Abstract
Taze izole edilmiş tümör spesifik endotel hücreleri (TEC), tümör anjiyogenez moleküler mekanizmaları araştırmak ve kanseri için yeni anjiyojenez inhibitörleri geliştirmek için bir in vitro model olarak hizmet etmek için de kullanılabilir. Ancak, fare endotel hücreleri (EC) in vitro genişleme uzun vadeli sebebiyle dışı AT ile fenotipik kültüründe sürüklenme (endotel-to-mezenkimal geçiş) ve kontaminasyona zordur. Bu hali hazırda kültür eş saflaştınldı fibroblast veya tümör hücreleri tarafından outcompeted edilir TEC için de geçerlidir. Burada, koloni seçimi ve in vitro genişleme birleştiğinde immünomanyetik zenginleşme yararlanır yüksek sadakat izolasyon yöntemi tarif edilmektedir. Bu yaklaşım stromal veya tümör hücrelerini kontamine tamamen ücretsizdir saf AK kesirler oluşturur. Aynı zamanda, bu soy takip Cdh5 CRE gösterilmiştir: protokolü ile birlikte kullanıldığında ZsGreen l / s / l raportör fareler, burada tarif edilen, hücrenin kontrol etmek için bir değerli bir araçtırBu farelerden izole AK koloniler olarak saflık kültüründe dayanıklı ve parlak ZsGreen floresan göstermektedir.
Introduction
Endotel hücreleri (EC), katı tümörlerin gelişimi sırasında gereklidir. Yaygınlaştırılması ve uzak bölgelerde metastaz tohumlama uykuda tümörlerde anjiyojenik anahtarın başlangıcından itibaren, AK tümör büyümesini 1. sürdürmek için kan, oksijen sağlayan kanallar ve besin oluştururlar. Son zamanlarda önerildiği gibi, AK perfüzyon bağımsız fonksiyonlara sahip ve kanser kök hücreleri ve diğer tümör stromal hücrelerinin 2-5 gelişimini destekler bir niş oluşturmaktadır. Böylece, son derece tümör spesifik in vitro kültür EC (TEC) tümör anjiyogenez ve tümör hücreleri ile çapraz konuşma aracılık eden yeni moleküler mekanizmaları ışık tutacak rutin fonksiyonel çalışmalar için izin verir saflaştırılmış.
AK kökenli 6 dokuya bağlı olarak son derece uzmanlaşmış. Farklı olması nedeniyle tümör tiplerinin heterojen ve tümör mikro ortama, TEC, aynı zamanda, bir tümör spesifik uzmanlık o yansıtan benzersiz özellikler gösterebilirdamarsal f. Örneğin, farklı tip veya tümörlerin 7,8 sınıflarda izole TEC gen ifade imzaları çarpıcı farklılıklar bulunmaktadır. Bununla birlikte, TEC olmayan EC, özellikle de tümör bağlantılı fibroblastlar ve tümör hücreleri, sık sık birlikte saflaştırma genom çapında sentezleme analiz karıştırabilir. Bu istenmeyen hücre tipleri TEC kültürlerinin in vitro genişlemesi uzun vadeli dayanan çalışmalarında, özellikle sorunludur.
Burada anlatılan sürekli tümörler ve diğer dokulardan saf AK kültürleri üreten bir yüksek sadakat yöntemidir. AK kesirler ve ko-saflaştırılmış non-EC çıkarılması immünomanyetik kolon zenginleştirme ardından, ilave bir klonlama halka adımı 9 kullanılan saf AK koloniler yakalamak için. Her koloni olmayan EC kirlenmesine neden ortaya çıkması olmadan birden geçişleri için kültürde genişletilebilir. Bu yöntem aynı zamanda endo çalışmaları için ideal olan tek bir izolasyon prosedürü, birden fazla AK klonlar verirendotel heterojenlik. ZsGreen l / s / l muhabiri fareler kültür 10 ZsGreen floresan korumak "kader-eşleştirilmiş" ve silinmez işaretli AK üretmek için değerli bir araçtır: Ayrıca, Cdh5 CRE gösterilmiştir. Protokol küçük ayarlamalar ile, bu yöntem, farklı tümör tiplerinin veya normal dokulara uyarlanabilir olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'nde Laboratuar Hayvanları Tıp Bölümü tarafından kurulan yönergelere göre yürütülür.
1. Başlamadan Önce Aşağıdaki Malzeme ve Reaktifler hazırlayın
- 400 mi, düşük glukoz ilave tarafından AT ortamı hazırlanması (1 g / L D-glikoz veya LG) Dulbecco'nun Modifiye 50 ml ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu, 5 mi antibiyotik antimikotik 50 mi Nu-serum IV ile Eagle ortamı (DMEM), ve ticari kiti hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1 ve heparin bileşenleri.
- 500 ml FACS tamponu (% 0.5 BSA ve PBS içinde 2 mM EDTA) hazırlanması; steril 0.22 mikron filtre fincan süzülür.
- Sterilize veya dezenfekte kurulu diseksiyon.
- Diseksiyon pimleri, cerrahi makas ve dissektörleri sterilize edin.
2. AK İzolasyon (Gün 1 ~ 5 saat)
- Karbon dioksit ya da diğer yöntemlerle uyumlu wit ile fare Euthanizeh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) politikaları.
Not: boyutu değişen Çoklu meme tümörleri (5 - 15 mm çapında), örneğin C3-etiketi olarak tek bir genetiği değiştirilmiş fare geliştirmek TEC izolasyonu için hepsini hasat emin olabilir. Tek bir AK izolasyonu için üç 1 cm 3 tümörlere orthotopically farelerde aşılanan tümörler, havuz, iki kullanıyorsanız. Burada bir göstergesi olarak meme tümörleri kullanımı, ancak protokol tümör tipleri için modifiye edilebilir. - Püskürtme veya% 75 h / h etanol içinde bol miktarda fare ventral yan silerek fare dezenfekte.
- Bir steril bir muhafaza içinde ya da temiz bir tezgah aseptik teknikler kullanılarak makas ve dissektörleri bir çift tümörlerin rezeke.
- Uzatın ve diseksiyon gemide farelerin uzuvlarını pin. Periton açmadan makas ile orta hat ventral kesi yapmak. Deri ve tümörler yer alır meme bezleri doğru periton arasında yana doğru parçalara ayır.Periton açmayın.
- Vergi sadece tümörün meme bezlerinin doku, normal meme marjları dışarıda bırakarak. Dikkatlice örneğin, deri ve kaslar gibi non-tümör dokuları keserek ve buz üzerinde LG-DMEM 30 ml ihtiva eden bir konik bir tüp içinde parçalara tümörleri yerleştirin.
- Doku kültürü kaputu tümör örnekleri getirin; 2 kez - Steril LG-DMEM 1 ile dokuları yıkayın.
- Steril doku kültürü petri konik tüp aktarın tümörleri, çanak LG-DMEM 2 ml ekleyin ve parçalar halinde steril bir makas <5 mm kıyma.
- PBS içinde dispase 1 ml (stok = Hank Dengelenmiş Tuz Çözeltisi içinde 2 mg / ml, HBSS anılacaktır) kolajenaz 5 ml (stok = HBSS 2.5 U / ml) ve deoksiribonükleaz 75 ul (stok = 1 mg / ml ) petri içine. Toplam hacmi şimdi ~ 10 ml'dir.
- (Önceden ayarlanmış ayrışma pr bir doku ayıracı tüp petri kollajenaz / doku karışımı aktarın ve iki kez 60 saniye boyunca bir doku dissociator çalıştırmakdissociator üzerinde Ogram: kaçak başına 1,270 toplam mermi). Işık 37 ° C 'de 75 dakika süre ile bir çalkalama çalkalayarak kuluçkalayın.
- Filtre 50 ml konik tüp üzerinde 100 mikron hücre süzgecinden doku sindirmek. FACS tamponu, 5 ml ile durulayın filtre kalan hücrelerin yıkayın. 5 dakika boyunca 280 xg'de Spin ve dikkatli hücre pelletini bozmadan süpernatant aspire.
- Steril su 9 ml stok RBC parçalama tamponu (10x) 1 ml seyreltilir. Hemen 10 liziz tamponu (1x) ml ile Lyse kırmızı kan hücreleri 280 x g'de 5 dakika dönerler. Not: az kan görünür ise, bu adım atlanabilir.
- FACS tampon, 10 ml içinde süspanse. Tripan mavisi 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın ve bir hemositometre kullanılarak canlı hücreleri sayın.
- ~ 10 7 hücre / 100 ul hücreleri tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonunun 100 ul başına FcR bloğunun 10 ul ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- Göre sıçan-anti-fare PE-konjuge CD31 antikoru ekle. Bazen 15 dakika ve fiske tüp - Tablo 1-10 buz üzerinde inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 280 x g'de tüp ve spin FACS tampon 10 ml ekleyin. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve FACS tamponu, 5 ml ile tekrar hücre pelletini yıkayın. Santrifüj pelet hücreleri. Rahatsız edici hücre pelet olmadan Süpernatant aspire.
- . Tablo 2'ye göre FACS tamponu ve anti-PE mikroboncukları ekleme 10 boyunca buz üzerinde inkübe - 15 dakika. Bazen Flick tüpü.
- 5 dakika boyunca 280 xg'de FACS tampon maddesi ve santrifüj örnekleri 10 ml ilave edilir; Yine FACS tamponu ve santrifüj 5 ml ile bir kez yıkanır. Rahatsız pelet olmadan Süpernatant aspire.
- FACS tampon 300 ul hacim kazandırın. G x 280 35 mikron hücre-süzgeç başlıklı tüp 5 dakika boyunca Spin. Gerekirse 2 tüpleri ve daha geniş bir hacim kullanın.
- Kaput manyetik multistand ve manyetik sütun ayarlama ayırıcı bir sütun takın ve FACS tamponu 2 ml sütun dengeye.
- AspiratFACS tampon 1 ml e - süpernatan ve 0,5 hücre pelletini.
- Dengelenmiş bir manyetik sütun üzerinden bir hücre süspansiyonu geçirin.
- FACS tamponu 2 ml sütun üç kez yıkayın ve 15 ml'lik bir tüp (FT fraksiyonu) akış-through (FT) toplar.
- Ayırıcı rahatsız sütun almak ve başka bir 15 ml tüp (Elüat fraksiyonu) içine FACS tampon, 2 ml ile elüte. Tüm hücreleri sütunda kapalı olduğundan emin olmak için piston kullanın. Her FACS tamponu 2 ml elüsyon iki kez daha tekrarlayın.
- 5 dakika boyunca 280 xg'de eluatın Spin.
- Süpernatantı ve AT medya 10 ml pelletini.
- Aynı şekilde Elüat kısmını bölmek (~ 6 mi) 10 cm jelatin kaplı tabaklara. Üç 1 cm3 tümörlerde levhası, en az dört plaka hücreler yıkandı. Çok plakalı farklı konsantrasyonlarda Alternatif olarak, plak elüte hücreler (örn.,, 0.5 ml, 1 mi, 1.5 mi, dört plakalar halinde, ayrılmış malzeme içinde 3 ml tohum) bir sağlamak içint az bir levha seyrek taşınan hücreleri ile tohumlanır. (- 2.0 x 10 5 ekli hücreler, yani yaklaşık 1.0) bağlı hücrelerin confluency ~% 1 ertesi gün olduğunu kontrol edin.
Not: EC koloniler, diğer hücre tipleri ile kirlenmiş olmadan meydana böylece hücreler, seyrek kaplama gerekir. - Bir adet 10 cm'lik çanak Plaka FT kesir hücreleri O / N kurtarmak izin. Ertesi gün birleştirilebilmeli% 100 - plaka 80 olup olmadığını kontrol edin. (-80 ° C) 250 ul hücre dondurma bir cryotube medya ve sıvı azot içinde saklayın ertesi gün hücreleri aşağı dondurun. Not: FT fraksiyon daha sonraki bir aşamada ve / veya izole AT klonlarının AT gen ekspresyon analizi için bir negatif kontrol olarak, tümör hücre izolasyonu için de kullanılabilir.
- 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek. 10 gün - Koloniler 7 sonra oluşturmaya başlar. Küçük AK kolonileri gibi erken çanak altındaki ince uçlu işaretleyici ile koloniler gün 3. Mark olarak tespit edilebilir.
- Non-spesifik c kazıyaraksteril 200 ul pippet ucu ile tanımlanan kolonileri çevreleyen arşın.
3. Colony Seçimi kullanma Klonlama Yüzükler
- 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek. 7 gün - EC saflığı yaklaşık en az 5, LDL (DII-Ac-LDL) eklenerek kontrol edilebilir. 10 ml AK ortamı başına LDL'nin 50 ul ekleyin ve 3 inkübe - floresan mikroskop altında hücrelerin kontrol etmeden 4 saat.
Not: Birden fazla LDL + AT klonları günde 7 ~ gözlenen olabilir. - Boyutu 5 mm - bunlar 3 çapları ulaştığında AT koloniler hasat başlayın. (En iyi sonuçlar için küçük LDL + hücreler ile paketlenir büyük koloniler seçin.)
- Klonlama halkaları, önceden-kaplama% 0.5 jelatin ile bir kaç 6 oyuklu plakalar ile AK hasat önce. Aspire jelatin, her iyi AT medya 2 ml ekleyin, ve gerektiği kadar bir kuluçka tabak tutun.
- Başka hiçbir hücre tipleri klonlama halkası içinde sıkışıp emin olmak için kolonilerin kenarlarında olmayan EC kazımak.
- Kullanmafaz-kontrast mikroskobu (10X 4X ya da objektif), kültür çanak altındaki ince uçlu işaretleyici ile anahat AK koloni içeren alanlar.
- 10 ml PBS ile plaka yıkanır ve aspire plaka PBS çok ince bir tabaka bırakmak. (Önemli: küçük bir miktar (~ 0.5 ml) PBS klonlama halka işlemi sırasında canlı hücreleri tutacak, aynı zamanda, doku yapıştırıcı yapıştırmak için suya ihtiyaç duyar.)
- Uygun boyutta bir klonlama halka seçin. Bir yüzük almak için diseksiyon forseps bir çift kullanın ve bir 10 ul pipet ucu ile eşit klonlama halkası üzerine doku yapıştırıcı küçük bir miktar uygulayın.
Not: klonlama halkalar üzerinde doku yapıştırıcı (küçük halka için ~ 0,2 ul) Sadece az miktarda kullanın ve emin doku yapıştırıcısı iyi sızdırmazlık sağlamak için alt yüzeyi etrafında eşit olarak yayılır olun. Aşırı doku yapıştırıcı ısı üretir ve hücreleri öldürebilir filmler oluşturur. - AK kolonisi üzerinde klonlama halkasını yerleştirin. Yavaşça ri tutkal klonlama halkasını bastırınplaka üzerine ng. Koloniler halka yapıştırma önce kurumuş olmadığından emin olun.
- Hemen klonlama halka içine enzimatik hücre dekolmanı çözeltisinin 25 ul pipetlemeyin ve ~ 1 dk inkübe veya hücreleri gevşek bağlanmış kadar.
- Önceden ısıtılmış EC ortamı ihtiva eden bir 6-yuvalı plakanın bir kuyuya klonlama halkası damla damla pipeti hücreleri. (Önemli: hücrelerini dağıtmak için plaka sallamayın; AK sıkı kümeler halinde büyümek için tercih ediyor.) 50 ile klonlama halkasını yıkayın - mümkün olduğunca çok sayıda hücreleri toplamak için 100 ul AK medya ve aynı 6-kuyuya tüm yıkar transferi .
- 10 cm çanak bazı koloniler hasat için çok küçük ise, koloniler daha birkaç gün büyümesine izin, 10 ml taze medya ekleyin ve tekrar klonlama halka prosedürü tekrarlayın.
- 10 cm'lik bir doku kültürü tabağına genişletmeden önce, bir 6-yuvalı plaka 3 çukurlara hücreler% 100 birleşmiş, ve transfer - 80 kadar 6-yuvalı plakalar içinde hasat koloniler büyütün. Kirletici hücreleri kazımak. TekrarlamaGerekirse - klonlama halka prosedürünün bir tur (3.10 3.5 Adımları). Genişletirken - (% 70 ~ 60) nispeten konfluent hücreleri tutun. AK Çok seyrek kaplama varsa büyüyen vermeyebilir.
- Vb FACS, boyanması, PCR tarafından EC karakterize Dil-Ac-LDL floresan ve FACS için PE veya diğer floresan antikorlarla engel olabilir unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AT en yetişkin dokularda 11 toplam hücre popülasyonunun sadece küçük bir bölümünü temsil etmektedir. Tam hücre dışı matrisin (ECM) ile bağ dokulardan EC maksimal salınmasını sağlayan tek bir hücre süspansiyonu içine hasat doku sindirimi önemlidir. Bizim tecrübelerimize göre, CD31 aracılı immünomanyetik seçim yalnızca zenginleştirilmiş değil saf AK kesirler sağlar; Bu nedenle, başka önemli bir adım klonlama halkaları (Şekil 1) kullanılarak AT kolonilerin ortak saflaştırılmış non-EC ve seçme / genişleme fiziksel çıkarılmasıdır. Örneğin, EC CD31 zenginleştirilmiş zaman ileri koloni seçimi olmayan AK hızla çoğaldı ve Dil-Ac-LDL + ve DII-AC-LDL ortaya koyduğu gibi saf olmayan AK kültürlerini üreten, EC ile iç içe olmadan ekildi - popülasyonları (Şekil 2A) . Kolon yıkamaları düşük yoğunlukta kaplandı, ancak, AT kolonileri sc ile çıkarıldı az sayıda çevreleyen, EC, büyüdübir pipet ucu (Şekil 2B) olan tecavüz. Genişletilmiş kolonilerin büyümesi ve saflık, daha Dil-Ac-LDL ilave edilerek izlenebilir. Küçük AT koloniler CD31 aracılı sütun zenginleştirme (Şekil 2B, üst paneller) gün sonra yedi ° 'de görülmektedir. Seçimi ve AK kolonilerinin, Dil-Ac-LDL genişleme sonrası - hücreler ortadan kalkar ve Dil-Ac-LDL alımı (Şekil 2B, alt paneller) tarafından belirtildiği gibi, hücre popülasyonu Dil-Ac-LDL + EC için son derece saftır.
Izolasyon yöntemi tutarlı sonuçlar, C3-etiketinden rezeke meme tümörlerinin türetilen birden klonlar üretebilir eğer test etmek için (FVB / N C3 1 -TAg) fareler veya yaştaki wild-tip FVB farelerin normal meme bezleri izole ve genişletilmiştir 12. Her TEC ve normal EC (NEC) nüfus saflığı sonra dikkatlice saflığı sağlamak için karakterize edildi. Akış sitometri üç bağımsız numunelerin analizleri UNIFOR, tek gösterdiIgG izotop kontrolleri (Şekil 3A) farklı olduğu med CD31 + nüfus. Test edilen bütün dört EC klonlarda CD31, Cdh5 (VE-kaderin), CD133 ve VEGFR2 kapsayan AT belirteçleri, mRNA ekspresyon, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) daha ~ 200 7000 kat daha fazlaydı (Şekil 3B). Beklendiği gibi MEF'ler göre, bütün AT klonlar mezenkimal marker genleri COL1A1 ve Tagln yaklaşık belirlenemeyen seviyelerde ifade edilmiştir. Immünofloresan boyama temsili bir TEC klon tüm hücreler eşit CD31 + (Şekil 3C) olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bu EC klonları (Şekil 3B) kültürden sonra endotel fonksiyon korumak gösteren in vitro kendiliğinden damar-benzeri yapılar oluşturmak için mümkün.
Izolasyon yöntemi daha Cdh5 CRE kullanılarak doğrulandı: ZsGreen
Şekil 1. Akış Şeması ve AK İzolasyon Prosedür Bakış.
Şekil 2. Dil-Ac-LDL Canlı Kültürlerde Olmayan EC kirletilmesi gelen AK ayırt eder. (A) Faz kontrast ve AK gösteren floresan görüntüler ve ortak izole AK kolonilerin klonlama halka seçimi olmadan olmayan AK. (B) Faz kontrast ve izolasyon farklı aşamalarında AK kolonilerinin floresan görüntüler. Noktalı çizgiler boundari işaretiDil-Ac-LDL + EC es ve çevresindeki kirlenmesine neden olan hücreleri. Beyaz ok uçları, bir pipet ile kaldırılması gerektiğini EC kolonisi dışında olmayan EC göstermektedir. Ölçek çubukları 100 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Klonlama Halkalar ve Non-EC Fiziksel Kaldırma Saf ve Fonksiyonel Uzun vadeli AT Kültürler üretin. (A) Temsilcisi FACS farklı AT klonlarının CD31 boyanma araziler nokta. Üç temsilci örnekler gösterilmiştir. Her arsa açık siyah bir dikdörtgen CD31 + nüfusu özetliyor. Bir IgG izotop, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Seçilen NEC ve TEC klonlar endotel gen ifadesinin (B) Ölçüm. Endotelinde mRNA seviyeleriial genler CD31, CD133, Cdh5 ve VEGFR2 fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) kişilerce nazaran ifade edilir, ve mezenkimal genleri COL1A1 ve Tagln mRNA seviyeleri, NEC-1 kişilerce nazaran ifade edilir. (C) genleşmiş TEC klonunun Örnek immünofloresan boyama. CD31 yeşil gösterilir ve çekirdekler 4'6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), mavi lekeli. (D) Matrigel kaplı Farklı AT klonlar tarafından tüp oluşumu Örnek görüntüler. Ölçek çubukları 100 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. EC Cdh5 CRE İzole: ZsGreen
| Hücre numarası | FACS tamponu (uL) | CD31-PE antikoru (ul) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
Tablo 1. PE-konjuge anti-CD31 Antikor Birimleri Farklı Hücre Numaraları için gereklidir.
| Hücre numarası | FACS tamponu (ul) | Anti-PE manyetik mikro boncuklar (ul) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
Tablo 2. Anti-PE microbead Birimleri Farklı Hücre Numaraları için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nedeniyle olarak saf birincil TEC kültürleri, insan göbek damar EC (HUVEC), 13 gibi ticari olarak temin AT hatları veya primer EC ile in vitro çalışmalar, birçok ikame TEC elde zorluklar. Ancak, normal dokulardan bu AK popülasyonları sadece normal benzerlerinden belirgin farklılık TEC için bir vekil olarak hizmet edebilir. Örneğin, TEC in vivo fenotipik ve fonksiyonel anormal ve bu anormalliklerin bazıları, in vitro 14-18 yılında iletilebilir olabilir. TEC anormal büyüme, göç ve farklılaşma yeteneklerine sahip ve damar benzeri yapılar 16,19,20 oluşturmak için CD31 + tümör hücreleri ile kaynasabilir. Kültürlü TEC veya lazer yakalama mikro-disseke tümör damarları kullanarak çalışmalar, gen ifadesi, sitogenetik ve epigenetik profillerinin 12,18,21-23 normal AK'nin bu TEC sapmayın göstermiştir. Geçmişte üzerinde tümör anjiyogenezinde anlayışımızı derinleştirmek rağmenkültürlü birincil TEC kullanarak birkaç on yıl, çok az fonksiyonel ve mekanik çalışmalar mevcuttur.
AK başında 1970'lerin 24'ünde insan umbilikal damarlar izole edilmiştir. Sonradan izolasyon ve diğer insan ve fare dokularından mikrovasküler EC kültür sağlık ve hastalık 25-28 hem endotel fonksiyonları araştırmak için güçlü bir araç sağlamıştır. En AT izole etme protokolleri şu üç ana aşama içerir: mekanik ayrılma veya enzimatik sindirimden sonra tek bir hücre süspansiyonu elde etmek, bir florofor ya da manyetik ya da mikro-konjüge edilir, endotel spesifik antikor ile EC etiketleme, ve sıralama hücre kullanarak AT nüfus zenginleştirmek ya da Manyetik sütunlar. Bununla birlikte, özellikle de, tümörlerin fare EC izolasyonu nedeniyle uygulanabilir EC ve tümör hücreleri ve fibroblastlar gibi diğer hücre tipleri arasında sık sık kirlenme düşük verim zor olduğu kanıtlanmıştır. Buna ek olarak, AT in vitro fenotipik sürüklenme beni içinesenchymal-benzeri hücreler (endotelyal-to-mezenkimal geçiş EndMT), normal dokularda, tümörler ve yeniden programlanması prekürsörlerden AT uzun süreli kültür için ek bir zorluk teşkil etmektedir.
10 gün kültürde - TEC izolasyonu sırasında büyük zorluk kolayca genellikle ~ 7 sonra görünür yavaş büyüyen AK koloniler outcompete olabilir tümör hücreleri tarafından kirliliktir. Buna ek olarak, EC izole edilmesi için yaygın olarak kullanılan bir seleksiyon markör bol endotel ifade edilir CD31 değil, aynı zamanda hematopoietik hücrelerin işaretler ve bazı durumlarda tümör hücre alt 20,30 ödevi. EC zenginleştirirken Dahası, CD31 aracılı immünomanyetik sütun seçimi sonunda birkaç pasaj sonra AK kültürleri üzerinden alabilir her kirlenmesine neden hücreyi kaldıramazsınız. Bir klonlama halka adımını ekleyerek, birini seçin ve bu kirletici hücre tiplerinin ücretsiz saf klonal kaynaklı EC popülasyonlarını genişletmek mümkün değildir. İkinci zorluk, uzun vadeli ana olduğunuEndMT tanıtımı olmadan saf EC Bakým. EndMT gelişimi sırasında, vasküler fonksiyon bozukluğu sırasında değinmeyecek edilebilir oluşur ve kültürlenmiş EC'de 31-33 (özellikle TGFβ varlığında) yaygındır. Bir kaynak TGFβ olarak hareket edebilir kirletici hücreleri çıkarmak, EndMT en aza indirmek için, her zaman ortam bFGF yüksek konsantrasyonlarda yüksek yoğunluklarda kültürleri tutmak ve korumak. Yakın zamanda gösterildiği gibi, bFGF bu düz kas aktin (bir EndMT belirteci) 34 TGFβ tahrikli ekspresyonunun antagonize AT özelliklerini korumak için esastır.
Bir "kader-eşleştirilmiş" muhabiri farelerden alınan bu metodoloji, AB izolasyonu kullanmak da gösterilmiştir. Bu fareler, intravital görüntüleme 35 gerekli olan çalışmalarda özellikle yararlıdır. Hematopoietik hücrelerin bir markalama Cdh5 CRE oluşabilir, ancak: Burada kullanılan ZsGreen l / s / l fareler, bu model grip üretilmesi için nispeten hızlı ve kolay bir yöntem temin etmektedirFlüoresan AK in vivo. Alternatif AK soy-etiketleme modeli (Cdh5 CRE / ERT2) sadakatle EC olacak floxed muhabiri fare suşu (ZsGreen l / s / l) ile geçti ve geri dönüşümsüz 36,37 işaretlenmiş bir tamoksifen indüklenebilir fare . Uyarılabilir cre farelerden Floresan AK FACS kullanılarak ya da burada tarif metodoloji kullanılarak saflaştırılabilir.
AK aynı kapta 38,39 içinde EC arasında var olabilecek farklı vasküler yatak ve "içi damar" heterojenite genelinde heterojendir. Buna ek olarak, farklı proliferatif potansiyeli olan EC bir hiyerarşisi damarlar izole EC popülasyonlarında gözlenmiştir ve 40 nüfusu 40 çiftleştirmeyi ötesinde klonal EC küçük bir kısmı geçişli olabilir. Bu nedenle, burada açıklanan yöntemin sınırlamalar şunlardır: damar duvarında ikamet eden bu yüksek proliferatif AT 1) olası seçimi; Sadece bir spec ve 2) zenginleştirmeTamamen in vivo toplam AK nüfusu temsil etmemektedir klonlar üretebilir arterler, venler, ya da kılcal damarları türetilen IFIC vasküler alt tipi. Bununla birlikte, birden fazla klonal alt popülasyonlar, bir izolasyon prosedürü elde edilebilir, bu yöntem, tümör ve diğer dokular 12 içinde var AT heterojenite fonksiyonel ve genetik analizler için yararlı olabilir. Burada anlatılan, birlikte ele alındığında olmayan EC kirlenmesine neden yoksun saf AK koloniler üreten bir AT izolasyon yöntemidir. İzole edilen hücreler in vitro fonksiyonel çalışmalar, genom çapında ekspresyon profili ve tümör angiogenesisi kontrol yeni yolların moleküler karakterizasyonu için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C.
- Dudley, A. C.
- Aird, W. C.
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
