 비 EC 오염없는 순수한 EC의 식민지를 생성하는 EC 분리 방법입니다. 분리 된 세포는 체외에서 기능 연구, 게놈 전체의 발현 프로파일 링, 종양 혈관 신생을 제어하는 새로운 경로의 분자 특성에 유용합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
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