Protocol
Polielektrolit Çözümleri 1. Hazırlanması
- Liao ve ark ayrıntılı olarak, kitosan saflaştırılır. Kısaca, bir% 1 oluşturmak% 2 çitosan solüsyonu (w / v) (hacim / hacim) asetik asit ve vakum filtre notu 93 filtre kağıdı kullanılarak. PH 10 dakika boyunca 1.200 xg'de 7. Santrifüj çöktürülmüş kitosan stabilize kadar 5M NaOH kullanılarak süzüntü nötralize eder. Süpernatant boşaltacaktır ve kitosan yıkamak için deiyonize su ilave edilir. Santrifujleme ve yıkama adım iki kez daha tekrarlayın. Saflaştırılmış biçimini elde etmek üzere -80 ° C ve liyofilize edilir, O / N oranında çöktürüldü kitosan dondurun. Bir nemi kabine saflaştırılmış kitosan saklayın.
- Steril doku kültürü kabına saflaştırılmış kitosan 1 gr tartılır. Biyolojik güvenlik kabinine UV lambası mümkün olduğu kadar yakın bir doku kültürü çanağı içinde kitosan yerleştirin ve 15 dakika boyunca UV ışığına maruz kalmaktadır. Steril forseps kullanılarak bir cam kap içine steril kitosan yerleştirin. Çözündürün çitosan 0 süzüldü kullanılarak.% 0.5 ve% 1 arasında bir nihai konsantrasyona kadar 15M asetik asit (a / h).
- Alginik asit, sodyum tuzu 0.1 g tartılır ve (ağırlık / hacim) çözeltisi bir% 1 elde etmek üzere iyondan arındırılmış (DDI), su damıtılmış, 10 ml içinde çözülür. Tam çözünmeyi temin etmek amacıyla vorteks karıştırıcıda, en azından 2 saat boyunca alginik asit sodyum tuzu karıştırın. 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir aljinat çözeltisi filtre. 4 ° C 'de aljinat çözeltisi saklayın.
- Üretici tarafından tavsiye edilen şekilde, sinir büyüme faktörü (NGF), - örneğin vasküler endoteliyal büyüme faktörü (VEGF) veya beta insan rekombinant büyüme faktörleri sulandırın.
IPC Elyaf 2. Çizim
- Benzer bir net yüke sahip polielektrolit çözeltisi 10-20 ul kısım halinde proteinleri, büyüme faktörleri veya diğer biyomoleküllerin karıştırın. Net bir negatif yük (örneğin bovin serum albümini [BSA]) ile Biyolojik moleküller aljinat çözeltisi ile karıştırılır. Net pozitif şarj (örn VEGF) ile Biyolojik moleküller ile karıştırılmalıdırçitosan solüsyonu.
- Parafilm ile kaplı olan bir sabit ve düz bir yüzey üzerinde çitosan ve aljinat az miktar (10-20 ul) yerleştirin. çitosan ve aljinat damlacıkları yakın yerleştirilir fakat birbiri ile temas halinde olmalıdır.
- Hafifçe kitosan ve aljinat damlacıklar halinde forseps bir çift her ucu batırın. Birlikte forseps kısma polielektrolitlerin damlacıklar getirin. Damlacıklarının birbirleriyle temas olduğunda, yavaş yavaş iki damlacıkları (Şekil 1A) arabiriminden IPC fiber çekmek için yukarı dikey forseps çekin.
- Dikkatli bir şekilde dönen mandrel üzerine yapıştırılmış düz bir polimerik iskele olarak bir koleksiyoncu, forseps üzerine çizilen IPC fiberin ucunu yerleştirin (bkz bölüm 3 ve 4). Üniform ve IPC elyaf beadless oluşumuna izin vermek için 10 mm / sn arasında sabit bir hızda mandrel döndürün. Dahil bir patlama salınımına neden olur boncuk oluşturacak IPC lifleri çekme hızını artırmakbiyokimyasal ve erken fiber sonlandırma. 10
- Dahil etkinliğini belirlemek için, geri kalan tüm sıvılar 1X fosfat tamponlu salin içinde 500 ul (PBS) ile sulandırarak parafilm sol toplar. BCA (BSA) deneyi (VEGF ve NGF için) ELISA veya dahil biyomolekülün tespit etmek için uygun bir tahlil ile artığında protein ya da büyüme faktörü içeriğini ölçmek.
Kompozit Hidrojel Pullulan-Dextran'ın İskele (PD) Polisakkarit ve IPC Elyaf 3. Fabrikasyon
- IPC elyaf toplama gözden çıkarılabilir pullulan çerçeve Fabricating
- Pullulan polisakarit tartılır ve (ağ / hac), sulu çözelti% 20 oluşturmak için damıtılmış iyonu giderilmiş (DDI), su ile karıştırılır. Homojenliği sağlamak için pullulan çözüm O / N karıştırın.
- 10 cm çaplı doku kültür polistiren (TCPS) çanak içine pullulan çözeltisi 15 g Cast. 37 ° C'de pullulan çözeltisi O / N kurutun. 7 içine pullulan filmleri kesinmm 7 mm kare kare x.
- Pullulan-dekstran polisakarit çözeltisi hazırlanması
- Bir% 30 oluşturmak polisakaritlerin çözeltisi pullulan ve dekstran (w / v): DDI su (3: 1 oran). Polisakarit çözeltisi homojenliği sağlamak için O / N karıştırın. Yavaş yavaş% 20 bir son konsantrasyon elde etmek için polisakarit çözeltisine sodyum bikarbonat eklemek (a / h). Çözeltinin homojenliği sağlamak için O / N karıştırın. 4 ° C'de polisakarit çözeltisi saklayın.
- Pullulan çerçeve üzerinde IPC lifleri Toplama
- Bir timsah klibi kullanarak kurban pullulan çerçevesi (bölüm 3.1) yapıştırın. Plastik kaplamalı yapışkan bant kullanılarak döner mandrel ucunda timsah klibi ve pullulan çerçeveyi yapıştırın. 10 mm / sn arasında sabit bir hızda yapıştırılmış çerçeve ile mandrel döndürün. pullulan çerçevesi istenilen yönlerde dönen mandrel üzerine yapıştırılmış olabilir.
- Bir forseps çifti (bölüm 1) ve ATTAC kullanarak IPC lifleri Beraberlikh dönen pullulan çerçeve üzerine IPC liflerinin çizilmiş sonu. Sabit bir hızda IPC lifleri çizin. IPC fiber terminal sonuna ulaştıktan sonra, N oda sıcaklığında / fiberler-on-frame yapısı O kurulayın.
- PD hidrojel iskele içine IPC lifleri gömülmesi
- . (W / v) sodyum sulu çözeltisi ve 100 ul 10M sodyum hidroksit trimetafosfat% 11, 100 ul, pullulan-dekstran çözeltisinin, her gram çapraz bağlanması 7 1-2 dakika boyunca, bir stirplate kullanılarak 60 rpm'de çözelti karıştırın. Sodyum trimetafosfat ve sodyum hidroksit ilave edildikten sonra, polisakarit çözeltisi hemen çapraz olacaktır. IPC lifleri tamamen gömmek için lifler-on-frame yapı üzerine viskoz polisakkarit solüsyonu dökün. Kimyasal olarak çapraz bağlanmış kompozit iskeleleri (Şekil 1B) oluşturmak için 30 dakika boyunca 60 ° C de bir araya pullulan-dekstran-IPC lifler (PD-IPC) inkübe edin.
- DİKKAT: davlumbaz adım 3.3.2 uygulayın ve uygun koruyucu equi kullanınasetik asit gibi pment aşındırıcı ve yanıcı bir olduğunu.
- PD-IPC iskele gözenek oluşumunu teşvik etmek için, 20 dakika boyunca% 20 (ağırlık / hacim) asetik asit bütün iskele daldırın.
- 100 rpm ile çalkalanarak bir 5 dakika boyunca 1X PBS içinde yıkama PD-IPC iskeleler, reaksiyona girmemiş reaktifleri çıkarın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
- Aşırı PBS çıkarın ve hemen -80 ° CO / N de PD-IPC iskeleleri dondurma. Iskeleleri herhangi kontrollü salım veya biyoaktivite tahlillerinde kullanımdan önce en az 24 saat liyofilize.
PCL ve IPC Elyaf Kompozit Scaffold 4. Fabrikasyon
DİKKAT: Diklorometan tehlikeli bir malzemedir. Diklorometan işlerken davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman kullanın.
- Bozulmamış ve desenli PDMS yüzeylerde oluşturma
- Yumuşak litografi süreci kullanılarak istenilen boyut TCP'lerin bir parça kullanarak bir bozulmamış polidimetilsiloksan (PDMS) Elastomerik tabaka oluşturun. Patte oluşturİstenilen topografya ile şablonları poli (metil metakrilat) standart yumuşak litografi yöntemleri kullanarak rned PDMS substratlar. 12
- IPC elyaf toplama gözden çıkarılabilir PCL çerçeve Fabricating
- PCL tartılır ve (ağırlık / hacim) çözeltisi bir% 0.9 oluşturmak için diklorometan içinde çözülür. PDMS alt-tabakanın her 1 cm2 bir alan için,% 0.9 PCL çözeltisi 500 ul bırakın. Tam ile duman davlumbazında buharlaşmaya diklorometan çözücü tüm izin verir. Istenilen kalınlıkta filmi kalınlaşmasına% 0.9 PCL döküm işlemi tekrarlayın. PDMS substrat kurutulmuş PCL filmi çıkarın. Bir uygun boyutlu zımba kullanılarak PCL çerçeve içinde bir delik oluşturur. 2
- PCL çerçeve üzerinde IPC lifleri Toplama
- Bir timsah klibi (4.2.1 itibaren) delik ile kurbanlık PCL çerçeveyi yapıştırın. Plastik kaplamalı yapışkan bant kullanılarak dönen mandrel üzerine timsah klibi yapıştırın. PCL Fram üzerine IPC fiber çekilmiş ucunu10 mm / sn (bölüm 2) sabit bir hızda dönme başlamadan önce ör. IPC elyaf çekme sona ermesinden sonra, fiber üzerinde çerçeve yapısı göre O / N 4 ° C'de kurutun.
- Fiber-on-frame desenli PCL alt tabaka içine inşa gömülmesi
- Gerektiği gibi, tertemiz bir ya da desenli PCL tabanı oluşturmak için PDMS substrat üzerine% 0.9 PCL çözeltisi 500 ul bırakın. İstenilen kalınlıkta bir iskele elde etmek için% 0.9 PCL çözümünün çoklu katmanlar Cast. Tam ile duman davlumbazında buharlaşmaya diklorometan çözücü tüm izin verir.
- PCL tabanı üzerine elyaf üzerinde çerçeve yapısı (bölüm 4.3.1) yerleştirin. İstenilen kalınlık elde etmek için fiber-on-frame inşa birden çok kez% 0.9 PCL çözüm ekleyin ve tamamen PCL-IPC kompozit iskele (Şekil 1C) imalatı, IPC lifleri gömün.
Kompozit IPC Yapı iskeleleri Biyolojik Ajanlar Yayın 5. Ölçüm
- Yeri kompozit PD-IPC veyaPCL-IPC iskeleleri ve stand-alone IPC lifler ayrı bir 24 plaka.
- Iskele daldırın ve stand-alone IPC lifleri 1X PBS 500 ul. 37 ° C'de inkübe edin. Çeşitli zaman noktalarında (salım ortamı) PBS toplayın ve 1X 500 ul PBS ile değiştirin.
- Dahil biyomolekülün kümülatif salım profilini hesaplamak için bir BCA tahlili (BSA), ELISA (VEGF ve NGF) ya da diğer uygun bir deney kullanılarak salım ortamı protein ya da büyüme faktörü miktarını ölçün.
Kompozit IPC iskelelerinin üzerinde Hücreleri 6. Tohum Çıkış Biyolojik Ajanlar biyoaktivitesini Test
- En az 20 dakika süreyle biyolojik güvenlik kabini UV ışık kullanılarak liyofilize PD-IPC veya PCL-IPC kompozit iskeleleri sterilize edin.
- 200 ul büyüme ortamı içinde 2 x 10 5 hücre, bir hücre süspansiyonu elde etmek için, standart hücre kültürü teknikleri kullanarak. Kompozit iskeleleri üzerine konsantre hücre süspansiyonu Tohum. After 20 dakika, tam iskeleler batırmak için büyüme ortamı kontör hacmi.
- Böyle Alamar mavisi metabolik aktivite deneyi, PC12 neurite akıbet tahlil ya immünofloresan gibi standart teknikler yoluyla hücre aktivitesini ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede, çeşitli biyomoleküllerin sürekli salınması için IPC lifleri ile kompozit iskeleleri yaratmaya çalıştı. Bu çalışmada kullanılan ve biyomoleküllerin özellikleri Tablo 1 'de görülmektedir. IPC lifler önce bir PD-IPC kompozit iskeleti (Şekil 1B) oluşturmak için bir hidrofilik PD hidrojel içine yerleştirilmiştir. Model molekülü BSA ilk kontrollü biyomolekülün serbest bırakılması için bir kompozit iskele kullanarak fizibilitesini belirlemek için test edilmiştir. BSA 45 ± 0.97% bir verimlilik ile PD-IPC iskeleleri dahil oldu. PD-IPD'ye serbest BSA eşlik eden kararlı devlet tarafından izlenen bir başlangıç zayıflatılmış patlama sürümü (Şekil 2) ile yakın doğrusal kinetik gösterdi. 2 ay sonra, BSA% 97 toplam serbest elde etti. Bunun aksine, bağımsız IPC lifler 4 saat içinde BSA% 80 hızlı salınımını sergiledi.
Sonra, PD-IPC scaffo kullanarak VEGF salım profilini ve biyo kontrollds. VEGF 75.5 ±% 2.7, bir verimlilik ile birleşmiş ve en az 1 hafta (Şekil 3A) için sürekli salınımını göstermiştir. İnsan umbilikal damar endotelyal hücreleri (HUVECler) VEGF'nin biyolojik aktivitesini belirlemek için PD-IPC iskeleler üzerine serpildi. PD-IPC iskeleleri üzerinde HUVECler PD-IPC iskeleleri (Şekil 3B) serbest bırakıldıktan sonra VEGF fonksiyonunun iyi korunması gösteren günde 1 de düz PD iskeleleri ile karşılaştırıldığında Alamar mavisi azalma ve metabolik aktivitede önemli bir artış gösterdi. Gün 3, 6 ve 7 de, Alamar Mavi redüksiyon düz PD iskele (Şekil 3B) ile karşılaştırılabilir düzeyde elde düşmüştür.
PCL-IPC kompozit iskeleleri, aynı zamanda, kontrollü salma için şöyle test ve bağımsız IPC elyaflar ile karşılaştırılmıştır. Biz 66,38 ± 2,71% bir kuruluş verimliliği ile PCL-IPC kompozit iskeleleri içine temsili molekül olarak NGF dahil. PCL-IPC kompozit iskeleleri hattını gösterdiar sürekli salimli ve 18 gün (Şekil 4A), sonra yaklaşık olarak% 80 toplam salma. Öte yandan, IPC tek başına elyaf durgun salım hızı ve ardından, 24 saat içinde% 70 oranında kayma salınışı olmadığını göstermiştir. Bir PC12 nörit gelişimi tahlili kullanarak, serbest NGF (Şekil 4B) biyo-aktivitesini inceledik. PCL-IPC kompozit iskele salma ortamı üzerinde yetiştirilen PC12 hücrelerinin nörit gelişimi 30 ng kültürlenmiş PC12 hücreleri ile benzer seviyelerde gösterdi / ml NGF ortamı desteklenmiştir. Bu serbest NGF en az 7 gün boyunca biyoaktif kaldığını göstermektedir.
Topografya kombinasyonu ve sürekli büyüme faktörü teslim daha iyi hücresel mikro taklit edebilir. PCL-IPC imalat yönlü metodolojisi biochemically- ve topografik kontrollü kompozit iskele yapımını sağladı. Biz nano boyutlu ızgaralar yapısı (NP-PCL-IPC iskelesi) ile bir PCL-IPC kompozit iskelesi fabrikasyon. Biz sinerjik ef gözlenentopografya fect ve insan mezenkimal kök hücreleri (hMSCs) (Şekil 5) nöronal farklılaşma değerlendirerek NGF serbest sürekli. NP-PCL-IPC kompozit iskeleleri üzerinde kültüre hMSCs nöronal farklılaşma gösteren Mikrotübül ilişkili protein 2 (map2) yüksek ifadesi gösterdi. Öte yandan, MAP2 protein ifadesi, sadece NGF serbest veya desenli PCL (NP-PCL) PCL-IPC kültüre hMSCs önemli ölçüde daha düşük olmuştur.
Hidrofilik ve hidrofobik iskeleler içine IPC elyafların Şekil 1. kullanılması. Pozitif (çitosan) ara yüzünde IPC liflerin (A) Çekme ve negatif (alginat) ile doldurulur polielektrolit çözümler. (B) PD-IPC Kompozit oluşturmak için hidrofil PD solüsyonu IPC liflerinin birleşme gösteren şematik diyagram E iskele. Hidrofobik PCL iskele IPC liflerinin birleşme gösteren (C) şematik PCL-IPC kompozit iskele oluşturmak için. Bu rakam Cutiongco ark. Uyarlanmıştır, 2014 7 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PD-IPC kompozit iskele. BSA gelen BSA Şekil 2. Kontrollü salım PD-IPC kompozit iskeleleri dahil oldu ve serbest bırakma BCA deneyi kullanılarak çeşitli zaman noktalarında ölçüldü. Yayımlanan Toplu BSA IPC lifleri dahil (ug) BSA toplam miktarının yüzdesi olarak verilmiştir ve standart sapma ± olarak ortalama yüzde sunulmuştur. Bu rakam Cutiongco ark uyarlanmıştır., 2014 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Kontrollü salım ve PD-IPC kompozit iskele VEGF biyo-. (A) PD-IPC kompozit iskeleler VEGF kümülatif salım profili. VEGF salma VEGF ELISA spesifik kullanarak çeşitli zaman noktalarında ölçülmüştür. Alamar mavisi, metabolik tahlili ile ölçüldüğü haliyle, PD-IPC kompozit iskeleler üzerinde büyümüş endotel hücreleri (B) Hücre canlılığı. İstatistiksel analiz Tukey post-hoc testi ile tek-yönlü ANOVA ile yapılmıştır. * P <0.05 ifade eder. Bu rakam Cutiongco ark uyarlanmıştır., 2014 7 büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakamın.
Şekil 4. Kontrollü salım ve PCL-IPC kompozit iskele NGF biyo-(A). PCL-IPC kompozit iskeleler NGF kümülatif salım profili. NGF salma NGF için ELISA spesifik kullanarak çeşitli zaman noktalarında ölçülmüştür. Ekleme ilk 8 saat boyunca PCL-IPC iskele NGF'nin kümülatif salım profilini gösterir. NGF'nin (B) Biyoaktivite PC12 sinir hücrelerinin büyümesinin ile ölçüldüğü gibidir. PC12 sonucudur görüntü analizi ile ölçülmüştür. Bu rakam Teo ve ark. Uyarlanmıştır, 2014 2 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
.jpg "/>
Şekil NP-PCL-IPC iskele üzerinde hMSC 5. Farklılaşma. HMSC Konfokal tarama mikroskobu görüntüsü farklı kompozit iskelelerinin üzerinde kültüre. (A) NP-PCL-IPC, (B), NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) Pristine PCL iskeleler. Yeşil leke MAP2, yani nöronal bir nesilden işaretleyici ifade eder. Kırmızı leke hücresel iskeletinin gösteren F-aktin gösterir. Mavi leke çekirdeği gösterir. Bu rakam Teo ve ark. Uyarlanmıştır, 2014 2 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo kompozit IPC iskeleler kontrollü salım için kullanılan biochemicals 1. Özellikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IPC lifler, iki bir birbirine zıt yüklü polielektrolitlerin etkileşimi ile oluşturulmaktadır. işlem stabil lif oluşumu için bir kendi kendine-montaj işlemi kolaylaştırmak polielektrolitlerin arayüzünden kompleksinin çıkarma kullanmaktadır. IPC elyaf formasyonu mekanizması, benzer yüklü polielektrolit kompleks işlemi sırasında dahil edilebilir herhangi bir biyomolekül ilave sağlar. 10,11 Bunun aksine, bir birbirine zıt yüklü polielektrolit bir biyo-molekülün eklenmesi anında çökelti oluşturmasına neden olur. IPC lifler için basit bir imalat yöntemi bu tür hücreler, büyüme faktörleri ve küçük moleküller gibi çeşitli biyolojik malzeme içeren çok yönlülük verir. IPC elyafların bu kritik bir özelliği, aynı zamanda, farklı fiziksel ve biyomoleküler özellikleri (şarj ve moleküler ağırlık) ile büyüme faktörleri, yüksek verimlilik ile dahil edilmiştir PD-IPC ve PCL-IPC kompozit iskeleler, hem de gözlenmiştir. Kontra olarakst, VEGF ve NGF için mikroküre yöntemleri kullanılarak kapsülleme verimliliği sırasıyla% 16, 6 ve 8,% 13 kadar düşük olabilir.
PD-IPC ve PCL-IPC iskeleleri ikisi de biyomolekül sürümü zamansal kontrolünü gösterdi. PD-IPC iskeleler VEGF'nin en az 7 gün boyunca, doğrusal bir salım sergilemiştir. Tersine, polimer mikro-VEGF salım profilleri, toplam VEGF içeriğinin en az% 60 serbest, 24 saat içinde, bir ilk patlama serbest göstermediğini rapor etmektedir. 5,14,15 Benzer NGF PCL-IPC gelen büyüme faktörü teslim maruz kalmış gösterilmiştir iskeleleri, diğer polimerik tabanlı büyüme faktörü verme sistemleri sürümü 20 gün serbest bir plato gösterirken. 13,16 Muhtemelen, kompozit iskelelerinin farklı bileşenleri hem büyüme faktörü bırakma kinetiği katkıda bulunur. Polimer gevşeme mekanizmaları, gözeneklilik ve eğrilik büyük ölçüde hidrofilik biyomoleküllerin salınımını etkileyebilir. 17 Buna ek olarak, cpolimerik iskele hemical özellikleri biyomolekülün salınımını etkileyen büyüme faktörleri karşı elektrostatik çekim ve itme olabilir. Bu nedenle, polimer iskeletin özellikleri geçici olarak kontrollü serbest bırakılması ile salım profilleri ve biyomoleküllerin belirlenmesi çok önemlidir. PD skafold, poli (vinil alkol) ile yakın lineer BSA salınmasını benzer bir kompozit iskele gösterdi Örneğin, hidrojel BSA'ya geçirgenliği yoktu. Geçirgenliği belirlemek için ön test gerektirebilir IPC elyaflar ile kombinasyon halinde kullanılabilen 18 polimerik yapı iskelesi aralık.
Kontrollü serbest biyokimyasal ek olarak, büyüme faktörleri biyo-aktivitesini korumak için kapasitesi bir biyomolekülün dağıtım sistemi için önemli bir özelliktir. PD solüsyonu sert alkali ortamı ve PCL organik çözücü DKM varlığı biyomoleküllerin her türlü aşağılamak potansiyeline sahiptir. Örneğin mikrosfer dağıtım sdiklorometan kullanılan istem bağlı NGF'nin bozunmasına zaman noktası artan biyo-azalan istikrarlı bir trend göstermiştir. 16 Yine de, VEGF ve NGF'nin biyoaktivitesinin daha IPC liflerin önemli bir avantajı, bileşik içinde asimile tekrarladı korunur görülmektedir iskeleler.
kolay bir şekilde toplu iskele içine dahil edilebilir bir geçici, biyo-uyumlu bir polisakarit veya polimerik çerçevenin kullanılması, farklı konfigürasyonlarda hizalanmış birden fazla IPC lifleri olan bir kompozit iskele oluşturmak için esnekliği sağlar. 7 Bu nedenle, polimer iskeleleri tatbik edilmesi gereklidir IPC lifleri ile bir yığın iskele içine daha fazla asimilasyon için kapasitesine sahiptir. Asimilasyon süreci tamamen polimerik iskele içine IPC lifleri gömme önemlidir. Biz de kolayca toplu PD solvent veya içinde çözüldü kurban pullulan ve PCL çerçeveleri, bu olguyu gözlenenPCL iskele. Ayrıca, IPC imalat ve biyomolekülün katılmak için tek adımlı bir yöntem, tek bir bileşik iskele tarafından teslim edilebilir biyomoleküllerin sayısına esneklik verir. metodolojinin basitlik de polielektrolit kimliği veya konsantrasyonu değiştirerek kuruluş verimlilik ve salım kinetiği ince ayar veriyor. Doğal polielektrolitler kitosan ve aljinat hayvansal dokularda bulunan çeşitli ECM karbonhidrat, yüksek yük yoğunluğu ve benzerlik nedeniyle kullanılmıştır. Yine de metil ile kollajen ve terpolimer 8,19 veya kitin ve alginat 20 aynı zamanda değişken etkilere IPC elyaf formasyonu için kullanılabilmektedir. Farklı kinetik ayrıca çok fonksiyonlu kompozit iskele oluşturmak için elde edilebilir ile Birden IPC lifleri farklı biyokimyasal ipuçlarını bırakın. Örneğin, IPC liflerin yüklenen gibi fibronektin olarak ekstraselüler matriks proteinleri mekansal kontrollü hücre yapışması için bir platform sağlayabilir. 7 Sürekliantibiyotik ve büyüme faktörlerinin salınması doku yenilenmesi uygulamaları için tercih edilir. Bu hidrofobik, küçük moleküllü ilaçlar ve kompozit yapı iskelesi farklı bölümlerinde hidrofilik, protein bazlı büyüme faktörleri dahil PCL-IPC kullanılarak mümkün olabilir. 2
Bizim sunulan metodoloji de topografik ve biyokimyasal ipuçları hem bir iskele yapımını izin verdi. Biz NP-PCL-IPC iskele biyofiziksel ve biyokimyasal hücresel niş birden yönlerini taklit hücre davranışını yönlendiren yararlı olduğunu ima nöronal nesilden içine hMSC farklılaşma yüksek artışı olduğu görülmüştür. sunulan metodolojinin kolaylığı çapraz süreci önemli ölçüde IPC lif bütünlüğünü etkilemez koşuluyla böyle bir poliakrilamid 21 veya polietilen glikol 22 gibi diğer patternable polimerik sistemlerin, onun uygulanmasını sağlar. Örneğin, PD iskeleleri CH olduğuOrtam ve sulu koşullar altında cereyan ettiği özel çapraz bağlama mekanizmasına Bu çalışmada osen. 24 Bu durum potansiyel olarak daha fazla fizyolojik olarak in vitro ve in vivo çalışmalar ile ilgili substratlar sağlayabilir. Buna ek olarak, bileşik bir yapı iskeleti IPC lifleri gömme gerilme mukavemetini temin IPC elyafların 23 arasında mekanik mukavemeti eksikliği üstesinden gelebilir. Gerçekten de, PCL 25, yüksek mekanik dayanıklılığına seçildi.
Özet olarak, bıyomolekul teslimat için kompozit iskeleleri oluşturmak için basit bir yöntem tarif edilmiştir. Bu biyo-etkinliği ve kuruluş etkinliğini bozmadan biyomoleküllerin uzun süreli aktarım için de kullanılabilir kadar IPC lifler gösterdi. PD-IPC ve PCL-IPC iskeleleri: Biz iki varyasyonları ile kompozit iskeleleri oluşturarak bu gösterdi. IPC liflerin Uygulanabilirlik PD ve PCL-bazlı iskeleleri dahil ile sınırlı değildir, ama potansiyel olarak diğer polimerik sistemlere uzatılabilirve diğer biyomoleküllerin teslim etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu eser Mükemmeliyet onun Araştırma Merkezleri, mechanobiology Enstitüsü, Singapur biri tarafından yönetilen Singapur Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir. MFAC 1122703037. BKKT mechanobiology Enstitüsü tarafından desteklenen Araştırma Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı (Singapur) ve Ulusal Ajans (Fransa) projesi numarası altında ortak program tarafından desteklenmektedir. Biz kanıt okuma video yapımında yardımcı olmak için el yazması ve Bayan Şafak JH Neo Sayın Daniel HC Wong teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
- Annabi, N., Tamayol, A., et al. 25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).
- Rui, J., Dadsetan, M., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- King, T. W., Patrick, C. W. Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique. J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).
- Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution. Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).
- Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).
- Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold. Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).
- Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes. J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).
- Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation. Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).
- Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves. Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).
- Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery. Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).
- Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds. Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).
- Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres. Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).
- Lee, P. I. Kinetics of drug release from hydrogel matrices. J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).
- Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).
- Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).
- Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres. Nat. Commun. 4, 2353 (2013).
- Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography. Nanotechnology. 16 (5), S165 (2005).
- Revzin, A., Russell, R. J., et al. Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography. Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).
- Yim, E. K. F., Liao, I. C. Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility. Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).
- Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).
- Eshraghi, S., Das, S. Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering. Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).
