Abstract
Células específicas do tumor isoladas de fresco endoteliais (TEC) pode ser usada para explorar mecanismos moleculares de angiogénese tumoral e servem como um modelo in vitro para o desenvolvimento de novos inibidores da angiogénese para o cancro. No entanto, a longo prazo expansão in vitro de células endoteliais de murino (CE) é um desafio devido à deriva fenotípica em cultura (transição endotelial-a-mesenquimal) e contaminação com não-CE. Isto é especialmente verdadeiro para o TEC que são prontamente outcompeted por fibroblastos co-purificada ou células de tumor em cultura. Aqui, um método de isolamento de alta fidelidade, que tira vantagem de enriquecimento imunomagnética acoplada com selecção de colónias e expansão in vitro é descrita. Esta abordagem gera frações CE puros que são totalmente livre de contaminação de células do estroma ou tumorais. Também é mostrado que traçou-linhagem Cdh5 CRE: ratinhos repórter / l ZsGreen L / S, utilizada com o protocolo aqui descrito, são uma ferramenta valiosa para verificar a célulapureza como as colônias isoladas CE destes ratos mostram durável e brilhante fluorescência ZsGreen em cultura.
Introduction
Células endoteliais (EC) são essenciais durante o desenvolvimento de tumores sólidos. Do início do interruptor angiogênico em tumores dormentes para divulgação e propagação de metástases em locais distantes, CE constituem as condutas que fornecem sangue, oxigênio e nutrientes para sustentar o crescimento do tumor 1. Como sugerido recentemente, CE também têm funções independentes de perfusão e formar um nicho que suporta o crescimento de células-tronco cancerígenas e outras células do estroma do tumor 2-5. Assim, altamente purificado CE (TEC) para a cultura in vitro específicos do tumor permite estudos funcionais de rotina que irá lançar luz sobre os mecanismos moleculares que medeiam a angiogênese do tumor e conversas cruzadas com células tumorais.
CE são altamente especializados, dependendo do tecido de origem 6. Devido à natureza heterogénea de diferentes tipos de tumores e o microambiente do tumor, TEC também pode exibir características únicas que reflectem uma especialização o específico de tumorf a vasculatura. Por exemplo, existe uma variabilidade notável nas assinaturas de expressão de genes em TEC isoladas de diferentes tipos ou graus de tumores 7,8. No entanto, freqüente co-purificação de não-CE, especialmente fibroblastos associados a tumores e células tumorais, com TEC pode confundir expressão de todo o genoma analisa. Estes tipos de células não desejadas são especialmente problemáticos em estudos que dependem de longo prazo expansão in vitro de culturas TEC.
Aqui descrito é um método de alta fidelidade, que produz consistentemente culturas puras CE de tumores e outros tecidos. Seguindo imunomagn�ica enriquecimento de frações da CE e remoção de co-purificado não-CE coluna, um passo de clonagem-ring adicional para capturar colônias CE puros é usado 9. Cada colônia podem ser expandidas em cultura para várias passagens sem o surgimento de contaminação não-CE. Este método também produz vários clones de CE de um único procedimento de isolamento, o qual é ideal para o estudo de endoheterogeneidade endotelial. Além disso, é mostrado que Cdh5 cre: / l ratos ZsGreen l / s repórter são uma ferramenta valiosa para gerar CE "mapeado-destino" e indelevelmente marcadas que manter ZsGreen fluorescência na cultura 10. Com pequenos ajustes para o protocolo, este método deve ser adaptável a diferentes tipos de tumores ou tecidos normais.
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Protocol
O protocolo a seguir é realizada de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Departamento de Medicina Laboratorial Animal da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.
1. Prepare os seguintes materiais e reagentes Antes da partida
- Prepare meios CE, completando 400 ml de baixo teor de glucose (1 g / L de D-glucose ou LG) de Dulbecco modificado por meio Eagle (DMEM) com 50 ml de soro fetal de bovino inactivado pelo calor, 50 mL de Nu-Soro IV, 5 ml de antibiótico-antimicótico, e o hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, heparina e os componentes do kit comercial.
- Preparar 500 ml de tampão FACS (0,5% de BSA e EDTA a 2 mM em PBS); filtrar através de um estéril 0,22 um copo do filtro.
- Esterilizar ou desinfectar dissecando bordo.
- Esterilizar pinos dissecção, tesoura cirúrgica e dissectores.
2. Isolamento CE (Dia 1, ~ 5 h)
- Euthanize rato com dióxido de carbono ou outros métodos sagacidade compatívelh Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) políticas.
Nota: Múltiplos tumores mamários que variam em tamanho (5 - 15 mm de diâmetro) pode se desenvolver em um único rato geneticamente modificado, como C3-tag, certifique-se de colher todos eles para o isolamento do TCE. Se estiver usando os tumores que são ortotopicamente enxertados em ratos, piscina, duas a três um centímetro 3 tumores para um único isolamento CE. Aqui usamos tumores mamários como uma demonstração, mas o protocolo pode ser modificado para outros tipos de tumores. - Desinfetar rato por aspersão ou limpando o rato lado ventral com uma ampla quantidade de 75% v / v de etanol.
- Ressecção de tumores com um par de tesouras e pinças usando técnicas assépticas em uma capa estéril ou em uma bancada limpa.
- Estique-se e fixar os membros dos ratos em uma placa de dissecação. Faça uma incisão na linha média ventral com a tesoura sem abrir o peritônio. Dissecar lateralmente entre a pele e o peritoneu para as glândulas mamárias em que os tumores são localizados.Não abra o peritônio.
- Excise único tecido do tumor das glândulas mamárias, deixando de fora as margens mamárias normais. Corte com cuidado tecidos não tumorais, como a pele e músculos, e coloque tumores dissecados em um tubo cônico, contendo 30 ml de DMEM-LG no gelo.
- Trazer amostras de tumores para capa de cultura de tecidos; lavar tecidos com estéril LG-DMEM 1 - 2 vezes.
- Tumores transferência do tubo cônico para um estéril cultura de tecidos de petri prato, adicione 2 ml de DMEM-LG no prato, e pique com um par de tesouras estéreis em pedaços <5 mm.
- Adicionar 5 ml de colagenase (banco = 2 mg / ml em solução salina equilibrada de Hank, daqui em diante HBSS), 1 ml de dispase (estoque = 2,5 U / mL em HBSS) e 75 ul de desoxirribonuclease (estoque = 1 mg / ml em PBS ) para dentro do prato de petri. O volume total é agora ~ 10 ml.
- Transferir a mistura de colagenase / tecido do prato de Petri para um tubo de tecido-Dissociator e executado em um Dissociator tecido durante 60 segundos duas vezes (pré-definido de dissociação PRogram no Dissociator: 1.270 Total de Rodadas por corrida). Incubar com luz agitando num agitador durante 75 min a 37 ° C.
- Filtro de tecido digerido através de um filtro de células de 100 mm ao longo de um tubo de 50 ml. Lavar o filtro com 5 ml de tampão de FACS para lavar quaisquer células restantes. Girar a 280 xg durante 5 min e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado sem perturbar o sedimento celular.
- Dilui-se 1 ml de tampão de lise de RBC estoque (10x) em 9 ml de água estéril. Lisar células vermelhas do sangue com 10 ml de tampão de lise (1x), e imediatamente girar 5 min a 280 x g. Nota: Esta etapa pode ser ignorada se pouco sangue é visível.
- Ressuspender em 10 ml de tampão de FACS. Misturar 10 ul de suspensão celular com 10 ul de azul de tripano e contagem de células vivas utilizando um hemocitómetro.
- Ressuspender as células em 10 ~ 7 células / 100 uL. Adicionar 10 ul de FcR bloco por 100 ul de suspensão de células, e incuba-se em gelo durante 10 min.
- Adicionar anticorpo CD31 anti-rato rato conjugado com PE de acordo. a Tabela 1 Incubar em gelo durante 10 - 15 minutos e o tubo de filme ocasionalmente.
- Adicionar 10 ml de tampão de SCAF e para o tubo de centrifugação a 280 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante cuidadosamente, e lava-se a pelete de células novamente com 5 mL de tampão de FACS. Centrifugar para sedimentar as células. Aspirar o sobrenadante sem perturbar sedimento celular.
- Adicionar tampão e anti-PE FACS microesferas de acordo com a Tabela 2 Incubar em gelo durante 10 -. 15 min. Tubo Flick ocasionalmente.
- Adicionar 10 ml de tampão de amostras e de rotação a 280 xg FACS durante 5 min; lavar uma vez com 5 mL de tampão de FACS e centrifugar novamente. Aspirar o sobrenadante sem perturbar pellet.
- Levar o volume até 300 ml em tampão de SCAF. Gire a 35 mm de células-filtro tampado tubo 5 min a 280 x g. Utilize tubos 2 e um volume maiores, se necessário.
- Configurar multistand magnética e colunas magnética na capa, uma coluna para fixar o separador e equilibrar a coluna com 2 mL de tampão de FACS.
- Aspirate o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 0,5 - 1 ml de tampão de FACS.
- Passar a suspensão de células através de uma coluna magnética equilibrada.
- Lava-se a coluna três vezes com 2 ml de tampão de FACS, e recolher o fluxo de passagem (FT) em um tubo de 15 ml (fracção FT).
- Aqui a coluna fora do separador e elui-se com 2 mL de tampão de FACS para outro tubo de 15 ml (fracção de eluato). Use êmbolo para assegurar que todas as células estão a sair da coluna. Repetir a eluição duas vezes mais com 2 ml de tampão de FACS de cada vez.
- Girar o eluato a 280 xg durante 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de CE.
- Igualmente dividir a fracção de eluato (~ 6 ml) em placas revestidas com gelatina de 10 cm. Para três tumores 1 3 cm, placa de células eluída em pelo menos quatro placas. Células Alternativamente, placa eluidas a diferentes concentrações em várias placas (por exemplo., De sementes de 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml e 3 ml do eluato em quatro placas) para garantir que umt menos uma placa de baixa densidade é semeada com células eluídas. Verificar que a confluência das células ligadas é a ~ 1% no dia seguinte (ou seja, aproximadamente 1,0 - 2,0 x 10 5 células ligadas).
Nota: As células têm de ser banhado escassa, de forma que podem formar colónias CE sem ser contaminado por outros tipos de células. - Placa fração FT em uma placa de 10 cm para permitir que as células recuperar O / N. Verificar que a placa é de 80 - 100% confluentes no dia seguinte. Congelar-se as células (-80 ° C) em 250 meios de congelamento de células em um ul cryotube e armazená-los em nitrogênio líquido no dia seguinte. Nota: fracção FT pode ser usado para isolamento de células de tumor numa fase posterior, e / ou como um controlo negativo para a análise dos clones isolados a expressão do gene da CE CE.
- Mudança de mídia a cada 2 - 3 dias. Colónias começam a se formar após 7 - 10 dias. As pequenas colónias CE pode ser identificado como o mais cedo dia 3. Marcar as colónias com um marcador de ponta fina na parte inferior do prato.
- Raspar não específica cells que cercam as colônias identificadas com um estéril 200 ul pippet ponta.
3. Colony Seleção Anéis Usando Clonagem
- Mudança de mídia a cada 2 - 3 dias. CE pureza pode ser verificada por LDL (DII-Ac-LDL) além de cerca de 5-7 dias. Adicionar 50 ul de LDL por 10 ml de meio CE e incubar por 3-4 horas antes de verificar as células em microscópio de fluorescência.
Nota: LDL Múltipla + clones CE pôde ser observada a ~ 7 dias. - Comece a colheita colônias CE quando atingem diâmetros de 3 - 5 mm de tamanho. (Escolha grandes colônias que são embalados com pequenas células de LDL + para obter melhores resultados.)
- Antes da colheita CE com anéis de clonagem, pré-coat algumas placas de 6 poços com 0,5% de gelatina. Aspirar gelatina, adicionar 2 ml de meio CE a cada poço, e manter as placas em uma incubadora até que seja necessário.
- Raspar não-CE nas bordas das colónias para se certificar não há outros tipos de células irá ficar preso entre o anel de clonagem.
- Usando ummicroscópio de contraste de fase (4x ou 10x objectivo), o contorno com um marcador de ponta fina na parte inferior da placa de cultura as áreas que continham colónias CE.
- Lava-se a placa com 10 ml de PBS e deixar uma camada muito fina de PBS na placa quando a aspiração. (Importante: uma pequena quantidade (~ 0,5 ml) de PBS vai manter as células vivas durante o procedimento de clonagem de anel, também, adesivo de tecido precisa de água para se relacionar.)
- Escolha um anel de clonagem de tamanho apropriado. Use um par de pinças de dissecação para pegar um anel, e com uma pipeta de ponta 10 ul aplicar uniformemente uma pequena quantidade de adesivo tecidual sobre o anel de clonagem.
Nota: usar apenas uma quantidade mínima (~ 0,2 mL para um pequeno anel) de adesivo de tecido em anéis de clonagem, e fazer adesivo de tecido certeza é se espalhar uniformemente ao redor da superfície do fundo para garantir uma boa vedação. Adesivo tecidual excessiva produz calor e faz filmes que podem matar as células. - Coloque o anel de clonagem sobre a colônia CE. Pressione suavemente para baixo o anel de clonagem para colar as ring sobre a placa. Certifique-se de que as colônias não estão secas antes de colar o anel.
- Imediatamente pipeta 25 ul de solução de separação celular enzimática para dentro do anel de clonagem e incubar ~ 1 min ou até que as células são frouxamente ligado.
- Pipetar as células no anel clonagem gota a gota, para um poço de uma placa de 6 poços contendo meio CE pré-aquecido. (Importante: Não agite a placa para dispersar as células; CE preferem crescer em clusters apertados.) Lave o anel de clonagem com 50 - 100 media CE ul para coletar tantas células quanto possível, e transferir todas as lavagens na mesma 6 poços .
- Se algumas colônias na placa de 10 cm são demasiado pequenas para colher, adicionar 10 ml de mídia fresco, deixar as colônias crescer por mais alguns dias, e repita o procedimento de clonagem anel novamente.
- Cresça colhidas colónias em placas de 6 poços até 80 - 100% confluentes, e transferência de células a 3 poços de uma placa de 6 cavidades, antes de se expandir-los em uma 10 cm prato de cultura de tecidos. Raspe as células contaminantes. Repitaoutra rodada de procedimento anel de clonagem (Passos 3,5-3,10), se necessário. Mantenha as células relativamente confluente (~ 60 - 70%) quando se expandindo. CE pode parar de crescer, se banhado muito escassa.
- Caracterizar CE por FACS, coloração, PCR, etc. Note que Dil-Ac-LDL é fluorescente e pode interferir com PE ou outros anticorpos fluorescentes para FACS.
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Representative Results
CE representam apenas uma fracção pequena da população total de células na maioria dos tecidos adultos 11. É, portanto, importante para digerir completamente o tecido colhido numa suspensão de célula única que assegura a libertação máxima de CE de matriz extracelular (ECM) e tecidos conjuntivos. Em nossa experiência, a seleção imunomagn�ica mediada por CD31 só fornece frações CE enriquecidos mas não puros; portanto, um passo crucial é a remoção física de co-purificado não-CE e seleção / expansão de colônias CE utilizando anéis de clonagem (Figura 1). Por exemplo, quando CD31 enriquecido CE foram semeadas sem mais seleção colônia, não-CE rapidamente proliferaram e misturados com CE, produzindo culturas CE impuros como revelado por Dil-Ac-LDL + e DII-AC-LDL - populações (Figura 2A) . No entanto, quando eluatos das colunas foram colocadas em placas a baixa densidade, as colônias CE cresceu com relativamente poucos circundante não-CE, que foram removidos por scestuprando com uma ponta de pipeta (Figura 2B). O crescimento e a pureza das colónias expandidas pode ser adicionalmente monitorizada por adição de Dil-Ac-LDL. As pequenas colónias CE pode ser observado no dia sete após ~ mediada por CD31 em coluna de enriquecimento (Figura 2B), painéis de topo. Após selecção e expansão de colónias CE, Dil-Ac-LDL - as células são eliminadas, e a população de células é altamente puro para Dil-Ac-LDL + CE, tal como indicado por absorção Dil-Ac-LDL (Figura 2B, painéis inferiores).
Para testar se o método de isolamento pode produzir resultados consistentes, múltiplos clones derivados de qualquer tumores mamários ressecados de C3-tag (N / C3 1 -tag FVB) ratos ou glândulas mamárias normais de ratos do tipo selvagem FVB pareados por idade foram isoladas e expandidas 12. A pureza de cada TCE e CE população normal (NEC) foi então cuidadosamente caracterizado para assegurar a pureza. A citometria de fluxo análise de três amostras independentes mostrou uma única, UNIFORMed CD31 + da população que era distinto do isotipo IgG de controlo (Figura 3A). A expressão de mRNA de marcadores CE, incluindo CD31, Cdh5 (VE-caderina), CD133, e VEGFR2 em todos os quatro clones EC testada foi de ~ 200 a 7.000 vezes mais elevada do que a de fibroblastos de rato embrionários (MEFs) que foi utilizado como um controlo negativo (Figura 3B). Como esperado, todos os clones CE expressaram níveis praticamente indetectáveis dos genes marcadores mesenquimais COL1A1 e Tagln quando comparado com MEFs. Coloração de imunofluorescência demonstraram que todas as células de um clone representativo do TCE foram uniformemente CD31 + (Figura 3C). Além disso, estes clones CE foram capazes de formar estruturas de vasos espontâneas semelhantes in vitro, indicando que retenham as funções endoteliais após a cultura (Figura 3D).
O método de isolamento foi ainda validado usando Cdh5 cre: ZsGreen
Fluxo Figura 1. Gráfico e Resumo do procedimento de isolamento CE.
Figura 2. Dil-Ac-LDL Distingue CE contaminem Não-CE em culturas vivas. Contraste (A) Fase e imagens fluorescentes mostrando CE e co-isolado não-CE, sem seleção de clonagem de anel de colônias da CE. (B) contraste de fase e imagens fluorescentes de colónias CE em diferentes fases de isolamento. As linhas pontilhadas marcar o boundaries de Dil-Ac-LDL + CE e células contaminantes circundantes. Setas brancas indicam não-CE fora de uma colônia CE, que deve ser removida com uma ponta de pipeta. Barras de escala representam 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. anéis de clonagem e remoção física de Não-CE Produção de longo prazo da CE culturas puras e funcionais. (A) FACS representativos dot parcelas de CD31 coloração de diferentes clones da CE. Três amostras representativas são mostradas. O retângulo preto aberto em cada parcela delineia a população CD31 +. Um isotipo IgG é utilizada como um controlo negativo. (B) Medição da expressão do gene endotelial em clones seleccionados TEC e NEC. Os níveis de ARNm de endotelialial genes de CD31, CD133, Cdh5, VEGFR2 e são expressas em relação aos fibroblastos embrionários de ratinho (MEFs), e os níveis de mRNA de genes mesenquimais COL1A1 e Tagln são expressas em relação aos da NEC-1. (C) coloração de imunofluorescência Representante de um clone TEC expandida. CD31 é mostrada em verde e núcleos são corados azul com 4'6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI). (D) Imagens representativas de formação do tubo por diferentes clones CE semeadas em Matrigel. Barras de escala representam 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. CE Isolado de Cdh5 cre: ZsGreen
| Número de celular | Tampão FACS (uL) | Anticorpo CD31-PE (ul) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
Tabela 1. conjugado com PE Volumes Anti-CD31 anticorpos necessário para diferentes números de células.
| Número de celular | Tampão FACS (ul) | Anti-PE microesferas magnéticas (ul) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
Tabela 2. Volumes Anti-PE microbead Necessário para diferentes números de células.
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Discussion
Devido às dificuldades na obtenção de culturas puras TEC primária, muitos estudos in vitro TEC substituto com linhas CE comercialmente disponíveis ou CE primário, como veia umbilical humano CE (HUVEC) 13. No entanto, essas populações da CE a partir de tecidos normais só podem servir como uma proxy para a TEC que diferem marcadamente dos seus homólogos normais. Por exemplo, a TEC são fenotipicamente e funcionalmente anormal in vivo e algumas destas alterações podem ser transmissível in vitro 14-18. TEC tem aberrantes de crescimento, migratório, e capacidades de diferenciação e pôde se coligar com células CD31 + de tumor para formar estruturas de navios-like 16,19,20. Estudos utilizando tanto cultivadas TEC ou captura a laser vasos tumorais microdissecadas demonstraram que desviam TEC partir CE normal na expressão genética, citogenética e perfis epigenéticos 12,18,21-23. Apesar de aprofundar nossa compreensão da angiogênese do tumor ao longo da últimadécadas, muito poucos estudos funcionais e mecanicistas usando TEC primário cultivadas estão disponíveis.
CE foram isolados de veias umbilicais humanos no início da década de 1970 24. Subsequente isolamento e cultivo de microvascular CE de outros tecidos humanos e mouse forneceu uma ferramenta poderosa para investigar funções endoteliais na saúde e na doença 25-28. A maioria dos protocolos de isolamento CE envolve três passos principais: a obtenção de uma suspensão de uma única célula após dissociação mecânica ou digestão enzimática, rotulagem CE com um anticorpo específico do endotélio que é conjugado a qualquer um fluoróforo ou magnéticos microesferas, e enriquecendo a população CE utilizando separação de células ou colunas magnéticas. No entanto, o isolamento de rato CE, especialmente de tumores, tem sido difícil, devido ao baixo rendimento de viável CE e contaminação frequente de outros tipos de células incluindo células de tumor e fibroblastos. Além disso, in vitro fenotípica deriva da CE em mimsenchymal células-like (endotelial-a-mesenquimal de transição, EndMT) coloca um desafio adicional para a cultura a longo prazo da CE a partir de tecidos normais, tumores e precursores reprogramadas.
O maior desafio durante o isolamento TEC é a contaminação por células tumorais, que podem facilmente outcompete as colônias de crescimento mais lento da CE que normalmente aparecem após ~ 7 - 10 dias em cultura. Além disso, um marcador de selecção utilizada para isolar CE CD31 é que é abundantemente expresso no endotélio, mas também marca células hematopoiéticas e em alguns casos de tumor subpopulações de células 20,30. Além disso, enquanto enriquece para CE, seleção da coluna imunomagnética mediada por CD31 não pode remover todos os contaminantes única célula que pode, eventualmente, assumir as culturas da CE após algumas passagens. Pela adição de um passo de clonagem de anel, é capaz de seleccionar e expandir populações puras CE clonalmente derivados que estão livres destes tipos de células contaminantes. Um segundo desafio é a longo prazo principalmanutenção de puro CE sem a promoção de EndMT. EndMT ocorre durante o desenvolvimento, podem ser recapitulado durante disfunção vascular, e é comum na cultivadas CE (em especial na presença de TGF-p) 31-33. Para minimizar EndMT, remover células contaminantes que podem actuar como uma fonte de TGF-p, manter culturas em altas densidades, e manter concentrações elevadas de bFGF nos meios de comunicação em todos os momentos. Como temos mostrado recentemente, bFGF é essencial para preservar a especificação CE, uma vez que antagoniza expressão TGF-driven de actina de músculo liso (um marcador EndMT) 34.
Usando esta metodologia, o isolamento da CE a partir de um repórter ratos "mapeado-destino" também foi mostrado. Estes ratos são particularmente úteis em estudos de imagem, onde são necessários 35 intravital. Embora alguns marcação das células hematopoiéticas pode ocorrer no CRE Cdh5: ZsGreen L / S / l ratinhos utilizados aqui, este modelo proporciona um método relativamente rápido e fácil para a geração de gripeorescent CE in vivo. Um modelo de rotulagem linhagem alternativa CE é um rato tamoxifeno induzível (Cdh5 cre / ERT2) cruzou com um mouse estirpe repórter floxed (ZsGreen l / s / l) que terá CE fielmente e irreversivelmente marcadas 36,37 . CE fluorescente dos ratinhos cre induzíveis podem também ser purificados utilizando FACS ou usando a metodologia que aqui se descrevem.
CE são heterogêneos em diferentes leitos vasculares e "intra-navio" heterogeneidade também podem existir entre CE, no mesmo navio 38,39. Além disso, uma hierarquia de CE com diferentes potenciais proliferativa tem sido observada em populações CE isoladas de veias, e uma pequena fração do clonal CE podem ser passadas para além de 40 duplicações população 40. Portanto, as limitações do método descrito aqui incluem: 1) possível selecção destes CE altamente proliferativo residente na parede do vaso; e 2) o enriquecimento de apenas uma especificaçãosubtipo vascular ific derivado de artérias, veias, ou capilares, o que pode produzir clones que não representam completamente a população total CE in vivo. No entanto, como múltiplas subpopulações clonais podem ser obtidos a partir de um procedimento de isolamento, este método pode ser útil para as análises genéticas e funcionais de CE heterogeneidade que existe no interior dos tumores e outros tecidos 12. Tomados em conjunto, aqui descrito é um método de isolamento CE que produz colônias puras CE desprovidas de contaminação não-CE. As células isoladas devem ser úteis para estudos in vitro funcionais, genome-wide expressão profiling e caracterização molecular de novos caminhos que controlam a angiogênese tumoral.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
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