Protocol
고분자 전해질 솔루션 1. 준비
- 리아 외에서 설명하는대로, 키토산을 정제. 간략하게, 1 %를 만드는 2 % 키토산 용액 (/ V W) (v / v) 아세트산 함유하고, 진공 필터 (93)가 급 여과지. pH가 10 분 동안 1,200 XG에서 7 원심 침전 된 키토산에 안정화 될 때까지 5M 수산화 나트륨을 사용하여 여과 액을 중화. 뜨는을 가만히 따르다 및 키토산을 씻어 탈 이온수를 추가합니다. 원심 분리 및 세척 단계를 두 번 더 반복합니다. 정제 된 형태를 얻기 위해 -80 ° C 및 동결 건조 O / N에서 석출 키토산 동결. 제습 캐비닛에 정제 된 키토산을 저장합니다.
- 무균 조직 배양 접시에 정제 키토산 1g을 달아. 생물학적 안전 캐비넷의 UV 램프에 최대한 가깝게 조직 배양 접시에 키토산을 넣고 15 분 동안 UV 광에 노출. 무균 핀셋을 사용하여, 유리 용기에 멸균 키토산 놓는다. 용해 키토산은 0 필터링 사용.0.5 %와 1 % 사이의 최종 농도 15M 아세트산 (W / V).
- 알긴산 나트륨 0.1 g을 칭량하고 (w / v)의 용액을 1 %를 얻기 위해 탈 (DDI)의 증류수 10ml에 녹인다. 완전한 용해를 보장하기 위해 볼텍스 혼합기에서 적어도 2 시간 동안 알긴산 나트륨 염을 섞는다. 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 알지네이트 용액 필터. 4 ° C에서 알지네이트 솔루션을 저장합니다.
- 제조자가 권장하는 신경 성장 인자 (NGF), - 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 또는 베타 인간 재조합 성장 인자 재구성.
IPC 섬유 2. 도면
- 유사한 순 전하를 갖는 고분자 전해질 용액의 10 내지 20 μL의 분취 액으로 단백질, 성장 인자 또는 다른 생물 분자를 섞는다. 순 음전하 (예, 소 혈청 알부민 [BSA])와 생물학적 분자 알지네이트 용액을 혼합한다. 양전하 (예 : VEGF)와 생물 분자와 혼합되어야키토산 솔루션입니다.
- 파라 필름으로 덮여 안정된 평평한 표면에 키토산 및 알긴산의 작은 분취 량 (10 ~ 20 μL)를 놓습니다. 키토산 및 알긴산 액 근접 배치 아니라 서로 접촉한다.
- 가볍게 키토산과 알긴산 방울에 집게 한 쌍의 각 끝을 찍어. 함께 집게 곤란하여 고분자 전해질의 방울을 가져와. 물방울이 서로 접촉 할 때, 서서히 두 방울 (도 1a)의 인터페이스에서 IPC 섬유 그릴 수직 상방 집게를 당긴다.
- 이러한주의 깊게 회전 맨드릴 상에 부착되어 플랫 고분자 담체로 집 전체에 겸자에 그려진 IPC 섬유의 단부를 배치했다 (제 3 및 4 참조). 유니폼과 IPC 섬유 beadless 형성 할 수 있도록 10mm / sec의 고정 된 속도로 맨드릴을 돌립니다. Incorporated의 버스트 방출을 일으킬 것이다 비드를 형성 할 것이다 IPC 섬유 드로잉 속도를 증가생화학 및 조기 섬유 종료. (10)
- 통합의 효율성을 결정하기 위해, 남아있는 모든 액체가 1X 인산염 완충 생리 식염수 500 μL (PBS)으로 희석하여 파라 필름에 남아 수집합니다. BCA의 (BSA에 대한) 분석 (VEGF 및 NGF의 경우) 또는 ELISA 혼입 생체 분자를 검출하기 위해 적절한 분석을 통해 잔사 중의 단백질 또는 성장 인자의 함유량을 측정한다.
복합 하이드로 겔 풀루 란 - 덱스 트란의 비계 (PD) 다당류 및 IPC 섬유 3. 제작
- IPC 섬유 수집을 위해 희생 풀루 란 프레임 제조
- 풀루 란 다당류를 달아 (W / V) 수용액을 20 %를 만드는 증류 탈 (DDI) 물과 혼합. 균일 성을 보장하기 위해 풀루 란 솔루션 O / N을 섞는다.
- 10cm 직경의 조직 문화 폴리스티렌 (FPC 기판) 접시에 풀루 란 용액 15g 캐스트. 37 ° C에서 풀루 란 솔루션 O / N을 건조. 7에 풀루 란 영화를 잘라MM은 7mm 사각 프레임을 X.
- 풀루 덱스 트란 폴리 사카 라이드 용액을 제조
- 30 %를 만들기 다당류의 솔루션 풀루 란과 덱스 트란 (/ V W) : DDI 물 (3 1 비율). 폴리 사카 라이드 용액의 균질성을 확인하기 위해 O / N 섞는다. 천천히 20 %의 최종 농도를 달성하기 위해 다당류 용액에 중탄산 나트륨으로 추가 (W / V). 용액의 균일 성을 보장하기 위해 O / N을 섞는다. 4 ° C에서 다당류 솔루션을 저장합니다.
- 풀루 란 프레임 IPC 섬유를 수집
- 악어 클립을 사용하여 희생 풀루 란 프레임 (3.1)를 붙입니다. 플라스틱 코팅 된 접착 테이프를 사용하여 회전 맨드릴의 끝에 악어 클립 및 풀루 란 프레임을 스틱. 10mm / sec의 일정한 속도로 부착 된 프레임 맨드릴을 돌립니다. 풀루 프레임은 원하는 방향으로 회전 맨드릴 상에 부착 될 수있다.
- 집게 쌍 (1 절)와 ATTAC을 사용하여 IPC 섬유 그리기H 회전 풀루 란 프레임 상에 IPC 섬유의 그린 끝. 일정 속도로 IPC 섬유를 그린다. IPC 섬유의 말단부에 도달 한 후, RT에서 N / 섬유 - 온 - 프레임 구조의 O를 건조.
- PD 하이드로 겔 지지체에 IPC 섬유의 포함
- . (/ V W) 나트륨 수용액 및 100 μL의 10M 수산화 나트륨을 트리 메타 11 %, 100 ㎕를 추가 풀루 덱스 트란 용액의 각 그램 가교 7 1 ~ 2 분 동안 stirplate를 이용하여 60 rpm으로 용액을 혼합하기. 트리 메타 포스페이트 나트륨과 수산화 나트륨을 첨가 한 후, 폴리 사카 라이드 용액을 거의 즉시 가교 것이다. IPC 섬유를 완전히를 포함하는 섬유 - 온 - 프레임 구조에 점성 다당류 용액을 붓고. 화학적으로 가교 결합 된 복합체 지지체 (도 1b)를 형성하기 위해 30 분 동안 60 ° C에 결합 된 덱스 트란, 풀루 란 - IPC 섬유 (PD-IPC)를 부화.
- 주의 : 흄 후드 단계 3.3.2을 수행하고 적절한 보호 동등를 사용아세트산 등의 pment 부식성 및 인화성이다.
- PD-IPC 지지체의 기공 형성을 유도하기 위하여, 20 분에 20 % (w / v)의 아세트산 전체 골격 잠수함.
- 100 rpm으로 흔들어 섞으면 서 5 분간 1X PBS에 세척 PD-IPC 골격에 의해 미 반응 시약을 제거합니다. 이 단계를 2 번 반복합니다.
- 초과 PBS를 제거하고 즉시 -80 ° CO / N의 PD-IPC 발판을 동결. 비계 어떤 제어 방출 또는 생체 활성 분석에 사용하기 전에 적어도 24 시간을 동결 건조.
PCL 및 IPC 섬유의 복합 비계 4. 제작
주의 : 디클로로 메탄은 위험한 물질이다. 디클로로 메탄을 처리 할 때 흄 후드 및 개인 보호 장비를 사용합니다.
- 깨끗한과 패턴 PDMS 기판 만들기
- 소프트 리소그래피 공정을 이용하여 원하는 치수의 FPC 기판의 일부를 사용하여 깨끗한 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 기판 만든다. patte 만들기원하는 템플릿 지형 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)에 표준 소프트 리소그래피 방법을 사용하여 rned PDMS 기판. (12)
- IPC 섬유 수집을 위해 희생 PCL 프레임 제조
- PCL을 달아 (W / V) 솔루션을 0.9 %를 만들 디클로로 메탄에 용해. PDMS 기판의 모든 1cm 2 지역의 경우, 0.9 % PCL 용액 500 μl를 놓습니다. 완전히 흄 후드에서 증발 디클로로 메탄 용매를 모두 허용합니다. 원하는 두께로 필름을 두껍게 0.9 % PCL 주조의 과정을 반복합니다. PDMS 기판에서 건조 PCL 필름을 제거합니다. 적절한 크기의 구멍을 뚫는을 사용하여 PCL 프레임에 구멍을 만듭니다. (2)
- PCL 프레임 IPC 섬유를 수집
- 악어 클립 (4.2.1)에서 구멍 희생 PCL 프레임을 부착합니다. 플라스틱 코팅 된 접착 테이프를 사용하여 회전 맨드릴에 악어 클립 스틱. PCL의 FRAM에 IPC 섬유의 그린 끝을 연결합니다10mm / 초 (제 2)의 일정 속도로 회전을 시작하기 전에 전자. IPC 섬유 드로잉 종료 후, 섬유에 프레임 구조의 O / N에서 4 ℃에서 건조.
- 섬유에 프레임이 패턴 PCL 기판으로 구성 퍼가기
- 필요에 따라, 깨끗한 또는 패턴 PCL 기반을 만들기 위해 PDMS 기판에 0.9 % PCL 용액 500 μl를 삭제합니다. 원하는 두께와 발판을 얻었다 0.9 % PCL 용액 다층 캐스트. 완전히 흄 후드에서 증발 디클로로 메탄 용매를 모두 허용합니다.
- PCL베이스의 상단에있는 섬유에 프레임 구조 (섹션 4.3.1)을 놓습니다. 원하는 두께를 얻기 위해 섬유의 프레임 구성을 여러 번에 0.9 % PCL 솔루션을 추가하고 완전히 PCL-IPC 복합 지지체 (그림 1C을) 제조, IPC 섬유를 포함.
복합 IPC 공사장 공중 발판에서 생물학 작용제의 릴리스 5. 측정
- 배치 합성 PD IPC-또는PCL-IPC 골격 및 독립 실행 형 IPC 섬유를 별도로 24 웰 플레이트에.
- 발판을 담그고 독립형 IPC 섬유를 1X PBS 500 μL와 함께. 37 ° C에서 샘플을 품어. 다양한 시점 (릴리스 미디어)에서 PBS를 수집하고 1X PBS 500 μL로 교체합니다.
- 통합 생체 분자 누적 방출 프로파일을 계산하는 BCA 분석 (BSA), ELISA (VEGF 및 NGF) 또는 다른 적절한 분석을 이용하여 분리 배지에서 단백질 또는 증식 인자의 양을 측정한다.
합성 IPC 공사장 공중 발판에서 세포의 6. 시드 출시 생물 제의 생체 활성 테스트하는
- 적어도 20 분 동안 생물학적 안전 캐비넷에 UV 광을 사용하여 동결 건조 PD-IPC 또는 PCL-IPC 복합 지지체 멸균.
- 200 ㎕의 성장 배지에 2 × 105 세포의 세포 현탁액을 수득 표준 세포 배양 기술을 사용한다. 복합체 지지체 상 농축 세포 현탁액을 시드. AfteR 20 분, 완전히 비계 잠수함하는 성장 미디어의 최고 최대 볼륨을 설정합니다.
- 이러한하는, Alamar 블루 대사 활동 분석, PC12의 신경 돌기 가지 분석 또는 면역와 같은 표준 기술을 통해 세포 활성을 측정합니다.
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Representative Results
이 글에서, 우리는 다양한 생체 분자의 서방에 대한 IPC 섬유와 복합 발판을 만드는 노력했다. 본 연구에서 사용 된 생체 분자의 특성을 표 1에서 발견된다. IPC 섬유는 제 PD-IPC 복합체 지지체 (도 1B)를 만들기 위해 PD 친수성 하이드로 겔에 포함 하였다. 모델 분자 BSA 먼저 제어 생체 릴리스 복합체 지지체를 사용하는 타당성을 결정하기 위하여 시험 하였다. BSA는 45 ± 0.97 %의 효율과 PD-IPC 골격에 통합했다. PD-IPD에서 출시 BSA는 수반 정상 상태이어서 초기 감쇠 버스트 릴리스 (그림 2)와 선형에 가까운 반응 속도를 보였다. 후 2 개월, BSA는 97 %의 총 방출을 달성했다. 반대로, 단독 섬유 IPC하여 4 시간 내에 80 %의 BSA의 신속한 방출을 나타내었다.
다음으로, 우리는 PD-IPC의 scaffo를 사용하여 VEGF의 방출 프로필과 생체 활성을 확인LDS. VEGF는 75.5 ± 2.7 %의 효율로 혼입, 및 적어도 일주 (도 3A)에 대해 지속 방출을 보여 주었다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를)은 VEGF의 생물학적 활성을 결정하기 위해 PD-IPC 지지체에 파종 하였다. PD-IPC 골격에 HUVECs를은 PD-IPC의 비계 (그림 3B)에서 해제 된 후 VEGF의 기능을 잘 보존을 나타내는, 1 일에 일반 PD의 비계와 비교하는, Alamar 블루 감소와 신진 대사 활동의 상당한 증가를 보였다. 3 일, 6 및 7에서하는, Alamar 블루 환원 일반 PD 골격 (도 3B)와 대등 한 수준의 감소를 달성하기.
PCL - IPC 복합 지지체는 제어 방출 시험 및 독립형 IPC 섬유와 비교 하였다. 우리는 66.38 ± 2.71 %의 결합 효율 PCL - IPC 복합 지지체에 대표적인 분자로 NGF를 통합. PCL-IPC 복합 지지체 라인을 보여 주었다AR 서방과 십팔일 (그림 4A) 후 약 80 %의 누적 릴리스. 한편, IPC는 독립형 섬유 정체 방출률이어서 24 시간 이내에 70 % 버스트 방출을 나타내었다. PC12 신경 돌기 가지 분석법을 사용하여, 우리는 해제 NGF (도 4b)의 생물 활성을 조사 하였다. IPC-PCL 복합 골격 방출 매질 성장 PC12 세포의 신경 돌기의 생장은 30 ng의 배양 PC12 세포와 비슷한 수준을 나타내었다 / ㎖ NGF는 미디어를 보충. 이것은 해제 NGF는 적어도 7 일간 생활 성을 유지 것을 나타낸다.
지형 조합 지속적인 성장 인자 전달은 더 미세 세포를 모방 할 수있다. PCL-IPC 제조의 다양한 방법론은 biochemically-과 지형적으로 제어 복합 지지체의 제조를 허용했다. 우리는 나노 크기의 격자 구조 (NP-PCL-IPC 비계)와 PCL-IPC 복합 지지체를 제작. 우리는 시너지 EF 관찰지형에는 영향과 인간의 중간 엽 줄기 세포 (중배엽 줄기 세포) (그림 5)의 신경 세포 분화를 평가하여 신경 성장 인자의 방출을 지속. NP-PCL-IPC 복합 지지체에 배양 중배엽 줄기 세포는 신경 세포의 분화를 나타내는 미세 소관 관련 단백질 2 (MAP2)의 높은 발현을 보였다. 한편, MAP2 단백질 발현은 NGF 방출 또는 패터닝 PCL (NP-PCL)로 PCL-IPC상에서 배양 중배엽 줄기 세포가 실질적으로 낮았다.
친수성과 소수성의 골격으로 IPC 섬유의 혼입도 1. 양 (키토산)의 계면에서 IPC 섬유 (A) 드로잉 및 음 (알긴산) 대전 된 고분자 전해질 용액. (B) PD-IPC 붙지의 친수성을 만드는 PD 용액 IPC 섬유의 혼입을 보여주는 개략도 전자 발판. 소수성 PCL 지지체에 IPC 섬유의 결합을 보여주는 (C) 개략도 PCL-IPC에게 복합 발판을 만들 수 있습니다. 이 수치는 Cutiongco 등.에서 적응되어, 2014 년 7은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PD-IPC 복합 지지체. BSA에서 BSA의 그림 2. 제어 방출은 PD-IPC 복합 지지체에 통합하고 출시는 BCA 분석을 사용하여 다양한 시점에서 측정 하였다. 릴리스 누적 BSA는 IPC 섬유에 포함 (μg의 단위) BSA의 총량의 백분율로 제공되며 ± 표준 편차로서 평균 백분율을 제시한다. 이 수치는 Cutiongco 등의 알에서 구성된다. 2014 년 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 제어 방출 및 PD-IPC 복합 지지체에서 VEGF의 생체 활성. (A) PD-IPC 복합 지지체에서 VEGF의 누적 방출 프로필. VEGF의 방출은 VEGF에 대한 특이적인 ELISA를 이용하여 다양한 시점에 측정 하였다. 대사하는, Alamar 블루 분석법에 의해 측정 한, PD-IPC 복합체 지지체 상에 성장 내피 세포 (B) 세포 생존율. 통계 학적 분석은 Tukey에의 사후 검사로 일방향 ANOVA를 사용하여 수행 하였다. * P <0.05를 의미한다. 이러한 수치는 Cutiongco 동부 등에서 적합하다. 2014 년 7 확대 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.
그림 4. 제어 방출 및 PCL-IPC 복합 지지체에서 신경 성장 인자의 생체 활성. (A) PCL-IPC 복합 지지체에서 신경 성장 인자의 누적 방출 프로필. NGF 방출은 NGF에 대한 ELISA를 사용하여 특정의 다양한 시점에서 측정 하였다. 삽입은 처음 8 시간 동안 PCL-IPC 발판에서 신경 성장 인자의 누적 방출 프로필을 보여줍니다. NGF의 (B)는 생물 작용 (Bioactivity) PC12 신경 세포의 생장에 의해 측정. PC12 파생물은 이미지 분석을 통해 측정 하였다. 이 그림은 테오 등.에서 적응되어, 2014 년 2는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 NP-PCL-IPC 발판에 hMSC 5. 차별화. hMSC의 공 초점 주사 현미경 이미지는 다른 복합 지지체에 배양 하였다. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) 원시 PCL 지지체. 녹색 얼룩 MAP2, 신경 계통 마커를 의미한다. 붉은 얼룩은 세포의 세포 골격을 보여주는, F - 굴지이다. 블루 얼룩은 핵을 의미한다. 이 그림은 테오 등.에서 적응되어, 2014 년 2는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 복합 IPC 골격에서 방출 조절에 사용되는 생화학 1. 특징.
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Discussion
IPC 섬유 개의 반대로 대전 된 고분자 전해질의 상호 작용에 의해 형성된다. 프로세스는 안정된 섬유 형성을위한 자기 조립 공정을 용이하게 고분자 전해질의 계면에서의 복잡한 추출을 이용한다. IPC 섬유 형성의 메카니즘은 유사 대전이 고분자 전해질 복합체 과정에서 혼입 될 수있는 생리 활성 물질로 첨가되도록. 10,11는 반대로, 반대로 대전 된 고분자 전해질로 생리 활성 물질의 첨가는 즉각적인 침전이 발생할 것이다. IPC 섬유에 대한 간단한 제조 방법은 세포, 성장 인자 및 작은 분자 등의 다양한 생체 물질을 포함에 다양성을 준다. IPC 섬유이 중요한 기능은 또한 다른 물리적 특성과 생체 분자 (충전 및 분자량)과 성장 인자가 높은 효율로 혼입 된 PD-IPC 및 PCL-IPC 복합 지지체 모두에서 관찰되었다. 콘트라에서ST는, VEGF 및 NGF 용 미세 방법론을 사용하여 캡슐화 효율은 각각 16 % 6 13 8 % 정도로 낮을 수있다.
PD-IPC 및 PCL-IPC 발판 모두는 생체 분자의 방출 시간 제어를 보여 주었다. PD-IPC의 발판에서 VEGF는 최소 7 일 동안 선형 자료를 보여 주었다. 반면, 고분자 미소에서 VEGF의 용출이 총 VEGF 함량 중 적어도 60 %를 방출, 24 시간 이내의 초기 파열 방출을 보여 주었다보고. 5,14,15 유사하게, NGF가 PCL-IPC에서 성장 인자 전달을 유지 한 것으로 나타났다 지지체는, 다른 고분자 계 성장 인자 전달 시스템 릴리스 20 일 이내되던 고원을 표시한다. 13,16 아마도, 복합체 지지체의 다른 성분은 모두 성장 인자의 방출 동력학에 기여한다. 폴리머 이완 메커니즘은, 다공성 및 비틀림이 크게 친수성 생체 분자의 분리에 영향을 줄 수있다. (17) 또한, C를고분자 지지체의 hemical 특성은 생체 분자의 방출에 영향을 미치는 성장 요인으로 정전 기적 인력과 반발이있을 수 있습니다. 따라서, 중합체 성 지지체의 특성이 시간적으로 제어 릴리스 용출 및 생체 분자를 결정하는데 중요하다. PD 골격이 폴리 (비닐 알콜)을 사용하여 선형에 가까운 BSA 릴리스 유사한 복합 지지체를 보였다 예를 들어, 히드로 겔은 BSA에 침투성이 부족. 투과도를 결정하는 예비 테스트가 필요할 수 IPC 섬유와 조합하여 사용될 수있다 (18) 고분자 골격을 범위.
생화학 제어 방출에 더하여, 성장 인자의 생리 활성을 유지하는 능력은 임의의 생체 분자 전달 시스템의 중요한 기능이다. PD 용액의 알칼리 가혹한 환경 및 PCL DCM 유기 용매의 존재는 생체 분자의 어떤 종류를 저하시킬 가능성이있다. 예를 들어, 미세 전달 S을 디클로로 메탄을 사용 YSTEM 의한 NGF의 열화 평가시기 증가와 함께 생물 활성을 감소의 일관된 경향을 보였다. 16 그럼에도 불구하고, 우리는 VEGF과 NGF의 생물 활성은 상기 IPC 섬유의 주요 장점은 복합체 내에서 흡수되는 것을 재확인, 유지되는 것을 관찰 비계.
쉽게 벌크 지지체 내로 혼입 될 수있는 희생 생체 적합성 다당류 또는 중합체 프레임의 사용은 상이한 구성으로 배열 여러 IPC 섬유 복합 지지체를 만드는 융통성을 제공한다. (7)을 따라서, 고분자 골격을 적용 할 필요가있다 IPC 섬유 대량 발판으로 더 동화의 용량을 가지고있다. 동화 과정이 완전히 고분자 담체로 IPC 섬유 매립 중요하다. 우리는 모두 쉽게 대량 PD의 용매에 용해시켜 풀루 란과 희생 PCL 프레임에이 현상을 관찰PCL 지지체. 게다가, IPC 제조 및 생체 분자 통합하기위한 단일 단계 방법은 단일 복합 지지체에 의해 전달 될 수있는 생체 분자의 수에 유연성을 제공한다. 방법론의 단순 또한 고분자 전해질의 신원 또는 농도를 변경하여 법인의 효율성과 방출 반응 속도의 미세 조정을 할 수 있습니다. 천연 고분자 전해질 키토산 및 알긴산 염은 동물의 조직에서 발견되는 다양한 ECM 탄수화물로 높은 전하 밀도와의 유사성에 기인 하였다. 그러나 변성 콜라겐과 삼원 8,19 또는 키틴 및 알긴산 (20)는 또한 다양한 효과 IPC 섬유 형성을 위해 사용될 수있다. 다른 동력학 또한 다기능 복합 지지체를 만드는 달성 될 수있다하여 여러 IPC 섬유는 다양한 생화학 적 신호를 방출. 예를 들어, IPC 섬유에로드 피브로넥틴 등의 세포 외 기질 단백질 공간적 조절 세포 부착을위한 플랫폼을 제공 할 수있다. (7)가 지속항생제와 성장 인자의 방출은 또한 조직 재생 애플리케이션에 바람직하다. 이것은 소수성, 소분자 약물과 복합 지지체의 다른 구획에서 친수성, 단백질 계 성장 인자를 포함 할 수 PCL-IPC을 이용하여 가능하다. 2
우리 제시된 방법론은 또한 지형 생화학 큐 모두 지지체의 제조를 허용. 저희는 NP-PCL-IPC의 발판이 생물 물리학 및 생화학 세포 틈새의 여러 측면을 흉내 낸 것은 세포의 동작을 지시에 유익 암시, 신경 계보에 hMSC 차별의 가장 높은 향상 있었다는 것을 관찰했다. 제시된 방법의 용이성 가교 처리는 상당히 IPC 섬유의 무결성에 영향을 제공하지 않는다는 폴리 아크릴 아미드 또는 폴리에틸렌 글리콜 (21) (22) 등의 다른 패터닝 가능한 중합체 시스템에의 응용을 허용한다. 예를 들어, PD의 발판은 채널했다주위 온도 및 수성 조건에서 발생하는 독특한 가교 메커니즘이 연구에서 OSEN. (24)이 잠재적으로 더 생리 학적으로 시험관과 생체 내 연구에 관련 기판을 제공 할 수 있습니다. 또한, 복합체 지지체에 IPC 섬유를 포함하면 인장 강도를 제공하여 IPC 섬유 (23)의 기계적 강도의 부족을 극복 할 수있다. 실제로, PCL (25)은 높은 기계적 강도를 위해 선택되었다.
요약하면, 생체 분자 전달 복합체를위한 발판을 만들기위한 단순한 방법을 설명 하였다. 우리의 생체 활성 및 결합 효율을 손상시키지 않고 생체 분자의 지속적인 전달을 위해 사용될 수 있는지 증명 IPC 섬유. PD-IPC 및 PCL-IPC의 발판 : 우리는이 변화와 복합 발판을 만들어이 나타났다. IPC 섬유의 적용 분야는 PD-PCL과 계 지지체에 통합하기에 한정되지 않고, 잠재적으로 다른 중합 성 시스템으로 확장 될 수있다다른 생체 분자를 전달한다.
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Acknowledgments
이 작품은 우수 연구 센터, 제어 공학 연구소, 싱가포르 중 하나에 의해 관리되는 싱가포르 국립 연구 재단에 의해 지원되었다. MFAC는 1122703037. BKKT는 제어 공학 연구소 지원 연구를위한 과학, 기술 및 연구 기관 (싱가포르) 및 국가 기관 (프랑스) 프로젝트 번호에 따라 공동 프로그램에 의해 지원됩니다. 우리는 증명 판독 비디오 제작에 협조 원고와 양 새벽 JH 네오 씨 다니엘 HC 웡 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
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