Abstract
Nylig isolerte tumor-spesifikke endotelceller (TEC) kan brukes til å utforske molekylære mekanismer av tumor angiogenese, og tjener som en in vitro modell for å utvikle nye angiogeneseinhibitorer for kreft. Imidlertid er langvarig in vitro ekspansjon av murine endotelceller (EC) utfordrende på grunn av fenotypisk drift i kultur (endotelial-til-mesenchymale overgang) og forurensning med ikke-EC. Dette gjelder spesielt for TEC som lett utkonkurrert av ko-renset fibroblaster eller tumorceller i kultur. Her er en high fidelity isolasjon metode som utnytter immunomagnetisk berikelse kombinert med kolonien utvalg og in vitro ekspansjon beskrevet. Denne fremgangsmåten genererer rene EC fraksjoner som er helt fri for kontaminerende stromale eller tumorceller. Det er også vist at avstamning-spores Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter mus, brukt med protokollen beskrevet her, er et verdifullt verktøy for å verifisere mobilrenhet som de isolerte EC kolonier fra disse musene viser holdbar og strålende ZsGreen fluorescens i kultur.
Introduction
Endotelceller (EC) er viktig i utviklingen av faste tumorer. Fra initiering av den angiogene bryter i sovende tumor til formidling og såing av metastaser i fjerne områder, EC danne ledningene som gir blod, oksygen og næringsstoffer for å opprettholde en tumorvekst. Som nylig foreslått, EC har også perfusjon-uavhengige funksjoner, og danner en nisje som støtter veksten av kreft stamceller og andre tumor stromale celler 2-5. Dermed høyt renset tumor-spesifikke EC (TEC) for in vitro kultur åpner for rutine funksjonelle studier som vil kaste lys over nye molekylære mekanismer som medierer tumorangiogenese og krysstale med tumorceller.
EC er svært spesialiserte avhengig av vevet opprinnelses 6. På grunn av den heterogene karakter av forskjellige tumortyper og svulsten mikromiljøet, kan også vise TEC unike egenskaper som gjenspeiler en tumorspesifikke fordypninger of blodkar. For eksempel er det påfallende variasjon i genekspresjonssignaturer i TEC isolert fra ulike typer eller grader av svulster 7,8. Imidlertid kan hyppig co-rensning av ikke-EC, spesielt tumorassosierte fibroblaster og tumorceller, med TEC forvirre genom-wide ekspresjon analyser. Disse uønskede celletyper er spesielt problematisk i studier som er avhengige av langsiktige in vitro utvidelse av TEC kulturer.
Beskrevet her er en high-fidelity metode som konsekvent produserer rene EF kulturer fra svulster og andre vev. Etter immunomagnetisk kolonne berikelse av EF-fraksjoner og fjerning av co-renset non-EC, til en ekstra kloning-ring trinn fange rene EF kolonier brukes 9. Hver koloni kan ekspanderes i kultur for flere passasjer uten at det oppstår forurensende ikke-EC. Denne metode gir også flere EC kloner fra en enkelt isoleringsprosedyren, som er ideelt for studiet av endothelial heterogenitet. I tillegg er det vist at Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter mus er et verdifullt verktøy for å generere "skjebne-kartlagt" og uutslettelig merket EC som opprettholder ZsGreen fluorescens i kultur 10. Med mindre justeringer i protokollen, skal denne metoden kunne tilpasses forskjellige typer svulst eller normalt vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll er utført i henhold til retningslinjer fastsatt av Institutt for laboratorie Animal Medicine ved University of North Carolina i Chapel Hill.
1. Forbered følgende materiale og reagenser Før start
- Klargjør EC media ved å supplere 400 ml lav glukose (1 g / l D-glukose eller LG) Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 50 ml varme-inaktivert føtalt bovint serum, 50 ml Nu-serum IV, 5 ml antibiotika-antimykotisk, og hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, og heparin komponenter fra kommersielt sett.
- Forbered 500 ml FACS-buffer (0,5% BSA og 2 mM EDTA i PBS); filtreres gjennom et sterilt 0,22 um filter koppen.
- Steriliser eller desinfisere dissekere bord.
- Sterilisere disseksjon pins, kirurgisk saks, og dissectors.
2. EF Isolation (dag 1, ~ 5 timer)
- Avlive mus med karbondioksid eller andre metoder kompatibel viddh Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) politikk.
Merk: Flere mammatumorer varierer i størrelse (5 - 15 mm i diameter) kan utvikle seg i en enkelt genmodifisert mus som C3-tag, sørg for å høste dem alle for TEC isolasjon. Hvis du bruker svulster som orthotopically innpodet i mus, basseng to til tre 1 cm 3 svulster for en enkelt EC isolasjon. Her bruker vi mammatumorer som en demonstrasjon, men protokollen kan modifiseres for andre typer svulster. - Desinfiser mus ved sprøyting eller tørke av musen ventral side med rikelig mengde på 75% v / v etanol.
- Resect tumorer med en saks og dissectors ved hjelp av aseptisk teknikk i en steril hette eller på en ren benk.
- Strekk ut og pin lemmer av mus på en dissekere bord. Lag en midtlinjen ventral snitt med saks uten å åpne peritoneum. Dissekere lateralt mellom huden og bukhinnen mot melkekjertlene hvor svulster er plassert.Ikke åpne peritoneum.
- Vesenet bare svulstvev fra melkekjertlene, drar ut vanlige melke marginer. Skjær forsiktig av ikke-tumor vev som hud og muskler, og plassere dissekert svulster i et konisk rør som inneholder 30 ml LG-DMEM på is.
- Ta tumorprøver til vevskultur hette; Vask vev med sterile LG-DMEM 1 - 2 ganger.
- Overføring av svulster fra den koniske rør til et sterilt vev-kultur petriskål, tilsett 2 ml LG-DMEM i fatet, og hakke med et par av steril saks i biter <5 mm.
- Tilsett 5 ml av kollagenase (lager = 2 mg / ml i Hanks Balanced Salt Solution, heretter HBSS), 1 ml dispase (lager = 2,5 U / ml i HBSS) og 75 mL av deoksyribonuklease (lager = 1 mg / ml i PBS ) i petriskål. Totalt volum er nå ~ 10 ml.
- Overfør collagenase / vev blanding fra petriskålen til et vev-dissociator rør og kjørt på en vev dissociator i 60 sek to ganger (forinnstilt pr dissosiasjonseismogrammet på dissociator: 1,270 totale runder per løp). Inkuber med risting lys på en ristemaskin i 75 minutter ved 37 ° C.
- Filter fordøyd vev gjennom en 100 um celle sil over et 50 ml konisk rør. Skylling filter med 5 ml FACS-buffer for å vaske de gjenværende celler. Rotere ved 280 xg i 5 minutter og forsiktig aspirer supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Fortynn 1 ml av lager RBC lyseringsbuffer (10x) i 9 ml sterilt vann. Lyse røde blodceller med 10 ml lyseringsbuffer (1 x), og umiddelbart spinne 5 min ved 280 x g. Merk: Dette trinnet kan hoppes over hvis lite blod er synlig.
- Resuspender i 10 ml FACS-buffer. Bland 10 ul av cellesuspensjonen med 10 ul av trypanblått, og telle levende celler ved hjelp av et hemocytometer.
- Suspender cellene på ~ 10 7 celler / 100 mL. Tilsett 10 mL av FcR blokk per 100 pl cellesuspensjon, og inkuber på is i 10 min.
- Legg rotte-anti mus PE-konjugert CD31 antistoff i henhold. Tabell 1 Inkuber på is for 10 - 15 min og flick rør av og til.
- Tilsett 10 ml FACS-buffer til røret og sentrifugering ved 280 xg i 5 minutter. Fjern forsiktig supernatanten, og vask cellepelleten på nytt med 5 ml FACS-buffer. Sentrifuger til pellet celler. Aspirer supernatanten uten å forstyrre cellen pellet.
- Legg FACS-buffer og anti-PE mikroperler i henhold til tabell 2 Inkuber på is i 10 - 15 min.. Flick rør av og til.
- Tilsett 10 ml FACS-buffer og sentrifuge prøver ved 280 xg i 5 min; vaskes en gang med 5 ml FACS-buffer og sentrifuger igjen. Aspirer supernatanten uten forstyrrende pellet.
- Bringe volumet til 300 pl i FACS-buffer. Spinne gjennom 35 mikrometer celle-sil avkortet tube 5 min ved 280 x g. Bruk 2 rør og et større volum hvis nødvendig.
- Sett opp magnetisk multistand og magnetiske kolonner i panseret, feste en kolonne til separator og likevekt kolonnen med 2 ml FACS buffer.
- Aspirate supernatanten og resuspender pelleten i 0,5 celle - 1 ml FACS-buffer.
- Passere cellesuspensjonen gjennom den ekvilibrerte magnetiske kolonnen.
- Vask kolonnen tre ganger med 2 ml FACS-buffer, og samle gjennomstrømning (FT) i et 15 ml rør (FT fraksjon).
- Ta kolonne av separatoren og elueres med 2 ml FACS-buffer i et annet 15 ml rør (eluat fraksjon). Bruk stempelet for å sikre at alle cellene er av kolonnen. Gjenta eluering to ganger med 2 ml FACS-buffer hver gang.
- Spinn eluatet ved 280 xg i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml EC media.
- Like dele Eluatfraksjonen (~ 6 ml) i 10 cm gelatin-belagte retter. For tre 1 cm 3 tumorer, plate eluert celler i minst fire plater. Alternativt plate eluert celler ved forskjellige konsentrasjoner i flere plater (f.eks., Frø 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, og 3 ml av eluatet i fire plater) for å sikre at ent minst én plate er tynt sådd med eluerte celler. Kontroller at sammenflytning av de festede celler er i ~ 1% neste dag (dvs. ca. 1,0 - 2,0 X 10 5 festede celler).
Merk: Cellene må være belagt sparsom slik at EF-kolonier kan danne uten å bli forurenset av andre celletyper. - Plate FT fraksjon i en 10 cm tallerken å la cellene gjenopprette O / N. Kontroller at platen er 80 - 100% konfluente neste dag. Fryse ned cellene (-80 ° C) i 250 mL celle frysing media i en kryorør og lagre dem i flytende nitrogen neste dag. Merk: FT fraksjon kan brukes for tumorcelleisolasjon ved et senere tidspunkt og / eller som en negativ kontroll for EC genekspresjon analyse av de isolerte klonene EC.
- Endre media hver 2 - 3 dager. Kolonier begynne å danne etter 7 - 10 dager. Små EF kolonier kan identifiseres så tidlig som dag 3. Mark koloniene med en fin-spissen markør på bunnen av fatet.
- Skrap av ikke-spesifikk calen rundt de identifiserte kolonier med en steril 200 mL pippet tips.
3. Colony valg med Kloning Rings
- Endre media hver 2 - 3 dager. EC renhet kan kontrolleres ved LDL (Dil-Ac-LDL) tillegg på ca 5 - 7 dager. Tilsett 50 mL av LDL per 10 ml EC medium og inkuberes 3 - 4 timer før du sjekker cellene i henhold fluorescens mikroskop.
Merk: Multiple LDL + EF-kloner kunne observeres på ~ dag 7. - Begynn høsting EC kolonier når de når diameter på 3 - 5 mm i størrelse. (Velg store kolonier som er pakket med små LDL + celler for best resultat.)
- Før høsting EC med kloning ringer, pre-coat noen få seks-brønns plater med 0,5% gelatin. Aspirer gelatin, tilsett 2 ml EC media til hver brønn, og holde platene i en inkubator inntil nødvendig.
- Skrap av ikke-EU på kantene av koloniene å sørge for at ingen andre celletyper vil bli fanget innenfor kloning ring.
- Ved hjelp av enfasekontrastmikroskop (4X eller 10X objektiv), skissere med en fin spiss markør på bunnen av kulturskålen de områder som inneholder EC-kolonier.
- Vask platen med 10 ml PBS og la et meget tynt lag av PBS i platen ved aspirering. (Viktig: en liten mengde (~ 0,5 ml) av PBS vil holde cellene i live i løpet av kloning-ring prosedyre, også må vevlimet vann for å binde.)
- Velge en klonings ring av passende størrelse. Bruk et par dissekere pinsett til å plukke opp en ring, og med en 10 mL pipette tips jevnt bruke en liten mengde av vev lim på kloning ring.
Merk: Bruk bare minimalt (~ 0,2 mL for en liten ring) av vev lim på kloning ringer, og sørg vevlimet er spredt jevnt rundt bunnen overflaten for å sikre god tetting. Dreven vevlimet produserer varme og danner filmer som kan drepe celler. - Plasser kloning ring over EC kolonien. Trykk forsiktig ned kloning ring å lime ring på platen. Sørg for at koloniene ikke er tørket ut før liming ringen.
- Umiddelbart pipettér 25 ul av enzymatisk celle løsgjøring løsning i kloningsringen og inkuber ~ 1 min eller inntil cellene er løst festet.
- Pipettér celler i kloningsringen dråpevis inn i en brønn i en 6-brønns plate inneholdende pre-varmet EC media. (Viktig: Ikke rist plate for å spre celler, EC foretrekker å vokse i trange klynger.) Vask kloning ring med 50 - 100 ul EF media å samle så mange celler som mulig, og overføre alle vasker i samme 6-brønn .
- Hvis noen kolonier i 10 cm fatet er for små til å høste, tilsett 10 ml fersk medie, la koloniene vokse for noen flere dager, og gjenta kloning ring prosedyren på nytt.
- Grow høstet kolonier i 6-brønns plater inntil 80-100% konfluent, og overføre cellene til 3 brønner i en 6-brønns plate, før utvide dem i en 10 cm vevskulturskål. Skrape av forurensende celler. Gjentaen ny runde av kloning ring prosedyre (trinn 03.05 til 03.10) om nødvendig. Hold celler relativt sammenflytende (~ 60 - 70%) når utvide. EF kan slutte å vokse hvis belagt for sparsom.
- Preger EF av FACS, farging, PCR, etc. Merk at Dil-Ac-LDL er fluorescerende og kan forstyrre PE eller andre fluorescerende antistoffer for FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EC representerer kun en mindre brøkdel av den totale cellepopulasjon i de fleste voksne vev 11. Det er derfor viktig å fullt fordøye det høstede vev inn i en enkeltcellesuspensjon som sikrer maksimal frigivelse av EC fra ekstracellulære matriks (ECM) og bindevev. I vår erfaring, gir CD31-mediert immunomagnetisk utvalget bare beriket men ikke rene EF fraksjoner; derfor er et annet viktig skritt fysisk fjerning av co-renset non-EC og utvalg / utvidelse av EU kolonier bruker kloning ringer (figur 1). For eksempel når CD31-beriket EC ble belagt uten ytterligere utvalg koloni, non-EC raskt proliferated og blandet med EF, produsere urene EC kulturer som avslørt av Dil-Ac-LDL + og Dil-AC-LDL - populasjoner (Figur 2A) . Imidlertid, når kolonne eluatene ble sådd ut ved lav tetthet, EC koloniene vokste med relativt få omkringliggende ikke-EC, som ble fjernet ved scvoldta med en pipettespiss (figur 2B). Vekst og renhet av de ekspanderte koloniene kan videre kontrolleres ved tilsetning av Dil-Ac-LDL. Små EF kolonier kan observeres på ~ dag syv etter CD31-mediert kolonne berikelse (figur 2B, topplater). Etter seleksjon og ekspansjon av EC kolonier, Dil-Ac-LDL - celler er fjernet, og cellepopulasjonen er høyrent for Dil-Ac-LDL + EC som antydet ved Dil-Ac-LDL-opptaket (figur 2B, nedre paneler).
For å teste om isolasjonsmetoden kan produsere konsistente resultater, flere kloner avledet fra enten mammatumorer resected fra C3-tag (FVB / N C3 en -TAg) mus eller normale brystkjertlene fra alderstilpassede villtype FVB mus ble isolert og utvidet 12. Renheten av hver TEC og normal EC (NEC) populasjonen ble så forsiktig preget for å sikre renhet. Flowcytometri analyser av tre uavhengige utvalg viste en singel, UNIFORMed CD31 + befolkning som var forskjellig fra IgG isotype kontroller (figur 3A). MRNA-ekspresjon av EC-markører, inkludert CD31, Cdh5 (VE-cadherin), Cd133, og Vegfr2 i alle fire EF-kloner som ble testet var ~ 200 til 7000 ganger høyere enn den til mus embryonale fibroblaster (MEFs) som ble anvendt som en negativ kontroll (Figur 3B). Som forventet, alle EF-kloner uttrykte nesten ikke målbare nivåer av mesenchymale markørgener Col1a1 og Tagln sammenlignet med MEFs. Immunofluorescerende farging viste at alle celler i en representativ TEC-klon var jevnt CD31 + (figur 3C). Videre har disse EC klonene var i stand til å danne spontane fartøylignende strukturer in vitro, noe som indikerer at de beholder endoteliale funksjon etter dyrking (figur 3D).
Isoleringen metoden ble ytterligere validert ved hjelp Cdh5 cre: ZsGreen
Figur 1. Flow Chart og oversikt av EF isoleringsprosedyren.
Figur 2. Dil-Ac-LDL Skiller EC fra forurensende Non-EC i levende kulturer. (A) Fase kontrast og fluoriserende bilder som viser EC og co-isolert røyk EC uten kloning-ring utvalg av EF-kolonier. (B) Fase kontrast og fluoriserende bilder av EF-kolonier på ulike stadier av isolasjon. Stiplede linjer markere boundaries av Dil-Ac-LDL + EC og omkringliggende forurensende celler. Hvit pilspisser indikerer ikke-EC utenfor et EF koloni som bør fjernes med en pipette tips. Skala barer representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kloning Rings og fysisk fjerning av Non-EC produsere rent og Funksjonell Langsiktige EC kulturer. (A) Representant FACS prikk plott av CD31 farging av ulike EU-kloner. Tre representative prøver er vist. Den åpne svart rektangel i hvert plott skisserer CD31 + befolkningen. En IgG isotype blir brukt som en negativ kontroll. (B) Måling av endothelial genuttrykk i utvalgte NEC og TEC kloner. De mRNA nivåer av endotelial gener CD31, Cd133, Cdh5, og Vegfr2 er uttrykt i forhold til de av mus embryonale fibroblaster (MEFs), og mRNA-nivåer av mesenchymale gener Col1a1 og Tagln er uttrykt i forhold til de av NEC-1. (C) Representative immunofluorescerende farging av en ekspandert TEC klon. CD31 er vist i grønt og kjerner er farget blå med 4'6'-diamidino-to-phenylindole (DAPI). (D) Representative bilder av rør dannelsen av ulike EU-kloner belagt på Matrigel. Skala barer representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. EF Isolert fra Cdh5 cre: ZsGreen
| Telefonnummer | FACS-buffer (il) | CD31-PE antistoff (pl) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
Tabell 1. PE-konjugert anti-CD31 antistoff Volumene kreves for ulike Cell Numbers.
| Telefonnummer | FACS-buffer (il) | Anti-PE magnetiske mikroperler (pl) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
Tabell 2. Anti-PE mikro Volumene kreves for ulike Cell Numbers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av vanskelighetene med å oppnå rene primære TEC kulturer, mange in vitro-studier erstatning TEC med kommersielt tilgjengelige EC linjer eller primære EC så som humant navlevene EC (HUVEC) 13. Men disse EC populasjoner fra normalt vev bare tjene som en proxy for TEC som skiller seg markant fra sine vanlige kolleger. For eksempel, TEC er fenotypisk og funksjonelt unormal in vivo, og noen av disse avvikene kan være overførbare in vitro 14-18. TEC har avvikende vekst, trekkfugl, og differensiering evner og kan smelte sammen med CD31 + tumorceller for å danne skipslignende strukturer 16,19,20. Studier ved hjelp av enten dyrkede TEC eller laser capture mikro-dissekert tumor skip har vist at TEC avviker fra normal EC i genuttrykk, cytogenetisk og epigenetiske profiler 12,18,21-23. Til tross for å utdype vår forståelse av tumorangiogenese løpet av det sistetiårene, svært få funksjonelle og mekanistiske studier med kultivert primære TEC er tilgjengelig.
EC ble isolert fra menneskelige umbilical årer i tidlig 1970-tallet 24. Påfølgende isolering og dyrking av mikrovaskulær EC fra andre humane og musevev har gitt et kraftig verktøy for å undersøke endotelceller funksjoner i både helse og sykdom 25-28. De fleste EU-isolasjon protokollene omfatter tre store skritt: å skaffe en encellet suspensjon etter mekanisk dissosiasjon eller enzymatisk fordøyelse, merking EC med en endothelial-spesifikt antistoff som er konjugert til enten en fluoroforen eller magnetiske mikroperler, og berikende EC befolkningen bruker celle sortering eller magnetiske kolonner. Imidlertid isolering av mus EC, spesielt fra tumorer, har vist seg vanskelig på grunn av det lave utbyttet av levedyktige EC og hyppig forurensning av andre celletyper, inkludert tumorceller og fibroblaster. I tillegg kan in vitro fenotypisk drift av EC i megsenchymal lignende celler (endothelial-to-mesenchymale overgangs, EndMT) utgjør en ekstra utfordring for langsiktig dyrking av EF fra normalt vev, svulster, og omprogrammeres forløpere.
Den store utfordringen under TEC isolasjon er forurensning av tumorceller, noe som lett kan utkonkurrere de tregere voksende EU-kolonier som vanligvis vises etter ~ 7 - 10 dager i kultur. I tillegg, er en vanlig brukt seleksjonsmarkør for isolering av EC CD31, som er rikelig uttrykt i endotel, men markerer også hematopoetiske celler og i noen tilfeller tumorcelle subpopulasjoner 20,30. Videre, mens berikende for EC, CD31-mediert immunomagnetisk kolonne utvalget kan ikke fjerne hver eneste forurensende celle som etter hvert kan ta over EU kulturer etter noen passasjer. Ved å legge en kloning-ring trinn, er man i stand til å velge og utvide rene clonally-avledet EC populasjoner som er fri for disse forurensende celletyper. En annen utfordring er den langsiktige hovedvedlikehold av ren EC uten promotering av EndMT. EndMT oppstår under utvikling, kan rekapitulert i løpet av vaskulær dysfunksjon, og er vanlig i dyrkede EC (spesielt i nærvær av TGFp) 31-33. For å minimere EndMT, fjerne kontaminerende celler som kan fungere som en kilde TGFfi, holde kulturer ved høye tettheter, og vedlikeholde høye konsentrasjoner av bFGF i mediene til enhver tid. Som vi har vist nylig, er bFGF viktig å bevare EF-spesifikasjonen som det motvirker TGFp drevet uttrykk for glatt muskel aktin (en EndMT markør) 34.
Ved hjelp av denne metoden, isolering av EC fra en "skjebne-kartlagt" reporter mus ble også vist. Disse mus er spesielt nyttige ved studier hvor intra avbildning er nødvendig 35. Selv om noen merking av hematopoetiske celler kan skje i Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l mus er brukt her, gir denne modellen en forholdsvis rask og lett metode for generering av influensaorescent EC in vivo. Et alternativ EC avstamning-merking modellen er en tamoxifen-induserbar mus (Cdh5 CRE / ERT2) krysset med en floxed reporter musestamme (ZsGreen l / s / l) som vil ha EC trofast og irreversibelt merket 36,37 . Fluorescerende EC fra den induserbare Cre musene kan også bli renset ved bruk av FACS eller ved hjelp av metoden som vi beskriver heri.
EC er heterogene på tvers av ulike vaskulære senger og "intra-fartøyet" heterogenitet kan også finnes blant EC innenfor samme fartøy 38,39. I tillegg er et hierarki av EC med forskjellig potensial proliferativ blitt observert i EF-populasjoner isolert fra blodårer, og en liten brøkdel av klonal EF kan passert utover 40 populasjonsdoblinger 40. Derfor begrensninger av den beskrevne fremgangsmåten er for eksempel: 1) mulig utvalg av disse høyt proliferativ EC befinner seg på den beholderveggen; og 2) anrikning av bare en specific vaskulær subtype avledet fra arterier, vener, eller kapillærer, som kan produsere kloner som ikke fullstendig representerer den totale populasjonen EC in vivo. Ikke desto mindre, som flere klonale subpopulasjoner kan oppnås fra en isoleringsprosedyren, kan denne fremgangsmåte være nyttig for funksjonelle og genetiske analyser av EC heterogenitet som eksisterer i tumorer og andre vev 12. Til sammen er beskrevet her er en EU-isolasjon metode som produserer rene EF kolonier blottet for forurensende ikke-EU. De isolerte cellene skal være nyttig for in vitro funksjonelle studier, genom-wide ekspresjonsanalyse, og molekylær karakterisering av nye veier som kontrollerer tumor angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C.
- Dudley, A. C.
- Aird, W. C.
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
