Protocol
1. Preparação de Soluções de polielectrólito
- Purifica-se o quitosano, conforme detalhado na Liao et ai. Resumidamente, criar uma solução a 1% de quitosano em 2% (w / v) (v / v) de ácido acético e de vácuo filtro usando papel de filtro de grau 93. Neutraliza-se o filtrado utilizando NaOH 5M até que o pH estabilizou a 7. Centrifugar o quitosano precipitado a 1.200 xg durante 10 min. Decantar o sobrenadante e adicionar água desionizada para lavar o quitosano. Repetir o passo de lavagem e centrifugação mais duas vezes. Congelar a quitosana precipitado a -80 ° C e liofilizar O / N para se obter a forma purificada. Armazenar quitosana purificada num armário desumidificado.
- Pesar 1 g de quitosana purificada em um estéril de cultura de tecidos prato. Coloque a quitosana no prato de cultura de tecidos tão perto quanto possível a luz UV na câmara de segurança biológica e expor à luz UV durante 15 min. Utilizando uma pinça estéril, colocar a quitosana esterilizado em um recipiente de vidro. Dissolver quitosana usando filtrada 0.15M de ácido acético até uma concentração final entre 0,5% e 1% (w / v).
- Pesar 0,1 g de sal de sódio do ácido algínico e dissolver em 10 mL de água desionizada (DDI) de água destilada para se obter um 1% (w / v) de solução. Misturar o sal de sódio do ácido algínico, durante pelo menos 2 horas no misturador de vórtice para garantir a dissolução completa. Filtra-se a solução de alginato através de filtro de seringa de 0,2 um. Guardar a solução de alginato a 4 ° C.
- Reconstituir factores de crescimento recombinantes humanas tais como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou beta - fator de crescimento neural (NGF), como recomendado pelo fabricante.
2. Desenho de Fibras IPC
- Misturar proteínas, factores de crescimento ou outras biomoléculas em 10-20 ul alíquota da solução de polielectrólito que tem uma carga global semelhante. Moléculas biológicas com carga negativa (por exemplo, soro albumina bovina [BSA]) líquido deve ser misturado com solução de alginato. As moléculas biológicas com carga positiva (por exemplo, VEGF) deve ser misturado comsolução de quitosano.
- Coloque pequenas aliquotas (10-20 ul) de quitosana e alginato sobre uma superfície plana e estável que é coberta com parafilme. As gotas de alginato de chitosano e deve ser colocado em estreita proximidade, mas não estão em contacto uns com os outros.
- Levemente mergulhe cada ponta em um par de fórceps nas gotículas de quitosana e alginato. Traga as gotas de polieletrólitos em conjunto por beliscar a pinça. Quando as gotículas entram em contacto uns com os outros, lentamente puxar a pinça na vertical para cima, para chamar a fibra IPC a partir da interface das duas gotas (Figura 1A).
- Com cuidado, coloque a extremidade da fibra desenhada IPC sobre a pinça sobre um coletor, como um andaime polimérico plano aposta em um mandril rotativo (consulte a secção 3 e 4). Rodar o mandril a uma velocidade constante de 10 mm / s para permitir a formação de fibras uniforme e beadless IPC. Aumentando a velocidade de desenho das fibras IPC irá formar grânulos, que irá causar uma libertação brusca de incorporadaterminação de fibra bioquímica e prematura. 10
- Para determinar a eficiência de incorporação, recolher todos os líquidos remanescentes deixado no parafilme por diluição com 500 mL de 1X tampão fosfato salino (PBS). Medir o teor de proteína com factor de crescimento ou no resíduo através de ensaio BCA (para BSA), ELISA (para o VEGF e o NGF) ou um ensaio adequado para detectar biomolécula incorporada.
3. Fabricação de Composite Hidrogel Andaime de pululano-dextrano (PD) polissacarídeo e Fibras IPC
- Fabricando quadro pululano sacrificial para a coleta de fibra IPC
- Pesar pululano polissacárido e misturar com água desionizada destilada (DDI) de água para criar uma 20% (w / v) de solução aquosa. Misturar a solução de pululano O / N para assegurar a homogeneidade.
- De molde 15 g de uma solução de pululano em de 10 cm de diâmetro de poliestireno de cultura de tecidos (TCPS) prato. Seca-se a solução de pululano O / N a 37 ° C. Corte os filmes de pululano em 7mm x 7 milímetros quadros quadrados.
- Preparar solução de polissacárido pululano-dextrano
- Criar uma solução a 30% dos polissacáridos de pululano e dextrano (w / v) (3: 1) em água DDI. Misturar O / N para assegurar a homogeneidade da solução de polissacárido. Adiciona-se lentamente em bicarbonato de sódio à solução de polissacárido para atingir uma concentração final de 20% (w / v). Misturar O / N para assegurar a homogeneidade da solução. Guardar a solução de polissacárido, a 4 ° C.
- Coletando fibras IPC no quadro pululano
- Apor a moldura pululano sacrificial (ponto 3.1) usando um jacaré. Furar o jacaré e estrutura pululano no final do mandril rotativo usando fita adesiva revestida de plástico. Rodar o mandril com o quadro afixada a uma velocidade constante de 10 mm / seg. O quadro de pululano pode ser afixada sobre o mandril em rotação em orientações desejadas.
- Desenhe as fibras IPC usando um par de fórceps (seção 1) e attach, a fim de as fibras desenhada IPC sobre a armação rotativa pululano. Desenhe as fibras IPC a uma velocidade constante. Ao alcançar a extremidade terminal da fibra IPC, secar o construto fibras ó-em-quadro / N à temperatura ambiente.
- Incorporação fibras IPC em PD hidrogel andaime
- Para reticular cada grama de solução de pululano-dextrano, adicionar 100 ul de 11% (w / v), trimetafosfato de sódio e solução aquosa de hidróxido de sódio 10M 100 ul. 7 Misture a solução a 60 rpm usando um stirplate para 1 a 2 min. Após a adição de trimetafosfato de sódio e hidróxido de sódio, a solução de polissacárido vai reticular quase imediatamente. Despeje a solução de polissacarídeo viscoso para a construção de fibras-on-frame para incorporar totalmente as fibras do IPC. Incubar as fibras de pululano-dextrano combinado IPC (IPC-PD), a 60 ° C durante 30 minutos para formar um andaimes compostos quimicamente reticulados (Figura 1B).
- CUIDADO: Execute o passo 3.3.2 no exaustor e utilizar equi proteção adequadovolvimento como o ácido acético é um corrosivo e inflamável.
- Para induzir a formação de poros no andaime PD-CIP, submergir todo o andaime em 20% (w / v) de ácido acético durante 20 min.
- Remover os reagentes que não reagiram por lavagem andaimes PD-CIP em 1X PBS durante 5 min, agitando a 100 rpm. Repita esta etapa duas vezes.
- Retire o excesso de PBS e congelar imediatamente os andaimes PD-IPC a -80 ° CO / N. Liofilizar os andaimes, pelo menos, 24 horas antes da utilização em quaisquer ensaios de libertação ou de bioatividade controladas.
4. Fabricação de Composite Andaime de PCL e Fibras IPC
CUIDADO: Diclorometano é um material perigoso. Use a coifa e equipamentos de proteção individual ao manusear diclorometano.
- Criação de substratos PDMS puras e padronizadas
- Criar um polidimetilsiloxano intocada (PDMS) substrato elastomérico usando um pedaço de TCPS de dimensão desejada usando o processo de litografia macia. Criar pattePDMS rned substratos, usando métodos padrão suaves litográficas de poli (metacrilato de metilo) moldes com a topografia desejada. 12
- Confecção de sacrifício PCL quadro para a recolha de fibra IPC
- Pesar PCL e dissolver em diclorometano, para se criar um 0,9% (w / v) de solução. Para cada 1 cm2 de área do substrato PDMS, gota a 500 ul de solução a 0,9% de PCL. Permitir que todo o solvente se evapore completamente diclorometano, na hotte. Repetir o processo de fundição 0,9% de PCL para engrossar a película com a espessura desejada. Remover a película de PCL seca a partir do substrato de PDMS. Criar um buraco no PCL quadro usando um perfurador de dimensões adequadas. 2
- Coletando fibras IPC na armação PCL
- Apor a moldura PCL sacrificial com furo (de 4.2.1) em um jacaré. Furar o jacaré para o mandril rotativo usando fita adesiva revestida de plástico. Fixe a extremidade da fibra desenhada IPC para o fram PCLe antes de iniciar a rotação a uma velocidade constante de 10 mm / sec (seção 2). Após o final do estiramento de fibra IPC, secar a fibra-a-quadro constructo O / N a 4 ° C.
- Incorporação de fibra-on-frame construção em substrato PCL modelado
- Gota a 500 ul de solução a 0,9% de PCL sobre o substrato PDMS para criar uma base de PCL ou modelado como novo, como necessário. Fundido múltiplas camadas de uma solução de PCL 0,9% para se obter um andaime com a espessura desejada. Permitir que todo o solvente se evapore completamente diclorometano, na hotte.
- Coloque a construção de fibra-a-quadro (secção 4.3.1) na parte superior da base de PCL. Adicionar solução de 0,9% de PCL sobre os vários tempos de fibra-a-quadro construir para obter a espessura desejada e incorporar totalmente as fibras IPC, fabricando um andaime composta IPC-PCL (Figura 1C).
5. Medição da disseminação de agentes biológicos a partir Composite IPC Andaimes
- Coloque compósito PD-IPC ouAndaimes PCL-IPC e stand-alone fibras IPC separadamente em uma placa de 24 poços.
- Mergulhe o andaime e stand-alone fibras IPC com 500 mL de 1X PBS. Incubar as amostras a 37 ° C. Recolhe PBS a vários pontos de tempo (libertação media) e substituir com 500 ul de PBS 1X.
- Medir a quantidade de proteína ou de factor de crescimento nos meios de libertação utilizando um ensaio BCA (BSA), ELISA (VEGF e NGF) ou outro teste adequado para calcular o perfil de libertação cumulativa para a biomolécula incorporada.
6. Sementeira de Células no Composite IPC Andaimes para testar Bioatividade de Agentes Biológicos Lançado
- Esterilizar os scaffolds compostos PD-IPC ou PCL-IPC liofilizados utilizando luz UV na cabine de segurança biológica por pelo menos 20 min.
- Utilizar técnicas padrão de cultura de células para se obter uma suspensão de células de 2 x 10 5 células em 200 ul de meio de crescimento. Semente da suspensão de células concentradas sobre os scaffolds compostos. After 20 min, top-up o volume de meio de crescimento para submergir completamente os andaimes.
- Medir a atividade das células através de técnicas convencionais, tais como ensaio de actividade Alamar azul metabólica, ensaio excrescência de neurites PC12 ou imunofluorescência.
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Representative Results
Neste artigo, buscou-se criar scaffolds compósitos com fibras de IPC para a libertação controlada de várias biomoléculas. Características das biomoléculas utilizadas neste estudo encontram-se na Tabela 1. Fibras de IPC foram incorporados primeiramente em um hidrogel hidrofílico PD para criar um andaime composta PD-CIP (Figura 1B). Molécula modelo BSA foi testado pela primeira vez para determinar a viabilidade da utilização de um andaime composto para liberação controlada de biomoléculas. BSA foi incorporada andaimes PD-IPC, com uma eficiência de 45 ± 0,97%. BSA libertada da DP-IPD mostraram cinética quase linear com uma libertação brusca inicial atenuada seguido por um estado estacionário concomitante (Figura 2). Após 2 meses, a BSA conseguida uma libertação total de 97%. Em contraste, fibras independentes IPC exibiu uma libertação rápida de 80% de BSA dentro de 4 hr.
Em seguida, fizemos o perfil de libertação e bioactividade do VEGF usando PD-IPC Scaffolds. VEGF foi incorporada com uma eficiência de 75,5 ± 2,7%, e mostraram uma libertação prolongada durante pelo menos 1 semana (Figura 3A). As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram semeadas em andaimes PD-IPC para determinar a bioactividade do VEGF. HUVECs sobre os andaimes PD-IPC mostraram um aumento significativo na redução Alamar azul e atividade metabólica em comparação com andaimes PD simples no dia 1, indicando boa preservação da função VEGF após ser liberado da andaimes PD-IPC (Figura 3B). Alamar redução azul nos dias 3, 6 e 7 diminuiu para atingir níveis comparáveis com o PD andaime simples (Figura 3B).
Os suportes compósitos PCL-IPC também foram testados quanto à libertação controlada e comparados com fibras IPC independentes. Nós incorporamos NGF como uma molécula representante nas andaimes compósitos PCL-IPC com uma eficiência incorporação de 66,38 ± 2,71%. PCL-IPC andaimes compósitos mostraram linhalibertação sustentada ar e cerca de 80% de libertação cumulativa após 18 dias (Figura 4A). Por outro lado, a IPC stand-alone fibra mostrou uma libertação brusca de 70% dentro de 24 horas seguida de uma taxa de libertação estagnada. Utilizando um ensaio de crescimento de neurites PC12, foi examinada a bioactividade do NGF libertada (Figura 4B). O crescimento de neurites de células PC12 cultivadas em PCL-IPC mídia liberação andaime composto apresentaram níveis semelhantes com células PC12 em cultura em 30 ng / ml de NGF suplementado mídia. Isto indica que o NGF bioactivo libertado permaneceu durante pelo menos 7 dias.
Combinação de topografia e fator de crescimento sustentado entrega podem mimetizar o microambiente celular melhor. A metodologia versátil de PCL-IPC fabricação permitiu a fabricação de um andaime e compósito biochemically- controlado por topograficamente. Nós fabricou um andaime composto PCL-estrutura IPC com grades de tamanho nano (NP-PCL-IPC andaime). Observamos a ef sinérgicafect da topografia e libertação sustentada de NGF através da avaliação de diferenciação neuronal de células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs) (Figura 5). hMSCs cultivadas nos andaimes compostos NP-PCL-IPC mostraram maior expressão de proteína do microtúbulo associado 2 (MAP2), indicativa de diferenciação neuronal. Por outro lado, a expressão da proteína MAP2 foi substancialmente inferior em hMSCs cultivadas em PCL-CIP apenas com libertação de NGF ou modelado PCL (NP-PCL).
Figura 1. A incorporação de fibras de IPC para andaimes hidrofílicos e hidrofóbicos. (A) Desenho de fibras de IPC na interface da positivamente (quitosano) e negativamente (alginato) soluções polielectrólitos carregados. (B) Diagrama esquemático mostrando a incorporação de fibras IPC em solução PD hidrofílico para criar PD-IPC composit e andaime. (C) Diagrama esquemático mostrando a incorporação de fibras IPC em hidrofóbico andaime PCL para criar PCL-IPC andaime composto. Este valor é adaptado de Cutiongco et al., 2014. 7 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A libertação controlada de BSA a partir de DP-CIP andaime composta. BSA foi incorporada PD-IPC andaimes compósitos e a sua libertação foi medido em vários pontos de tempo utilizando o ensaio de BCA. BSA cumulativa libertada é fornecido como uma percentagem da quantidade total de BSA (em ug) incorporado nas fibras IPC e são apresentados como percentagem média ± desvio padrão. Este valor é adaptado de Cutiongco et al., 2014. 7"target =" _ blank /www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Controlado liberação e bioactividade do VEGF de PD-IPC andaime composto. (A) perfil de libertação cumulativa de VEGF de PD-IPC scaffolds compostos. Libertação de VEGF foi medida a vários pontos de tempo, utilizando ELISA específico para VEGF. (B) A viabilidade celular das células endoteliais cultivadas em DP-IPC andaimes compósitos, como medido pelo ensaio de azul de Alamar metabólica. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey. * Indica p <0,05. Este valor é adaptado de Cutiongco et al., 2014. 7 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Controlado liberação e bioactividade de NGF a partir de PCL-IPC andaime composto. (A) perfil de libertação cumulativa de NGF a partir de PCL-IPC scaffolds compostos. Libertação do NGF foi medido em vários pontos de tempo, utilizando ELISA específico para NGF. Inserir mostra o perfil de libertação cumulativa de NGF a partir de PCL-CIP andaime para o primeiro 8 h. (B) A bioactividade do NGF tal como medido por crescimento de células neuronais PC12. PC12 crescimento foi medido por meio de análise de imagem. Este valor é adaptado de Teo et al., 2014. 2 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5. Diferenciação de hMSC sobre NP-PCL-IPC andaime. Image microscopia de varredura confocal de hMSC cultivadas em diferentes scaffolds compostos. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) andaimes PCL Pristine. Mancha verde denota MAP2, um marcador de linhagem neuronal. Mancha vermelha indica a F-actina, que mostra o citoesqueleto celular. Mancha azul indica o núcleo. Este valor é adaptado de Teo et al., 2014. 2 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Características dos bioquímicos utilizados para liberação controlada de andaimes IPC compostas.
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Discussion
IPC fibras são formados pela interacção de dois polielectrólitos de cargas opostas. O processo utiliza a extracção do complexo a partir da interface de os polielectrólitos, facilitar um processo de auto-montagem para a formação da fibra estável. O mecanismo de formação da fibra IPC assegura que qualquer biomolécula adicionados a um polielectrólito de forma semelhante carregada pode ser incorporado durante o processo de complexação. 10,11 Inversamente, a adição de uma biomolécula para o polielectrólito de carga oposta resultará na precipitação instantânea. A metodologia para a fabricação simples fibras IPC empresta versatilidade na incorporação de vários materiais biológicos tais como células, factores de crescimento e moléculas pequenas. Esta característica crítica de fibras de IPC também foi observada em ambos os suportes compósitos PD-IPC e PCL-IPC, em que os factores de crescimento com diferentes propriedades físicas e biomoleculares (carga e peso molecular) foram incorporados com alta eficiência. Em contrapartidar, eficiência de encapsulação usando metodologias de microsferas para o VEGF e o NGF pode ser tão baixa quanto 16% e 6% 8 13, respectivamente.
Ambos PD-IPC e andaimes PCL-IPC também demonstraram controle temporal de liberação de biomoléculas. VEGF de andaimes PD-IPC mostrou liberação linear durante pelo menos 7 dias. Em contraste, perfis de libertação de VEGF relatados a partir de microesferas poliméricas apresentaram uma libertação brusca inicial dentro de 24 h, libertando pelo menos 60% do teor total de VEGF. 5,14,15 Da mesma forma, o NGF foi mostrado ter sofrido factor de crescimento de entrega de PCL-CIP andaimes, ao passo que outros sistemas de entrega à base de factor de crescimento poliméricos mostram um patamar de libertação a partir de 20 dias de libertação. 13,16 Presumivelmente, os diferentes componentes dos andaimes compostos contribuem ambos para a cinética de libertação do factor de crescimento. Mecanismos de relaxação do polímero, porosidade e tortuosidade pode afectar grandemente a libertação de biomoléculas hidrofílicas. 17 Além disso, o chemical características do andaime polimérico pode ter atração eletrostática e repulsa em relação aos fatores de crescimento que afeta liberação biomolécula. Assim, as características do andaime polimérico são críticos na determinação de perfis de libertação e biomoléculas com libertação controlada temporalmente. Por exemplo, enquanto o andaime PD mostraram uma libertação quase linear de BSA, um andaime composto similar, usando poli (álcool vinílico) hidrogel faltava permeabilidade a BSA. 18 suportes poliméricos que podem ser utilizados em combinação com fibras IPC pode exigir testes preliminares para determinar a sua permeabilidade intervalo.
Além de libertação controlada bioquímica, a capacidade para reter a bioactividade de factores de crescimento é uma característica importante para qualquer sistema de entrega de biomoléculas. O ambiente alcalino rigoroso da solução PD e a presença de solvente orgânico em DCM PCL têm o potencial de degradar qualquer tipo de biomoléculas. Por exemplo, a entrega de microesferas sistema que utilizado diclorometano mostrou uma tendência consistente de diminuir com o aumento da bioactividade ponto de tempo, devido à degradação de NGF. 16 No entanto, observou-se que a bioactividade do VEGF e o NGF é mantido, repetindo ainda que uma vantagem importante das fibras IPC são assimilados no interior do compósito andaimes.
A utilização de um polissacárido biocompatível sacrificial ou armação polimérica que pode ser facilmente incorporada no andaime grandes quantidades confere a versatilidade para criar um andaime composta com várias fibras IPC alinhadas em diferentes configurações. 7 Assim, é necessário que os suportes poliméricos para ser aplicado com fibras IPC têm capacidade para mais de assimilação em um andaime em massa. O processo de assimilação é importante para incorporar totalmente as fibras do IPC para o cadafalso polimérico. Observamos esse fenômeno no pululano sacrificial e quadros PCL, que foram ambos facilmente dissolvido no solvente do PD granel ouAndaime PCL. Além disso, o método de um único passo para a fabricação e IPC biomolécula incorporação dá flexibilidade para o número de biomoléculas que pode ser entregue por um único composto de andaime. A simplicidade da metodologia permite também o ajuste fino das eficiência incorporação e libertação cinética mudando de identidade ou concentração de polieletrólito. O quitosano polielectrólitos naturais e alginato foram utilizados devido à sua elevada densidade de carga e semelhança com vários carboidratos ECM encontrado em tecidos animais. No entanto, o colagénio metilado e terpolímero 8,19 ou quitina e alginato de 20 também pode ser usado para a formação da fibra IPC para efeitos variados. Várias fibras IPC libertar diferentes sinais bioquímicos com diferentes cinéticas também pode ser alcançado para criar um compósito de multi-funcional de andaime. Por exemplo, as proteínas da matriz extracelular, tais como fibronectina carregados em fibras IPC pode fornecer uma plataforma para a adesão celular espacialmente controlada. 7 sustentadoliberação de antibióticos e de factores de crescimento também são desejáveis para aplicações de regeneração de tecidos. Isto pode ser possível usando PCL-CIP, que pode incorporar hidrófobas, drogas de moléculas pequenas, e factores de crescimento hidrófilos à base de proteínas em diferentes compartimentos do andaime composta. 2
Nossa metodologia apresentada também permitiu a fabricação de um andaime com as duas pistas topográficos e bioquímicos. Observamos que o andaime NP-PCL-IPC teve o maior aumento da diferenciação hMSC na linhagem neuronal, o que implica que imita vários aspectos do nicho celular biofísica e bioquímica é benéfico em direcionar o comportamento das células. A facilidade da metodologia apresentada permite a sua aplicação a outros sistemas poliméricos patternable tais como poliacrilamida 21 ou polietilenoglicol 22, desde que o processo de reticulação não irá afectar significativamente a integridade da fibra IPC. Por exemplo, andaimes PD foram chosen neste estudo para o seu mecanismo de reticulação única que ocorre em condições ambientes aquosos e 24. Isto pode potencialmente proporcionar mais substratos fisiologicamente relevantes para in vitro e estudos in vivo. Além disso, a incorporação de fibras IPC em um andaime composto pode superar a falta de resistência mecânica de fibras IPC 23, proporcionando resistência à tração. Com efeito, PCL 25 foi escolhido pela sua elevada resistência mecânica.
Em resumo, um método simples para a criação de andaimes compósitos para entrega biomolécula foi descrito. Nós demonstramos como fibras IPC pode ser usado para a entrega sustentada de biomoléculas sem comprometer a sua bioactividade e a eficácia de incorporação. Nós mostramos isso criando scaffolds compostos com duas variações: PD-IPC e andaimes PCL-IPC. Aplicabilidade de fibras de IPC não está limitado à incorporação na PD- e andaimes baseados em PCL, mas pode ser potencialmente alargada a outros sistemas poliméricose para entregar outras biomoléculas.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Pesquisa Nacional de Cingapura administrado por um dos seus centros de investigação de excelência, o Instituto mechanobiology, Cingapura. MFAC é apoiada pela Agência da Ciência, Tecnologia e Pesquisa (Singapura) e Agência Nacional de Investigação (França) programa conjunto com o número 1122703037. BKKT projeto é apoiado pelo Instituto mechanobiology. Agradecemos ao Sr. Daniel HC Wong para o manuscrito e Ms. Amanhecer JH Neo para auxiliar na produção de vídeo de leitura de prova.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
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- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
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