Protocol
1. Подготовка растворов полиэлектролитов
- Очищают хитозан, как подробно описано в Liao др. Вкратце, создать 1% (вес / объем) раствора хитозана в 2% (об / об) уксусной кислоты и с помощью вакуум-фильтра класса 93 фильтровальную бумагу. Нейтрализовать фильтрат с помощью 5M раствора NaOH, пока рН не стабилизировалась 7. Центрифуга Осажденный хитозан при 1200 х г в течение 10 мин. Слейте супернатант и добавить деионизированную воду для мытья хитозана. Повторите центрифугирования и стиральные шаг еще два раза. Замораживание осажденного хитозана при -80 ° C и лиофилизуют O / N для получения очищенной форме. Храните очищенный хитозан в осушенной кабинета.
- Взвесить 1 г очищенного хитозана в стерильной ткани блюдо культуры. Поместите хитозан в культуре ткани блюдо как можно ближе к УФ-лампе в кабинете биологической безопасности и подвергать воздействию УФ света в течение 15 мин. Использование стерильного пинцета, поместить стерилизованные хитозан в стеклянной таре. Растворите хитозан использованием фильтруют 0.15M уксусной кислоты до конечной концентрации от 0,5% до 1% (вес / объем).
- Взвесить 0,1 г соли альгиновой кислоты натрия и растворяют в 10 мл дистиллированной деионизированной (DDI) воды, чтобы получить 1% (вес / объем) раствора. Смешайте соль альгиновой кислоты натрия в течение по крайней мере 2 ч на вихревом смесителе, чтобы обеспечить полное растворение. Фильтр альгинат решение путем шприцевой фильтр 0,2 мкм. Хранить альгината раствора при 4 ° С.
- Восстановить человеческий рекомбинантный факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) или бета - фактора роста нервов (ФРН), рекомендованные производителем.
2. Нанесение IPC волокон
- Смешайте белки, факторы роста или другие биомолекулы в 10-20 мкл аликвоты раствора полиэлектролита, который имеет аналогичную суммарный заряд. Биологические молекулы с чистой отрицательный заряд (например бычьего сывороточного альбумина [BSA]) должны быть смешаны с альгината раствора. Биологические молекулы с положительного заряда (например, VEGF) должны быть смешаны сраствор хитозана.
- Поместите небольших аликвот (10-20 мкл) хитозана и альгината на устойчивую плоскую поверхность, которая покрыта парафином. Капельки хитозана и альгината должны быть размещены в непосредственной близости, но не в контакте друг с другом.
- Слегка опустите каждый наконечник на пару щипцов в каплях хитозана и альгината. Принесите капельки полиэлектролитов вместе, зажимая пинцетом. Когда капли приходят в контакт друг с другом, медленно тянуть щипцы вертикально вверх, чтобы сделать волокно IPC от поверхности раздела двух капель (фиг.1А).
- Осторожно поместите конец нарисованной МПК волокна на щипцов на коллекторе, например, плоской полимерной матрице, прикрепленной на вращающейся оправке (см раздел 3 и 4). Поверните оправку с фиксированной скоростью 10 мм / сек, чтобы позволить формирование форму и beadless IPC волокон. Увеличение скорости рисования волокна IPC будет формировать шарики, которые вызовет мгновенного высвобождения включеныбиохимические и досрочное прекращение волокна. 10
- Для определения эффективности регистрации, сбора все остальные жидкости остается на парафильмом путем разбавления 500 мкл 1X фосфатным буферным раствором (PBS). Измерить содержание белкового фактора роста или в остатке через BCA анализа (для BSA), ELISA (для VEGF и NGF) или соответствующий анализа для обнаружения включены биомолекулы.
3. Изготовление композитных гидрогеля строительные леса пуллулана-декстрана (PD) полисахарида и IPC волокон
- Изготовление жертвенный пуллулановыми рамки для МПК коллекции волокна
- Взвесить пуллулановыми полисахарид и смешать с дистиллированной деионизированной (DDI) воды, чтобы создать 20% (вес / объем) водного раствора. Смешайте пуллулан решение O / N, чтобы обеспечить однородность.
- В ролях 15 г пуллулана раствора в 10 см диаметр тканевой культуры полистирола (ТКТ) блюдо. Высушите пуллулан решение O / N на 37 ° C. Разрежьте пуллулановыми фильмов на 7мм х 7 мм квадратных кадров.
- Подготовка пуллулана декстран решение полисахарид
- Создание 30% (вес / объем) раствора полисахаридов пуллулановый и декстран (3: 1 соотношении) в воде DDI. Смешайте O / N, чтобы обеспечить однородность раствора полисахарида. Медленно добавляют в бикарбоната натрия в растворе полисахарида, чтобы достичь конечной концентрации 20% (вес / объем). Смешайте O / N, чтобы обеспечить гомогенность раствора. Хранить раствора полисахарида при 4 ° С.
- Сбор IPC волокна на пуллулана кадра
- Прикрепите жертвенный пуллулановыми кадр (раздел 3.1), используя крокодил. Придерживайтесь крокодил и пуллулановыми кадр на конце вращающейся оправке с использованием пластиковым покрытием клейкой ленты. Поверните оправку с наклеенной рамы с постоянной скоростью 10 мм / сек. Пуллулан рамка может быть прикреплена на вращающейся оправке в желаемых направлениях.
- Нарисуйте волокна IPC, используя пару щипцов (раздел 1) и АТТАКч обращается конец волокна IPC на вращающейся пуллулана кадра. Draw волокна IPC с постоянной скоростью. При достижении концом волокна МПК, высушить волокно на структуре конструкт O / N при комнатной температуре.
- Встраивание IPC волокон в ПД гидрогеля эшафот
- Для сшивания каждый грамм декстрана пуллулана раствору добавляли 100 мкл 11% (вес / объем) натрия Триметафосфат водного раствора и гидроксида 100 мкл 10 М натрия. 7 Смешайте раствор при 60 оборотах в минуту с использованием stirplate от 1 до 2 мин. После добавления триметафосфат натрия и гидроксида натрия, раствора полисахарида почти сразу сшивания. Вылейте вязкий раствор полисахарида на конструкции волокон на структуре полностью вставлять волокна IPC. Инкубируйте в сочетании пуллулановый-декстран-IPC волокна (PD-IPC) при 60 ° С в течение 30 мин с образованием химически сшитых композиционных каркасов (фиг.1В).
- ВНИМАНИЕ: Выполните шаг 3.3.2 в вытяжном шкафу и использовать соответствующее защитное следумат ветствующую защитную эк как уксусная кислота является агрессивной и воспламеняется.
- Чтобы вызвать образование пор в строительные леса PD-МПК, погрузить весь каркас в 20% (вес / объем) уксусной кислоты в течение 20 мин.
- Удалить непрореагировавших реагентов моющими ПД-МПК лесов в 1X PBS в течение 5 мин при встряхивании при 100 оборотах в минуту. Повторите этот шаг в 2 раза.
- Удалить излишки PBS и немедленно заморозить PD-МПК каркасов при -80 ° CO / N. Лиофилизировать Строительные леса, по крайней мере 24 ч перед использованием в любых контролируемым высвобождением или биоактивность анализов.
4. Изготовление композитных строительные леса из PCL и IPC волокон
ВНИМАНИЕ: дихлорметан опасные материалы. Используйте вытяжку и средства индивидуальной защиты при обращении дихлорметан.
- Создание нетронутые и узорчатые PDMS субстраты
- Создать первозданную полидиметилсилоксана (PDMS) эластомерный субстрат, используя кусок ПСТК желаемого размера с помощью мягкой процесс литографии. Создать Паттиrned PDMS субстратов с использованием стандартных методов мягкие литографических на поли (метилметакрилата) шаблонов с нужной топографии. 12
- Изготовление жертвенный PCL рамки для МПК коллекции волокна
- Взвесить PCL и растворить в дихлорметане, чтобы создать 0,9% (вес / объем) раствора. На каждый 1 см 2 площади подложки PDMS, падение 500 мкл 0,9% раствора PCL. Разрешить все растворителе дихлорметане полностью испариться в вытяжном шкафу. Повторите процесс литья 0,9% PCL сгущаться фильм до желаемой толщины. Удалить высушенной пленки PCL из PDMS подложки. Создать отверстие в PCL кадра с использованием подходящего размера перфоратор. 2
- Сбор IPC волокна на раме PCL
- Прикрепите жертвенный PCL кадр с отверстием (с 4.2.1) на крокодил. Придерживайтесь крокодил на вращающейся оправке с помощью пластиковым покрытием клейкой ленты. Прикрепите нарисованный конец волокна МПК на FRAM PCLе перед началом вращения с постоянной скоростью 10 мм / сек (Раздел 2). После окончания МПК волокна чертеже, высушить волокно на структуре конструкция O / N при 4 ° C.
- Встраивание волоконно-на-кадр конструкции в узорной PCL подложки
- Бросьте 500 мкл 0,9% раствора PCL на PDMS подложки для создания нетронутой или узорной PCL базу, как требуется. Литой несколько слоев 0,9% раствора PCL, чтобы получить каркас с желаемой толщины. Разрешить все растворителе дихлорметане полностью испариться в вытяжном шкафу.
- Поместите волокна на структуре конструкцию (раздел 4.3.1) на верхней части основания PCL. Добавить 0,9% раствор PCL на волоконно-на-кадр построить несколько раз, чтобы получить желаемую толщину и полностью встроить IPC волокон, изготовления PCL-IPC композитный каркас (рис 1в).
5. Измерение высвобождения биологических агентов из композитных МПК строительные леса
- Поместите композит PD-МПК илиPCL-IPC леса и автономные IPC волокна отдельно в 24-луночного планшета.
- Погрузитесь на эшафот и автономные IPC волокна с 500 мкл 1X PBS. Инкубируйте образцы при 37 ° С. Соберите PBS в различные моменты времени (пресс-релиз) и заменить 500 мкл 1X PBS.
- Измерение количества белка или фактора роста в выпуске массовой информации с использованием BCA анализ (BSA), ELISA (VEGF и NGF) или другое подходящее для анализа, чтобы определить накопленный профиль высвобождения для объединенной биомолекулы.
6. Посев клеток на композитных IPC строительные леса для тестирования биологической активности разрешением биологических агентов
- Стерилизовать лиофилизированное PD-IPC или PCL-IPC композитных строительных лесов, используя ультрафиолетовый свет в кабинете биологической безопасности, по крайней мере 20 мин.
- Используйте стандартные методы клеточной культуры для получения суспензии клеток в 2 х 10 5 клеток в 200 мкл среды роста. Семенной концентрированный суспензии клеток на композитных строительных лесов. ОтрядеR 20 мин, пополнить объем питательной среды, чтобы полностью погрузить каркасов.
- Измерить активность клеток через стандартные методы, такие как Alamar синего метаболической активности анализа, разрастание нейритов РС12 анализа или иммунофлюоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой статье, мы стремились создавать составные каркасы с IPC волокон для пролонгированного высвобождения различных биомолекул. Характеристики биомолекул, используемых в этом исследовании, приведены в таблице 1. IPC волокна были впервые встроены в гидрофильной PD гидрогеля для создания PD-IPC композитный каркас (Фигура 1В). Модель молекулы БСА был впервые опробован для определения возможности использования композитной каркас для контролируемого высвобождения биомолекул. БСА была включена в PD-IPC каркасов с эффективностью 45 ± 0,97%. БСА освобожден от PD-IPD показали почти линейную кинетику с начальной ослабленного выпуска серийной последующим одновременным устойчивом состоянии (рисунок 2). После 2-х месяцев, БСА достигается полное высвобождение 97%. В противоположность этому, автономные IPC волокон про вл быстрое высвобождение 80% BSA в течение 4 ч.
Далее, мы проверили профиль высвобождения и биологическую активность VEGF, используя PD-IPC scaffoLDS. VEGF была включена с эффективностью 75,5 ± 2,7%, и показал замедленное высвобождение по крайней мере 1 недели (фиг.3А). Пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) высевали на PD-МПК каркасов, чтобы определить биологическую активность VEGF. HUVECs на PD-МПК каркасов показали значительное увеличение Alamar синего сокращения и метаболической активности по сравнению с простыми PD каркасов в день 1, что указывает на хорошую сохранность функции VEGF после выхода из PD-IPC каркасов (Фиг.3В). Alamar синий снижения на дни 3, 6 и 7 уменьшилось до достижения сопоставимых уровней с обычной PD помост (фиг.3В).
В PCL-IPC композитные леса были также испытаны для контролируемого высвобождения и по сравнению с автономными IPC волокон. Мы включили NGF в качестве представителя молекулы в PCL-IPC композитных строительных лесов с эффективностью включения 66.38 ± 2.71%. PCL-МПК композитные леса показали линиюAR с замедленным высвобождением и примерно 80% совокупный выпуск после 18 дней (рис 4а). С другой стороны, МПК автономные волокна показал 70% мгновенного высвобождения в течение 24 ч с последующим застойной скорости высвобождения. Использование РС12 роста невритов анализа, мы исследовали биологическую активность NGF, опубликованном (фиг.4В). Нейритов РС12 клеток, выращенных на композитный лесов PCL-IPC-релиз СМИ показали аналогичные уровни с РС12 клеток, культивируемых в 30 нг / мл NGF, дополняется СМИ. Это указывает на то, что выпустили NGF оставались биологически активных в течение по крайней мере 7 дней.
Сочетание рельефа и устойчивый рост доставка фактор может имитировать сотовой микросреды лучше. Универсальный методология изготовления PCL-МПК позволило изготавливать в biochemically- и топографически-контролируемого композитного эшафот. Мы изготовили PCL-IPC композитный каркас с нано-решетки структуры (NP-PCL-МПК эшафот). Мы наблюдали синергический EFфект топографии и устойчивый NGF-релиз по оценке нейронов дифференциации мезенхимальных стволовых клеток (hMSCs) (Рисунок 5). hMSCs культивируемые на NP-PCL-IPC композитных строительных лесов показали более высокую экспрессию ассоциированный с микротрубочками белка 2 (MAP2), что свидетельствует о дифференцировке нейронов. С другой стороны, экспрессия белка МАР2 была значительно ниже в hMSCs культивировали на PCL-МПК только выпуска NGF или узорной PCL (NP-PCL).
Рисунок 1. Включение волокон в IPC гидрофильных и гидрофобных каркасов. (А) Нанесение МПК волокон на границе положительно (хитозана) и отрицательно (альгинат) заряженные Растворы полиэлектролитов. (Б) схема, показывающая включение IPC волокон в гидрофильной решения PD создать PD-IPC композитные е эшафот. (С) схема, показывающая включение IPC волокон в гидрофобной эшафот PCL создать PCL-IPC композитный каркас. Эта цифра взята из Cutiongco и др., 2014 7 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Контролируемое высвобождение BSA от PD-МПК композитный каркас. БСА была включена в ПД-IPC композитных строительных лесов и его выпуск был измерен в различные моменты времени с помощью BCA анализа. Накопительное БСА выпущен обеспечивается в процентах от общего количества BSA (в мкг) включены в волокнах МПК и представлены как средний процент ± стандартное отклонение. Эта цифра взята из Cutiongco др., 2014 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Контролируемое высвобождение и биологическая активность VEGF от PD-МПК композитного эшафот. () Накопительный профиль высвобождения VEGF от PD-IPC композитных строительных лесов. VEGF выпуск измеряли в различные моменты времени с использованием ELISA для специфического VEGF. (Б) Жизнеспособность эндотелиальных клеток, выращенных на PD-IPC композитных строительных лесов, как измерено Alamar синего метаболического теста. Статистический анализ проводили с использованием одностороннего ANOVA с тестом после специальной Тьюки. * Обозначает р <0,05. Эта цифра взята из Cutiongco др., 2014 7 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию из этой фигуры.
Рисунок 4. Контролируемое высвобождение и биологическая активность NGF из PCL-МПК композитного эшафот. () Накопительный профиль высвобождения NGF из PCL-IPC композитных строительных лесов. NGF выпуск измеряли в различные моменты времени с использованием ELISA для специфического NGF. Вставьте показывает совокупный профиль высвобождения NGF от PCL-МПК эшафот для первых 8 ч. (Б) Биологическая активность NGF как измерено вырост нервных клеток РС12. РС12 вырост измеряли с помощью анализа изображений. Эта цифра взята из Teo и др., 2014 2 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
.jpg "/>
Рисунок 5. Дифференциация hMSC на NP-PCL-МПК эшафот. Конфокальной сканирующей микроскопии изображение hMSC культивировали на разных композиционных строительных лесов. (А) NP-PCL-МПК, (Б) NP-PCL, (С) PCL-МПК, (D), нетронутые леса PCL. Зеленый пятно обозначает map2, нейронов клонов маркер. Красное пятно обозначает F-актин, показывая сотовый цитоскелета. Синевы обозначает ядро. Эта цифра взята из Teo и др., 2014 2 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1. Характеристики биохимических, используемые для контролируемого высвобождения из композитных строительных лесов МПК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IPC волокна образованы взаимодействием двух противоположно заряженных полиэлектролитов. Процесс использует извлечение комплекса с интерфейсом полиэлектролитов, облегчая процесс самосборки для формирования стабильной волокна. Механизм формирования МПК волокна гарантирует, что любой биомолекулы добавлены в одинаковым уровнем заряда полиэлектролита могут быть включены во время процесса комплексообразования. 10,11 И наоборот, добавление биомолекулы в противоположно заряженного полиэлектролита приведет к мгновенному осаждению. Просто методология изготовление для IPC волокон придает универсальность в интеграции различных биологических материалов, таких как клетки, факторы роста и малых молекул. Эта критическая черта IPC волокон наблюдается в обоих составных каркасов PD-IPC и PCL-IPC, где факторы роста с различными физическими и молекулярно-биологических свойств (заряда и молекулярной массой) были включены с высокой эффективностью. В противул, эффективность инкапсуляции с использованием микросфер методологии VEGF и NGF может быть как 16% 6 и 8% 13, соответственно.
И PD-МПК и PCL-IPC леса также показали, временную контроль биомолекулы-релизе. VEGF от PD-IPC лесов показали линейную выпуск, по крайней мере 7 дней. В отличие от этого, сообщалось профили высвобождения VEGF из полимерных микросфер показали первоначальное высвобождение разрыва в течение 24 ч, выпуская по крайней мере 60% от общего содержания VEGF. 5,14,15 Кроме того, NGF, было показано, что устойчивый рост доставку фактор из PCL-МПК леса, в то время как другие системы доставки фактор роста на основе полимерных показать плато выпуска от 20 дней с момента выпуска. 13,16 Предположительно, различные компоненты композитных строительных лесов и внести свой вклад в кинетику высвобождения факторов роста. Полимерные механизмы релаксации, пористость и извилистость может сильно повлиять на высвобождение гидрофильных биомолекул. 17 Кроме того, Chemical характеристики полимерной матрице могут иметь электростатическое притяжение и отталкивание к факторам роста, которые затрагивает биомолекулярная освобождения. Таким образом, характеристики полимерной матрице имеют решающее значение в определении профилей высвобождения и биомолекулы с временно-контролируемого высвобождения. Например, в то время как PD каркас показали почти линейное высвобождение BSA, подобный композитный каркас с помощью поли (виниловый спирт) гидрогель не было проницаемость для BSA. 18 Полимерные каркасов, которые могут быть использованы в сочетании с IPC волокон может потребовать предварительную проверку, чтобы определить его проницаемость Диапазон.
В дополнение к контролируемой биохимического выпуска, способность удерживать биологическую активность факторов роста является важным элементом для любой системы доставки биомолекулы. Резкий щелочной среде PD раствора и присутствие органического растворителя в DCM PCL имеют потенциал, чтобы ухудшить какой-либо биомолекул. Например, доставка микросфер сystem, что используется дихлорметан показал устойчивую тенденцию убывающей биологическую с увеличением временной точки из-за деградации ФРН. 16 Тем не менее, мы обнаружили, что биологическая активность VEGF и NGF сохраняется, далее вновь заявляя, что ключевым преимуществом IPC волокон усваиваются в композитный леса.
Использование жертвенного, биосовместимого полимерного полисахарида или рамы, которые могут быть легко включены в объем строительные леса дает гибкость, чтобы создать композитный каркас с несколькими МПК волокон, выровненных в различных конфигурациях. 7 Таким образом, необходимо, чтобы полимерные каркасы, которые должны применяться с IPC волокон имеют потенциал для дальнейшего усвоения в объемном эшафот. Процесс ассимиляции важно в полной мере встраивания IPC волокон в полимерной матрице. Мы наблюдали это явление в жертвенном пуллулан и кадров PCL, обе из которых были легко растворяется в растворителе объемной PD илиPCL эшафот. Кроме того, метод пошагового для МПК изготовления и биомолекул регистрации дает гибкость в ряде биомолекул, которые могут быть доставлены по одной составной эшафот. Простота методики позволяет тонкую настройку эффективности и высвобождения включение кинетики путем изменения идентичности полиэлектролитный или концентрации. Природные полиэлектролиты хитозан и альгинат были использованы из-за его высокой плотностью заряда и сходства в различных ECM углеводов, найденных в тканях животных. Тем не менее, метилированный коллаген и терполимер 8,19 или хитин и альгинат 20 также могут быть использованы для формирования МПК волокна в различной эффектов. Несколько волокон IPC освободить различные биохимические сигналы с разных кинетика может быть достигнута, чтобы создать многофункциональный композитный каркас. Например, внеклеточные матричные белки, такие как фибронектин, загруженные в IPC волокон может обеспечить платформу для пространственно контролируемой клеточной адгезии. 7 Устойчивыйвыпуск антибиотиков и факторов роста, также желательно для применения регенерации тканей. Это может быть возможно с помощью PCL-IPC, которые могут включать гидрофобные, низкомолекулярные препараты и гидрофильные, на основе белков факторов роста в различных отсеках композитного эшафот. 2
Наша методика также представлены разрешается изготовление эшафот с обеих топографических и биохимических сигналов. Мы заметили, что леса NP-PCL-МПК был самый высокий усиление дифференциации hMSC в нейронной линии, подразумевая, что имитирует многие аспекты биофизической и биохимической сотовой нише выгодно в управлении поведением клеток. Легкость представленной методологии позволяет его применение в других patternable полимерных систем, таких как полиакриламид 21 или полиэтиленгликоль 22, при условии, что процесс сшивания не будет существенно влиять IPC целостность волокна. Например, PD леса были чОсень в этом исследовании для его уникального механизма сшивания, что происходит в окружающей и водных условиях. 24 Это потенциально может обеспечить более физиологически соответствующие субстраты для в пробирке и в естественных условиях исследования. Кроме того, вложение IPC волокон в композитной эшафот можно преодолеть отсутствие механической прочности волокон IPC 23, обеспечивая прочность на разрыв. Действительно, PCL 25 был выбран за его высокой механической прочностью.
В целом, простой способ для создания составных каркасов для доставки биомолекул было описано. Мы показали, как МПК волокна могут быть использованы для длительной доставки биомолекул без ущерба его биологическую активность и эффективность регистрации. Мы показали это путем создания композиционных строительных лесов с двух вариантах: PD-МПК и PCL-IPC лесов. Применимость МПК волокон не ограничивается включением в PD-каркасов и PCL-основе, но может быть продлен до потенциально других полимерных системахи для доставки других биомолекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Сингапур Национального исследовательского фонда под управлением одной из своих научно-исследовательских центров передового опыта, в Mechanobiology института, Сингапур. MFAC поддерживается Агентством по науке, технологиям и исследованиям (Сингапур) и Национальным агентством по исследованиям (Франция) совместной программы под номером 1122703037. проекта BKKT поддерживается в Mechanobiology института. Мы благодарим г-на Даниэля HC Вонг для корректуры рукопись и г-жу Рассвет JH Neo для оказания помощи в производстве видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
- Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
- Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
- Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
- Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
- Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
- Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
- Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
- Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
- Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
- Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
- Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
- Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
- Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
- Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353 (2013).
- Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165 (2005).
- Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
- Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
- Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
- Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).
