Abstract
Nyligen isolerade tumörspecifika endotelceller (TEC) kan användas för att utforska molekylära mekanismer för tumörangiogenes och tjäna som en modell in vitro för att utveckla nya angiogeneshämmare för cancer. Det är dock en utmaning på lång sikt in vitro expansion av murina endotelceller (EG) på grund av fenotypisk drift i kultur (endotel till mesenkymala övergång) och förorening med icke-EG. Detta gäller särskilt för TEC som lätt konkurreras ut av samrenat fibroblaster eller tumörceller i odling. Här är en high fidelity isoleringsmetod som drar nytta av immunomagnetisk anrikning tillsammans med koloni val och in vitro expansionen beskrivs. Detta tillvägagångssätt genererar rena EG fraktioner som är helt fria från kontaminerande stromala eller tumörceller. Det är också visat att härstamning-spåras Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter möss, som används med det protokoll som beskrivs häri, är ett värdefullt verktyg för att kontrollera cellrenhet som isolerade EG kolonier från dessa möss visar hållbara och lysande ZsGreen fluorescens i kultur.
Introduction
Endotelceller (EC) är väsentliga vid utvecklingen av solida tumörer. Från initiering av den angiogena brytaren i vilande tumörer spridning och sådd av metastaser i avlägsna platser, EG bilda ledningarna som ger blod, syre och näringsämnen för att upprätthålla tumörtillväxt 1. Som nyligen föreslagit, EG har också perfusion oberoende funktioner och bildar en nisch som stödjer tillväxten av cancer stamceller och andra tumör stromaceller 2-5. Således, högrenat tumörspecifika EG (TEC) för in vitro-kultur möjliggör rutin funktionella studier som kommer att belysa nya molekylära mekanismer som förmedlar tumör angiogenes och överhörning med tumörceller.
EG högt specialiserad beroende på vävnaden ursprungs 6. På grund av den heterogena karaktären hos olika tumörtyper och tumörmikro kan TEC också visa unika egenskaper som återspeglar en tumörspecifik specialisering of vaskulaturen. Till exempel finns det påfallande variation i genuttryck signaturer i TEC isolerade från olika typer eller kvaliteter av tumörer 7,8. Däremot kan ofta co-rening av icke-EG, särskilt tumörassocierade fibroblaster och tumörceller, med TEC förväxla genomet hela uttrycket analyser. Dessa oönskade celltyper är särskilt problematiska i studier som är beroende av långsiktiga in vitro expansion av TEC kulturer.
Beskrivs här är en high-fidelity metod som konsekvent producerar rena EG kulturer från tumörer och andra vävnader. Efter immunmagnetisk anrikning i kolonnen av EG fraktioner och avlägsnande av samrenat icke-EG en ytterligare kloning-ringen steg fånga rena EG kolonier används 9. Varje koloni kan expanderas i odling för flera passager utan uppkomsten av förorenande icke-EG. Denna metod ger också flera EG-kloner från en enda isoleringsförfarandet, som är idealisk för att studera endothelial heterogenitet. Dessutom visas att Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter möss är ett värdefullt verktyg för att skapa "öde-mappade" och outplånligt märkta EG som upprätthåller ZsGreen fluorescens i kultur 10. Med smärre justeringar av protokollet, bör denna metod kunna anpassas till olika tumörtyper eller normala vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll genomförs i enlighet med riktlinjer som fastställts av institutionen för laboratoriedjursmedicin vid University of North Carolina i Chapel Hill.
1. Förbered följande material och reagenser Innan du börjar
- Förbered EG medier genom att komplettera 400 ml låg glukos (1 g / L D-glukos eller LG) Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 50 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 50 ml Nu-serum IV 5 ml antibiotika-antimykotika, och hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, och heparinkomponenter från den kommersiellt kit.
- Bered 500 ml FACS-buffert (0,5% BSA och 2 mM EDTA i PBS); filtrera genom ett sterilt 0,22 pm filter kopp.
- Sterilisera eller desinficera dissekera ombord.
- Sterilisera dissektion stift, kirurgiska saxar och dissectors.
2. EG Isolering (dag 1, ~ 5 h)
- Euthanize musen med koldioxid eller andra metoder kompatibel with Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) politik.
Obs: Flera brösttumörer varierar i storlek (5 - 15 mm i diameter) kan utvecklas i en enda genförändrad mus som C3-Tag, se till att skörda dem alla för TEC isolering. Om du använder tumörer som ortotopiskt är inympade i möss, pool två till tre 1 cm 3 tumörer för ett EG isolering. Här använder vi mammartumörer som en demonstration, men protokollet kan modifieras för andra typer av tumörer. - Desinficera mus genom sprutning eller avtorkning av mus ventrala sidan med riklig mängd 75% volym / volym etanol.
- Resekera tumörer med en sax och dissectors med aseptisk teknik i en steril huva eller en ren bänk.
- Sträck ut och nåla lemmar mössen på en dissekera ombord. Gör en mittlinjen ventrala snitt med en sax utan att öppna bukhinnan. Dissekera sidled mellan huden och peritoneum mot bröstkörtlarna där tumörer är belägna.Inte öppna bukhinnan.
- Punktskatt endast tumörvävnad från mjölkkörtlar, utelämna normala bröst marginaler. Försiktigt trimma bort icke-tumörvävnad såsom hud och muskler, och placera dissekerade tumörer i ett koniskt rör innehållande 30 ml av LG-DMEM på is.
- Ta tumörprover till vävnadsodling huva; Tvätta vävnader med steril LG-DMEM 1 - 2 gånger.
- Överför tumörer från den koniska röret till en steril vävnadskultur petriskål, tillsätt 2 ml av LG-DMEM i skålen, och finhacka med ett par steril sax i bitar <5 mm.
- Lägg 5 ml kollagenas (lager = 2 mg / ml i Hanks balanserade saltlösning, nedan HBSS), 1 ml dispas (lager = 2,5 U / ml i HBSS) och 75 ul deoxiribonukleas (lager = 1 mg / ml i PBS ) i petriskål. Total volym är nu ~ 10 ml.
- Överför kollagenas / vävnadsblandningen från petriskålen till ett vävnads dissociator röret och kördes på en vävnads dissociator för 60 sek två gånger (förinställd dissociationen program på dissociator: 1,270 totalt rundor per körning). Inkubera med ljus skakning på en skakare under 75 min vid 37 ° C.
- Filter diger vävnad genom en 100 ìm cell sil över en 50 ml koniska rör. Skölj filtret med 5 ml FACS buffert för att tvätta eventuella kvarvarande celler. Spin vid 280 xg under 5 min och försiktigt aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Späd 1 ml av lager RBC lyseringsbuffert (10x) i 9 ml sterilt vatten. Lyse röda blodkroppar med 10 ml lyseringsbuffert (1 x), och omedelbart snurra 5 min vid 280 x g. Obs: Detta steg kan hoppas över om lite blod är synligt.
- Resuspendera i 10 ml FACS-buffert. Blanda 10 il cellsuspensionen med 10 il trypanblått, och räkna levande celler med hjälp av en hemocytometer.
- Resuspendera celler vid ~ 10 7 celler / 100 ^. Tillsätt 10 pl av FcR-block per 100 | il cellsuspension, och inkubera på is under 10 minuter.
- Lägg råtta-anti-mus PE-konjugerad CD31 antikropp enligt. till tabell 1 Inkubera på is under 10 - 15 min och snärt röret ibland.
- Tillsätt 10 ml FACS-buffert till röret och centrifugera vid 280 xg under 5 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten och tvätta cellpelleten igen med 5 ml FACS-buffert. Centrifugera för att pelletera cellerna. Sug ut supernatant utan att störa cellpelleten.
- Lägg FACS-buffert och anti-PE mikropärlor enligt tabell 2 Inkubera på is i 10 -. 15 min. Flick röret ibland.
- Tillsätt 10 ml av FACS buffert och snurra prover vid 280 xg under 5 min; tvätta en gång med 5 ml FACS-buffert och centrifugera igen. Sug ut supernatant utan att störa pelleten.
- Bringa volymen till 300 | al i FACS-buffert. Snurra genom 35 ìm cell-sil tak rör 5 minuter vid 280 x g. Använd 2 rör och en större volym om det behövs.
- Inrätta magnetisk Multi och magnetiska kolumner i huva, bifoga en kolumn till separatorn och balansera kolonnen med 2 ml FACS buffert.
- Aspirate supernatanten och resuspendera cellpelleten i 0,5 - 1 ml FACS-buffert.
- Passera cellsuspensionen genom den ekvilibrerade magnetiska kolumnen.
- Tvätta kolonnen tre gånger med 2 ml FACS-buffert, och samla genomströmning (FT) i ett 15 ml rör (FT-fraktion).
- Ta kolonnen bort separatorn och eluera med 2 ml FACS-buffert till en annan 15 ml rör (eluat fraktion). Använd kolven för att säkerställa att alla celler från kolonnen. Upprepa eluering två gånger med 2 ml FACS-buffert varje gång.
- Spin eluatet vid 280 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 10 ml EG-media.
- Lika dela eluatfraktion (~ 6 ml) i 10 cm gelatinbelagda rätter. För tre 1 cm 3 tumörer, tallrik eluerade celler i åtminstone fyra plattor. Alternativt, tallrik eluerade celler vid olika koncentrationer i flera plattor (t ex., Utsäde 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml och 3 ml av eluatet i fyra plattor) för att säkerställa att ent stone en platta är glest ympas med eluerade celler. Kontrollera att konfluens av de bifogade celler vid ~ 1% nästa dag (dvs ca 1,0 - 2,0 x 10 5 bifogade celler).
Obs: Cellerna måste vara klädd glesa så att EG-kolonier kan bildas utan att kontamineras av andra celltyper. - Plate FT fraktion i en 10 cm skål för att låta cellerna återhämta O / N. Kontrollera att plattan är 80 - 100% konfluenta nästa dag. Frys ned cellerna (-80 ° C) i 250 ul cell frysning media i en cryotube och lagra dem i flytande kväve nästa dag. Obs: FT-fraktionen kan användas för tumörcellisolering i ett senare skede och / eller som en negativ kontroll för EG genuttryck analys av de isolerade EG kloner.
- Ändra media varje 2 - 3 dagar. Kolonier börjar bildas efter 7 - 10 dagar. Små EG kolonier kan identifieras så tidigt som dag 3. Markera kolonierna med en fin spets markör på botten av skålen.
- Skrapa bort ospecifik calnar kring identifierade kolonierna med en steril 200 pl pippet spets.
3. Colony val med kloningsringar
- Ändra media varje 2 - 3 dagar. EG renhet kan kontrolleras genom LDL (DII-Ac-LDL) tillägg på ca 5-7 dagar. Tillsätt 50 pl av LDL per 10 ml EG-medium och inkubera i 3-4 timmar innan kontroll av cellerna under fluorescensmikroskop.
Obs: Flera LDL + EG-kloner kunde observeras vid ~ dag 7. - Börja skörda EG kolonier när de når en diameter av 3 - 5 mm i storlek. (Välj stora kolonier som är förpackade med små LDL + celler för bästa resultat.)
- Innan skörd EG med kloningsringar, pre-coat några 6-brunnsplattor med 0,5% gelatin. Aspirera gelatin, tillsätt 2 ml av EG-media till varje brunn, och hålla plattorna i en inkubator tills det behövs.
- Skrapa av icke EG på kanterna av kolonierna att se till att inga andra celltyper kommer att fångas i kloningsring.
- Med användning av enfaskontrastmikroskop (4X eller 10X objektiv), beskriva med en fin spets markör på botten av odlingsskålen de områden som innehåller EG-kolonier.
- Tvätta plattan med 10 ml PBS och lämna ett mycket tunt skikt av PBS i plattan när aspire. (Viktigt: en liten mängd (~ 0,5 ml) PBS kommer att hålla cellerna vid liv under klonings-ringen förfarandet, också måste vävnadsadhesiv vatten för att binda.)
- Välj en kloningsring av lämplig storlek. Använda ett par dissekera pincett för att plocka upp en ring, och med en 10 | j, l pipettspets jämnt applicera en liten mängd vävnad lim på kloningsring.
Obs: Använd endast minimal mängd (~ 0,2 pl för en liten ring) av vävnadslim på kloningsringar och se till vävnadslim sprids jämnt runt bottenytan för att säkerställa god tätning. Överdriven vävnadslim producerar värme och bildar filmer som kan döda celler. - Placera klonings ringen över EG-kolonin. Tryck försiktigt ned kloning ringen att limma ring på plattan. Se till att kolonierna inte torkas ut före limning ringen.
- Omedelbart pipett 25 il enzymatisk cell lossnar lösningen i klonings ringen och inkubera ~ 1 min eller tills cellerna är löst fästa.
- Pipettera cellerna i kloningsring droppvis till en brunn i en 6-brunnars platta innehållande förvärmda EC media. (Viktigt: Skaka inte plattan för att sprida celler; EG föredrar att växa i täta klasar.) Tvätta klonings ring med 50 - 100 pl EG medier för att samla så många celler som möjligt, och överföra alla tvättar i samma sex brunnar .
- Om några kolonier i 10 cm skålen är för små för att skörda, tillsätt 10 ml färsk medier, låt kolonierna växa i ett par dagar, och upprepa kloningsring proceduren igen.
- Väx skördade kolonier i 6-brunnars plattor tills 80 - 100% konfluenta, och överföra cellerna till 3 brunnar i en 6-brunnsplatta, innan de expanderar dem i en 10 cm vävnadskulturskål. Skrapa bort förorenande celler. Upprepaytterligare en runda av kloning ring förfarande (steg från 3,5 till 3,10) om det behövs. Håll celler relativt sammanflytande (~ 60-70%) när expanderar. EG kan sluta växa om pläterade alltför glesa.
- Karakterisera EG genom FACS, färgning, PCR, etc. Notera att Dil-Ac-LDL är fluorescerande och kan störa PE eller andra fluorescerande antikroppar för FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EG utgör endast mindre en bråkdel av den totala cellpopulationen i de flesta vuxna vävnader 11. Det är därför viktigt att helt smälta den skördade vävnaden i en encelliga suspension som garanterar maximal frisättning av EG extracellulärt matrix (ECM) och bindväv. Enligt vår erfarenhet ger CD31-medierad immunomagnetisk val endast anrikade men inte rena EG fraktioner; Därför är en annan avgörande steg avlägsnas fysiskt samrenat icke EG och urval / utbyggnad av EG kolonier med hjälp av kloningsringar (Figur 1). Till exempel när CD31-berikad EG ströks utan ytterligare koloni val, icke-EG snabbt frodats och blandas med EG, som producerar orena EG kulturer vilket framgår av Dil-Ac-LDL + och Dil-AC-LDL - populationer (Figur 2A) . Men när kolonn eluaten ströks ut med låg densitet, EG kolonierna växte med relativt få omgivande icke-EG, som avlägsnades genom scraping med en pipettspets (Figur 2B). Tillväxten och renheten hos de expanderade kolonierna kan övervakas ytterligare genom tillsats av Dil-Ac-LDL. Små EG kolonier kan observeras vid ~ dag sju efter CD31-medierad anrikning i kolonnen (Figur 2B, krönskivor). Efter urval och utbyggnad av EG kolonier, Dil-Ac-LDL - celler elimineras, och cellpopulationen är mycket ren för Dil-Ac-LDL + EG vilket framgår av Dil-Ac-LDL-upptag (Figur 2B, bottenpanelema).
För att testa om isoleringsmetoden kan producera konsekventa resultat, flera kloner härledda från antingen brösttumörer resekterade från C3-TAg (FVB / N C3 1 -taggen) möss eller normala bröstkörtlar från åldersmatchade vildtyp FVB möss isolerades och expanderades 12. Renheten hos varje FEG och normal EG (NEC) populationen tillsattes sedan försiktigt känne att säkerställa renhet. Flödescytometri analyser av tre oberoende prover visade en enda, jämMed CD31 + befolkningen som var skild från IgG isotypkontroller (figur 3A). MRNA uttryck för EG-markörer, inklusive CD31, Cdh5 (VE-cadherin), CD133 och VEGFR2 i alla fyra EG-kloner som testades var ~ 200 till 7000 gånger högre än den av mus embryonala fibroblaster (MEF) som användes som en negativ kontroll (Figur 3B). Som väntat, alla EG-kloner uttryckte nästan odetekterbara nivåer av mesenkymala markörgener Col1a1 och Tagln jämfört med MEFs. Immunofluorescerande färgning visade att alla celler i ett representativt TEC klon var enhetligt CD31 + (fig 3C). Vidare har dessa EG kloner kunde bilda spontana kärlliknande strukturer in vitro, vilket indikerar att de behåller endoteliala funktioner efter odling (figur 3D).
Isoleringen metoden valideras ytterligare användning av Cdh5 cre: ZsGreen
Figur 1. Flödesschema och Översikt över EG-isoleringsproceduren.
Figur 2. Dil-Ac-LDL Skiljer EG från att förorena Icke-EG levande kulturer. (A) fas kontrast och fluorescerande bilder som visar EG och co-isolerade icke-EG utan kloning-ring urval av EG kolonier. (B) Fas kontrast och fluorescerande bilder av EG kolonier i olika skeden av isolering. Streckade linjer markerar boundaries av Dil-Ac-LDL + EG och omgivande förorenande celler. Vit pilspetsar tyda på bristande EG utanför ett EG-koloni som ska tas bort med en pipett spets. Skalstrecken representerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. kloningsringar och fysisk Borttagning av icke-EG Producera Rena och funktionella Långsiktiga EG kulturer. (A) Representativa FACS dot tomter av CD31 färgning av olika EG-kloner. Tre representativa prover visas. Den öppna svart rektangel i varje kurva beskriver CD31 + populationen. En IgG-isotyp används som en negativ kontroll. (B) Mätning av endotelial genuttryck i utvalda NEC och TEC-kloner. De mRNA-nivåer av endothelial generna CD31, CD133, Cdh5 och VEGFR2 har angivits i förhållande till de av mus embryonala fibroblaster (MEF), och mRNA-nivåer av mesenkymala gener Col1a1 och Tagln har angivits i förhållande till de av NEC-1. (C) representant immunofluorescerande färgning av en expanderad TEC-klon. CD31 visas i grönt och kärnor färgas blå med 4'6'-diamidino-2-fenylindol (DAPI). (D) Representativa bilder av rörbildning av olika EG-kloner pläterade på Matrigel. Skalstrecken representerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. EG Isolerad från Cdh5 cre: ZsGreen
| Cell nummer | FACS buffert (il) | CD31-PE-antikropp (il) |
| 1 x 10 7 | 100 | |
| 2 x 10 7 | 200 | 6 |
| 3 x 10 7 | 300 | 7 |
| 4 x 10 7 | 400 | 8 |
| 5 x 10 7 | 500 | 9 |
| 6 x 10 7 | 600 | 10 |
Tabell 1. PE-konjugerat anti-CD31 Antibody volymer som krävs för olika Cell Tal.
| Cell nummer | FACS buffert (il) | Anti-PE magnetiska mikropärlor (il) | 1 x 10 7 | 80 | 20 |
| 2 x 10 7 | 160 | 40 |
| 3 x 10 7 | 240 | 60 |
| 4 x 10 7 | 320 | 80 |
| 5 x 10 7 | 400 | 100 |
| 6 x 10 7 | 480 | 120 |
Tabell 2. Anti-PE mikrokornet volymer som krävs för olika Cell Tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av svårigheter att få rena primär TEC kulturer, många i vitro-studier substitut TEC med kommersiellt tillgängliga EG-linjer eller primära EG såsom humant navelven EG (HUVEC) 13. Dock kan dessa EG populationer från normala vävnader bara fungera som en proxy för TEC som skiljer sig markant från deras normala motsvarigheter. Exempelvis TEC är fenotypiskt och funktionellt onormalt in vivo och en del av dessa avvikelser kan vara överförbart in vitro 14-18. TEC har avvikande tillväxt, flyttande och differentiering förmåga och kan sammansmälta med CD31 + tumörceller för att bilda kärlliknande strukturer 16,19,20. Studier som använder antingen odlade TEC eller laserinfångningsmikro dissekeras tumörkärl har visat att TEC avviker från normal EG genuttryck, cytogenetisk och epigenetiska profiler 12,18,21-23. Trots att fördjupa vår förståelse av blodkärl i tumören under de senastedecennierna, mycket få funktionella och mekanistiska studier med odlade primära TEC finns.
EG isolerades från humana navel vener i början av 1970-talet 24. Efterföljande isolering och odling av mikrovaskulär EG från andra human- och musvävnader har gett ett kraftfullt verktyg för att undersöka endotelceller funktioner i både hälsa och sjukdom 25-28. De flesta EU-protokoll isolering innebär tre viktiga steg: att få en encelliga suspension efter mekanisk dissociation eller enzymatisk matsmältning, märkning EG en endotel-specifik antikropp som är konjugerad till antingen en fluorofor eller magnetiska mikrokulor, och berika EG befolkningen som använder cellsortering eller magnetiska kolumner. Emellertid isolering av mus-EG, särskilt från tumörer, har visat sig vara svårt på grund av det låga utbytet av livsdugliga EG och täta kontamination av andra celltyper, inklusive tumörceller och fibroblaster. Dessutom in vitro fenotypisk drift av EG i migsenchymal-liknande celler (endotel till mesenkymala övergångs EndMT) utgör ytterligare en utmaning för långsiktig odling av EG normala vävnader, tumörer och omprogrammerade prekursorer.
Den stora utmaningen under TEC isolering är förorening av tumörceller, som lätt kan konkurrera ut de långsammare växande EG kolonier som vanligtvis dyker upp efter ~ 7 - 10 dagar i kultur. Dessutom är ett allmänt använt selektionsmarkör för isolering av EG CD31 som rikligt uttrycks i endotelet utan även markerar hematopoetiska celler och i vissa fall tumör cellsubpopulationer 20,30. Dessutom, samtidigt som berikande för EG, CD31-medierad immunomagnetisk kolumn val kan inte ta bort varenda förorenande cell som så småningom kan ta över EU-kulturer efter några passager. Genom att lägga till en klonings-ringen steg, är en möjlighet att välja och bygga rena klonalt härledda EG populationer som är fria från dessa kontaminerande celltyper. En andra utmaning är den långsiktiga huvudunderhåll av ren EG utan främjande av EndMT. EndMT inträffar under utveckling, kan rekapituleras under vaskulär dysfunktion, och är vanlig i odlade EG (särskilt i närvaro av TGF) 31-33. För att minimera EndMT, ta bort kontaminerande celler som kan fungera som en källa TGPp hålla kulturer vid höga densiteter och underhålla höga koncentrationer av bFGF i media hela tiden. Som vi har visat nyligen, är bFGF viktigt att bevara EG specifikation som det motverkar TGF-driven uttryck av glatt muskulatur aktin (en EndMT markör) 34.
Med hjälp av denna metod, isolering av EG från en "öde-mappade" reporter möss visades också. Dessa möss är särskilt användbara i studier där behövs intravital avbildning 35. Även om viss märkning av hematopoetiska celler kan förekomma i Cdh5 cre: ZsGreen l / S / L möss som användes här, tillhandahåller denna modell en relativt snabb och enkel metod för generering av influensaorescent EG in vivo. En alternativ EG modell härstamning-märkningen är en tamoxifen-inducible mus (Cdh5 cre / ERT2) korsas med en floxed reporter musstam (ZsGreen l / s / l) som kommer att få EG troget och irreversibelt märkt 36,37 . Fluorescerande EG från inducerbara CRE möss kan också renas med hjälp av FACS eller använda den metod vi beskriver här.
EG är heterogena mellan olika kärlbäddar och "intra-fartyg" heterogenitet kan också förekomma mellan EG inom samma kärl 38,39. Dessutom har en hierarki av EG med olika proliferativ potential observerats i EG-populationer isolerade från vener och en liten del av klonal EG kan passera över 40 populationsfördubblingar 40. Därför, begränsningar av den beskrivna metoden här inkluderar: 1) möjliga urval av dessa mycket proliferativ EG bosatta i kärlväggen; och 2) anrikning av endast en specIFIC vaskulär subtyp härrör från artärer, vener, eller kapillärer, vilket kan ge kloner som inte helt representerar den totala EG befolkningen in vivo. Ändå som flera klonade subpopulationer kan erhållas från ett isoleringsförfarande, kan denna metod vara användbar för funktionella och genetiska analyser av EG-heterogenitet som finns inom tumörer och andra vävnader 12. Sammantaget beskrivs här är ett EG-isoleringsmetod som ger rena EG kolonier saknar förorenande icke-EG. De isolerade celler bör vara användbara för in vitro-funktionella studier, genomet hela uttrycksprofilering, och molekylär karakterisering av nya vägar som styr tumörangiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter | ||
| 75% v/v ethanol for disinfection | |||
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/ml in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2% in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | |||
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | ||
| 15 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 50 ml conical tubes (sterile) | Corning | ||
| 6-well tissue culture plates | Corning | ||
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | ||
| Dissecting board | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use | ||
| Dissecting forceps and scissors | Sterilize before use | ||
| Dissecting pins 2" | Sterilize before use | ||
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | |||
| Hemocytometer | |||
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | |||
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | |||
| Microplate or rotary shaker | |||
| Phase contrast light microscope |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C.
- Dudley, A. C.
- Aird, W. C.
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
