Protocol
1. Framställning av polyelektrolyt Solutions
- Rena kitosan, som beskrivs i Liao et al. I korthet skapar en 1% (vikt / volym) lösning av kitosan i 2% (volym / volym) ättiksyra och vakuumfilter med användning av grad 93 filterpapper. Neutralisera filtratet med användning av 5M NaOH tills pH stabiliserats till 7. Centrifugera den utfällda kitosanet vid 1200 xg under 10 minuter. Dekantera supernatanten och tillsätt avjoniserat vatten för att tvätta kitosan. Upprepa centrifugering och tvättsteget två gånger till. Frys den utfällda kitosanet vid -80 ° C och lyofilisera O / N för erhållande av renad form. Lagra renat kitosan i en avfuktad skåp.
- Väg upp 1 g renad kitosan i en steril vävnadsodlingsskål. Placera kitosan i vävnadsodlingsskålen så nära som möjligt till UV-lampan i den biologiska säkerhetsskåp och utsättas för UV-ljus i 15 minuter. Använda sterila pincett, placera den steriliserade kitosan i en glasbehållare. Lös kitosan med hjälp av filtrerad 0.15M ättiksyra till en slutlig koncentration mellan 0,5% och 1% (vikt / volym).
- Väg upp 0,1 g alginsyra natriumsalt och lös upp i 10 ml destillerat avjoniserat (DDI) vatten för att erhålla en 1% (vikt / volym) lösning. Blanda alginsyra natriumsaltet under minst 2 tim på virvelblandaren att säkerställa fullständig upplösning. Filtrera alginatlösningen genom 0,2 um sprutfilter. Förvara alginatlösningen vid 4 ° C.
- Lös mänskliga rekombinanta tillväxtfaktorer såsom vascular endothelial growth factor (VEGF) eller beta - nervtillväxtfaktor (NGF), som rekommenderas av tillverkaren.
2. Teckning av IPC Fibrer
- Blanda proteiner, tillväxtfaktorer eller andra biomolekyler i 10-20 | il alikvot av polyelektrolyt-lösning som har en liknande nettoladdning. Biologiska molekyler med negativ nettoladdning (t.ex. bovinserumalbumin [BSA]) ska blandas med alginat lösning. Biologiska molekyler med positiv nettoladdning (t.ex. VEGF) ska blandas medkitosanlösning.
- Placera små portioner (10-20 l) av kitosan och alginat på en stabil plan yta som är täckt med parafilm. Dropparna av kitosan och alginat bör placeras i omedelbar närhet men inte i kontakt med varandra.
- Lätt doppa varje spets på en pincett i kitosan och alginat droppar. Ta dropparna av polyelektrolyter tillsammans genom att nypa tången. När dropparna kommer i kontakt med varandra, sakta dra tången vertikalt uppåt för att dra IPC fiber från gränsytan av de två dropparna (Figur 1A).
- Placera försiktigt i slutet av den dragna IPC fiber på tången på en samlare, såsom en platt polymer klätterställning fäst på en roterande spindel (se avsnitt 3 och 4). Rotera dornen vid en fast hastighet av 10 mm / sek för att tillåta bildning av enhetliga och beadless IPC fibrer. Öka hastigheten på ritningen IPC fibrerna kommer att bilda pärlor, vilket kommer att orsaka en bristningsfrisättning av inkorporeratbiokemiska och förtida fiberterminering. 10
- För att bestämma införlivandet effektivitet, samla alla de återstående vätskorna kvar på parafilm genom att späda med 500 ^ il 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Mät faktorproteininnehållet eller tillväxt i återstoden genom BCA-analys (för BSA), ELISA (för VEGF och NGF) eller en lämplig analys för att detektera införlivad biomolekyl.
3. Tillverkning av Composite hydrogel Scaffold av Pullulan-dextran (PD) polysackarid och IPC fibrer
- Tillverkning offer pullulan ram för IPC fibersamling
- Väg upp pullulan polysackarid och blanda med destillerat avjoniserat (DDI) vatten för att skapa en 20% (vikt / volym) vattenlösning. Blanda pullulanlösning O / N för att säkerställa homogenitet.
- Maska 15 g pullulanlösning i en 10 cm vävnadsdiametern (TCPS) skålen. Torka pullulanlösning O / N vid 37 ° C. Skär pullulan filmer till 7mm x 7 mm fyrkantiga ramar.
- Framställning puUulan-dextran polysackaridlösning
- Skapa en 30% (vikt / volym) lösning av polysackariderna pullulan och dextran (3: 1-förhållande) i DDI vatten. Blanda O / N för att säkerställa homogenitet polysackaridlösningen. Tillsätt långsamt i natriumbikarbonat till polysackariden lösningen för att uppnå en slutlig koncentration av 20% (vikt / volym). Blanda O / N för att säkerställa homogenitet av lösningen. Förvara polysackaridlösningen vid 4 ° C.
- Samla IPC fibrer på pullulan ram
- Fäst offer pullulan ramen (avsnitt 3.1) med hjälp av en alligator klipp. Stick krokodilklämman och pullulan ram på änden av den roterande dorn med hjälp av plastbelagd tejp. Rotera spindeln med fästa ramen vid en konstant hastighet av 10 mm / sek. Den pullulan Ramen kan fästas på den roterande spindeln i önskade riktningar.
- Rita IPC fibrerna med hjälp av en pincett (avsnitt 1) och Attach dras slutet av IPC fibrer på den roterande pullulan ram. Rita IPC fibrerna vid en konstant hastighet. Vid uppnående av slutänden av IPC fibern, torka fibrer-på-ram-konstruktion O / N vid RT.
- Bädda IPC fibrer i PD hydrogel schavotten
- Att tvärbinda varje gram pullulan-dextran-lösning, tillsätt 100 | il av 11% (vikt / volym) natriumtrimetafosfat vattenlösning och 100 ^ il 10 M natriumhydroxid. 7 Blanda lösningen vid 60 rpm med användning av en omröringsskivearrangemang under 1 till 2 min. Efter tillsats av natriumtrimetafosfat och natriumhydroxid, kommer polysackaridlösningen tvärbinda nästan omedelbart. Häll den viskösa polysackaridlösningen på fibrerna-på-ram-konstruktion för att helt bädda in IPC fibrerna. Inkubera de kombinerade puUulan-dextran-IPC fibrer (PD-IPC) vid 60 ° C under 30 min för att bilda en kemiskt tvärbundna komposit ställningar (Figur 1B).
- VARNING: Utför steg 3.3.2 i dragskåp och använda rätt skydds equipment som ättiksyra är frätande och brandfarligt.
- För att inducera porbildning i PD-IPC byggnadsställning, dränka hela ställningen i 20% (vikt / volym) ättiksyra under 20 minuter.
- Ta bort oreagerade reagens genom att tvätta PD-IPC byggnadsställningar i 1X PBS i 5 minuter under skakning vid 100 rpm. Upprepa detta steg 2 gånger.
- Avlägsna överflödigt PBS och omedelbart frysa PD-IPC ställningar vid -80 ° CO / N. Lyofilisera ställningar minst 24 timmar före användning i någon kontrollerad frisättning eller bioaktivitetsanalyser.
4. Tillverkning av Composite Scaffold av PCL och IPC fibrer
VARNING: Diklormetan är ett farligt material. Använd dragskåp och personlig skyddsutrustning vid hantering av diklormetan.
- Skapa orörda och mönstrade PDMS substrat
- Skapa en ren polydimetylsiloxan (PDMS) elastomer substrat med en bit TCPS av önskad dimension med hjälp av mjuk litografi process. Skapa patterned PDMS substrat genom användning av standard mjuka litografiska metoder på poly (metylmetakrylat) mallar med den önskade topografin. 12
- Tillverkning offer PCL ram för IPC fibersamling
- Väg upp PCL och lös i diklorometan för att skapa en 0,9% (vikt / volym) lösning. För varje 1 cm 2 område av PDMS substrat, släpp 500 pl 0,9% PCL lösning. Låt all diklormetan lösningsmedlet att till fullo avdunsta i dragskåp. Upprepa processen för gjutning 0,9% PCL till förtjocka filmen till den önskade tjockleken. Ta bort den torkade PCL filmen från PDMS substrat. Skapa ett hål i PCL-ram med användning av en lämplig storlek hålslag. 2
- Samla IPC fibrer på PCL ramen
- Fäst offer PCL ram med hål (från 4.2.1) på en krokodilklämma. Stick krokodilklämman på den roterande dornen genom att använda plastbelagd tejp. Fäst dras änden av IPC fiber på PCL frame innan rotation vid en konstant hastighet av 10 mm / sek (avsnitt 2). Efter utgången av IPC fiberdragning, torka fiber-on-frame konstruktet O / N vid 4 ° C.
- Bädda fiber-on-frame konstruktion i mönstrat PCL substrat
- Drop 500 pl av 0,9% PCL-lösning på PDMS substratet för att skapa en ren eller mönstrad PCL bas, såsom erfordras. Kasta multipla skikt av 0,9% PCL-lösning för erhållande av en byggnadsställning med den önskade tjockleken. Låt all diklormetan lösningsmedlet att till fullo avdunsta i dragskåp.
- Placera fiber-on-frame-konstruktion (avsnitt 4.3.1) ovanpå PCL bas. Lägg 0,9% PCL lösningen på fiber-on-frame konstruera flera gånger för att få önskad tjocklek och helt bädda IPC fibrer, tillverkning av en PCL-IPC kompositbyggnadsställning (Figur 1C).
5. Mätning av utsläpp av biologiska agens från Composite IPC Ställningar
- Placera komposit PD-IPC ellerPCL-IPC byggnadsställningar och fristående IPC fibrer separat i en 24-brunnar.
- Sänk ställningen och fristående IPC fibrer med 500 mikroliter 1X PBS. Inkubera proverna vid 37 ° C. Samla PBS vid olika tidpunkter (frigör media) och ersätta med 500 mikroliter 1X PBS.
- Mäta mängden protein eller tillväxtfaktor i frisättningsmedia med användning av en BCA-analys (BSA), ELISA (VEGF och NGF) eller annan lämplig analys för att beräkna frisättningsprofilen kumulativa för den inkorporerade biomolekylen.
6. Sådd Celler på Composite IPC Ställningar att testa Bioaktivitet av frisatt biologiska ämnen
- Sterilisera lyofiliserade PD-IPC eller PCL-IPC sammansatta byggnadsställningar som använder UV-ljus i den biologiska säkerhetsskåp i minst 20 minuter.
- Använd standardcellodlingstekniker för erhållande av en cellsuspension av 2 x 10 5 celler i 200 | il tillväxtmedium. Seed den koncentrerade cellsuspensionen på komposit byggnadsställningar. After 20 min, topp upp volymen av tillväxtmedia till fullo dränka ställningar.
- Mät cellsaktivitet genom standardtekniker såsom Alamar blå metabolisk aktivitetsanalys, PC12 neuritutväxt analys eller immunofluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna artikel försökte vi skapa sammansatta ställningar med IPC fibrer för den fördröjda frisättningen av olika biomolekyler. Egenskaper hos biomolekylerna som används i denna studie återfinns i Tabell 1. IPC fibrerna först inbäddade i en hydrofil PD hydrogel för att skapa en PD-IPC kompositbyggnadsställning (Figur 1B). Modell molekyl BSA först testas för att avgöra om det är möjligt att använda en sammansatt byggnadsställning för kontrollerad biomolekyler release. BSA införlivades PD-IPC ställningar med en effektivitet på 45 ± 0,97%. BSA frisatt från PD-IPD visade nära-linjär kinetik med en initial dämpad krevadfrisättning följt av en samtidig stationärt tillstånd (fig 2). Efter 2 månader, BSA uppnått en total frisättning av 97%. Däremot fristående IPC fibrer uppvisade en snabb frisättning av 80% av BSA inom 4 h.
Nästa vi kontrollerat frisättningsprofil och bioaktivitet av VEGF genom att använda PD-IPC scaffoLDS. VEGF införlivades med en verkningsgrad på 75,5 ± 2,7%, och visade en fortsatt övergång till minst 1 vecka (figur 3A). Mänskliga umbilikalvensendotelceller (HUVEC) såddes på PD-IPC ställningar för att bestämma bioaktiviteten av VEGF. HUVEC på PD-IPC byggnadsställningar visade en signifikant ökning av Alamar blått reduktion och metabolisk aktivitet jämfört med släta PD ställningar vid dag 1, vilket indikerar god konservering av VEGF-funktion efter att ha släppts från PD-IPC ställningar (Figur 3B). Alamar blå reduktion vid dag 3, 6 och 7 minskade att uppnå jämförbara nivåer med slätten PD schavotten (Figur 3B).
PCL-IPC sammansatta byggnadsställningar testades också för kontrollerad frisättning och jämfört med fristående IPC fibrer. Vi införlivade NGF som ett representativt molekyl i PCL-IPC sammansatta ställningar med ett införlivande effektivitet 66,38 ± 2,71%. PCL-IPC sammansatta byggnadsställningar visade linjear fördröjd frisättning och cirka 80% kumulativ frisättning efter 18 dagar (Figur 4A). Å andra sidan, IPC fristående fibern uppvisade en 70% krevadfrisättning inom 24 h, följt av en stagnerande frisättningshastigheten. Med hjälp av en PC12 neuritutväxt analys har vi granskat bioaktivitet släppt NGF (Figur 4B). Den neuritutväxt av PC12-celler som odlas på PCL-IPC kompositbyggnadsställning frigör media visade liknande nivåer med PC12-celler odlade i 30 ng / ml NGF kompletterade media. Detta tyder på att det släpps NGF förblev bioaktiva under minst 7 dagar.
Kombination av topografi och ihållande tillväxtfaktor leverans kan efterlikna den cellulära mikromiljön bättre. Den mångsidiga metoder för PCL-IPC tillverkning tillät tillverkning av en biochemically- och topografiskt styrda kompositbyggnadsställning. Vi fabricerade en PCL-IPC kompositbyggnadsställning med nanostorlek galler struktur (NP-PCL-IPC byggnadsställning). Vi observerade synergistiska effect av topografi och ihållande NGF frisättning genom att bedöma neuronal differentiering av humana mesenkymala stamceller (hMSCs) (Figur 5). hMSCs odlade på NP-PCL-IPC sammansatta byggnadsställningar visade högre uttryck av mikrotubuli associerat protein 2 (MAP2), indikerar neuronal differentiering. Å andra sidan, MAP2 proteinuttryck var betydligt lägre i hMSCs odlade på PCL-IPC med endast NGF frisättning eller mönstrade PCL (NP-PCL).
Figur 1. Införlivandet av IPC fibrer i hydrofila och hydrofoba ställningar. (A) Teckning av IPC fibrer vid gränsytan mellan positivt (kitosan) och negativt (alginat) laddade polyelektrolyt lösningar. (B) Schematisk visar inkorporering av IPC fibrer i hydrofila PD lösning för att skapa PD-IPC composit e schavotten. (C) Schematisk visar inkorporering av IPC fibrer i hydrofoba PCL byggnadsställning för att skapa PCL-IPC kompositbyggnadsställning. Denna siffra är anpassad från Cutiongco et al., 2014. 7 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. kontrollerad frisättning av BSA från PD-IPC komposit schavotten. BSA inkorporerades i PD-IPC sammansatta byggnadsställningar och dess release mättes vid olika tidpunkter med hjälp av BCA-analys. Kumulativ BSA släppt är anordnad som en procentandel av den totala mängden av BSA (i ^ g) införlivas i IPC fibrerna och presenteras som medelprocent ± standardavvikelse. Denna siffra är anpassad från Cutiongco et al., 2014. 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kontrollerad frisättning och bioaktivitet av VEGF från PD-IPC kompositbyggnadsställning. (A) Ackumulerad frisättningsprofil av VEGF från PD-IPC sammansatta byggnadsställningar. VEGF-frisättning mättes vid olika tidpunkter med användning av ELISA som är specifik för VEGF. (B) Cellviabilitet av endotelceller odlade på PD-IPC sammansatta byggnadsställningar, mätt genom Alamar blått metabolisk analys. Statistisk analys utfördes med användning av en-vägs ANOVA med Tukeys post hoc-test. * Betecknar p <0,05. Denna siffra är anpassad från Cutiongco et al., 2014. 7 Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Kontrollerad frisättning och bioaktivitet av NGF från PCL-IPC kompositbyggnadsställning. (A) Ackumulerad frisättningsprofil av NGF från PCL-IPC sammansatta byggnadsställningar. NGF-frisättning mättes vid olika tidpunkter med användning av ELISA som är specifik för NGF. Insert visar kumulativ frisättningsprofilen av NGF från PCL-IPC byggnadsställning för den första 8 h. (B) Bioaktivitet av NGF mätt med utväxt av PC12 nervceller. PC12 utväxt mättes genom bildanalys. Denna siffra är anpassad från Teo et al., 2014. 2 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
.jpg "/>
Figur 5. Differentiering av hMSC på NP-PCL-IPC schavotten. Konfokal scanning mikroskopi bild av hMSC odlas på olika sammansatta byggnadsställningar. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL (C) PCL-IPC, (D) Pristine PCL byggnadsställningar. Grön fläck betecknar MAP2, en neuronal härstamning markör. Röd fläck betecknar F-aktin, visar den cellulära cytoskelettet. Blånad betecknar kärnan. Denna siffra är anpassad från Teo et al., 2014. 2 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Egenskaper hos biokemikalier används för kontrollerad frisättning av komposit IPC ställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IPC fibrerna formas genom samverkan mellan två motsatt laddade polyelektrolyter. Processen utnyttjar extraktion av komplexet från gränsytan mellan de polyelektrolyter, vilket underlättar en självorganiserande processen för stabil fiberbildning. Mekanismen för IPC fiberbildning säkerställer att varje biomolekyl lagt till en liknande laddad polyelektrolyt kan införlivas under komplexprocessen. 10,11 Omvänt, tillsats av en biomolekyl i motsatt laddad polyelektrolyt kommer att resultera i omedelbar utfällning. Den enkla tillverkningsmetodik för IPC fibrer ger mångsidighet införliva olika biologiska material såsom celler, tillväxtfaktorer och små molekyler. Denna kritiska inslag i IPC fibrer observerades också i både PD-IPC och PCL-IPC sammansatta byggnadsställningar, där tillväxtfaktorer med olika fysikaliska och biomolekylära egenskaper (laddning och molekylvikt) införlivades med hög verkningsgrad. I contrast, kan inkapslingseffektiviteten med hjälp av mikrosfär metoder för VEGF och NGF vara så låg som 16% 6 och 8% 13 respektive.
Både PD-IPC och PCL-IPC byggnadsställningar visade också temporal kontroll av biomolekyler release. VEGF från PD-IPC byggnadsställningar visade linjär övergång till åtminstone 7 dagar. Däremot rapporterade VEGF frisättningsprofiler från polymera mikrosfärer visade en initial krevadfrisättning inom 24 timmar, släppa åtminstone 60% av den totala VEGF innehållet. 5,14,15 Likaså NGF visades sig ha lidit tillväxtfaktor leverans från PCL-IPC ställningar, medan andra polymera baserad tillväxtfaktor leveranssystem visar en platå för övergång från 20 dagar efter release. 13,16 Förmodligen de olika komponenterna i de sammansatta byggnadsställningar båda bidrar till tillväxtfaktor frigöringskinetik. Polymer mekanismer avkoppling, kan porositet och slingrighet kraftigt påverka frisättningen av hydrofila biomolekyler. 17 Dessutom, chemical egenskaper hos polymerbyggnadsställningen kan ha elektrostatisk attraktion och repulsion mot tillväxtfaktorer som påverkar biomolekyl frisättning. Således är egenskaperna hos den polymera byggnadsställningen är kritiska vid bestämning av frisättningsprofiler och biomolekyler med tidsmässigt-kontrollerad frisättning. Till exempel, medan PD ställningen visade nära-linjära BSA frisättning, en liknande kompositbyggnadsställning med användning av poly (vinylalkohol) hydrogel saknade permeabilitet till BSA. 18 Polymera byggnadsställningar som kan användas i kombination med IPC fibrer kan kräva preliminära tester för att bestämma dess permeabilitet intervall.
Förutom kontrollerad biokemisk frisättning, är förmågan att behålla bioaktiviteten av tillväxtfaktorer en viktig egenskap för varje biomolekyl avgivningssystem. Den hårda alkaliska miljön i PD-lösningen och närvaron av organiskt DCM lösningsmedel i PCL har potential att försämra någon form av biomolekyler. Till exempel, mikrosfär leverans ssystemprogram som används diklormetan visade en bestående trend av minskande bioaktivitet med ökande tidpunkt på grund av nedbrytningen av NGF. 16 Ändå, vi konstaterade att bioaktiviteten av VEGF och NGF bibehålls, vidare att upprepa att en fördel med IPC fibrer likställs inom komposit ställningar.
Användningen av en offer, biokompatibel polysackarid eller polymer ram som lätt kan införlivas i bulkbyggnadsställningen ger mångsidigheten att skapa en sammansatt byggnadsställning med flera IPC fibrer inriktade i olika konfigurationer. 7 är det sålunda nödvändigt att de polymera ställningar som skall tillämpas med IPC fibrer har kapacitet för ytterligare assimilering i en bulkbyggnadsställning. Assimilering processen är viktig i fullt bädda IPC fibrer i polymer schavotten. Vi observerade detta fenomen i offer pullulan och PCL ramar, som var både lätt löses i lösningsmedlet av bulk PD ellerPCL schavotten. Dessutom ger det ett steg metod för IPC tillverkning och biomolekyler inkorporering flexibilitet antalet biomolekyler som kan levereras av en enda sammansatt byggnadsställning. Enkelheten i metodiken gör det också finjustering av inkorporering effektivitet och frisättningskinetik genom att ändra polyelektrolyt identitet eller koncentration. Den naturliga polyelektrolyter kitosan och alginat användes på grund av sin höga laddningsdensitet och likhet med olika ECM kolhydrater som finns i djurvävnader. Ändå metylerad kollagen och terpolymeren 8,19 eller kitin och alginat 20 kan även användas för IPC fiberbildning i varierande effekter. Flera IPC fibrer släpper olika biokemiska signaler med olika kinetik också kan åstadkommas för att skapa en multifunktionell kompositbyggnadsställning. Till exempel kan extracellulära matrixproteiner såsom fibronektin laddas i IPC fibrer ger en plattform för spatialt kontrollerad celladhesion. 7 Fortsattfrisättning av antibiotika och tillväxtfaktorer är också önskvärt för vävnadsregenerering applikationer. Detta kan vara möjligt genom att använda PCL-IPC, vilket kan innefatta hydrofoba, småmolekylära läkemedel och hydrofila, proteinbaserade tillväxtfaktorer i olika fack i komposit schavotten. 2
Vår presenterade metoden tillåten även tillverkning av en byggnadsställning med både topografiska och biokemiska signaler. Vi observerade att NP-PCL-IPC schavotten hade den högsta förstärkning av hMSC differentiering till den neuronala härstamning, vilket innebär att härma flera aspekter av biofysiska och biokemiska cellulära nisch är fördelaktigt för att styra cellens beteende. Enkelheten av det presenterade metoden medger dess tillämpning till andra mönstrings polymera system såsom polyakrylamid 21 eller polyetylenglykol 22, under förutsättning att tvärbindningsprocessen inte signifikant kommer att påverka IPC fiber integritet. Exempelvis PD ställningar var chOsen i denna studie för sin unika tvärbindningsmekanism som sker i omgivningen och vattenförhållanden. 24 Detta kan potentiellt ge mer fysiologiskt relevanta substrat för in vitro och in vivo-studier. Dessutom kan bädda IPC fibrer i en komposit byggnadsställning övervinna bristen på mekanisk hållfasthet hos IPC fibrer 23 genom att åstadkomma draghållfasthet. I själva verket var PCL 25 valdes för sin höga hållfasthet.
Sammanfattningsvis, var en enkel metod för att skapa sammansatta byggnadsställningar för biomolekyler leverans beskrivs. Vi visade hur IPC fibrer kan användas för fördröjd leverans av biomolekyler utan att äventyra dess bioaktivitet och införlivandet effektivitet. Vi visade detta genom att skapa sammansatta ställningar med två varianter: PD-IPC och PCL-IPC ställningar. Tillämpligheten av IPC fibrer är inte begränsad till införlivning i PD- och PCL-baserade ställningar, men kan potentiellt utvidgas till andra polymersystemoch att leverera andra biomolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Singapore National Research Foundation administreras av en av sina forsknings Centers of Excellence, den Mechanobiology institutet, Singapore. MFAC stöds av byrån för vetenskap, teknologi och forskning (Singapore) och Myndigheten för forskning (Frankrike) gemensamt program under projektnummer 1122703037. BKKT stöds av Mechanobiology institutet. Vi tackar Daniel HC Wong för korrekturläsning manuskriptet och Ms. Dawn JH Neo för att bistå i videoproduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
- Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
- Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
- Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
- Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
- Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
- Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
- Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
- Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
- Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
- Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
- Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
- Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
- Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
- Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353 (2013).
- Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165 (2005).
- Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
- Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
- Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
- Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).
