Protocol
1. Preparazione di polielettrolita Solutions
- Purificare chitosano, come dettagliato in Liao et al. Brevemente, creare un 1% (w / v) di chitosano a 2% (v / v) di acido acetico e filtro di vuoto usando grade 93 carta da filtro. Neutralizzare il filtrato utilizzando 5M NaOH fino a pH stabilizzato per 7. Centrifugare chitosano precipitato a 1.200 xg per 10 min. Decantare il surnatante e aggiungere acqua deionizzata per lavare il chitosano. Ripetere la fase di centrifugazione e lavaggio altre due volte. Congelare il chitosano precipitato a -80 ° C e lyophilize O / N avere la forma purificata. Conservare chitosano purificato in un armadio deumidificato.
- Pesare 1 g di chitosano purificato in un piatto di coltura tissutale sterili. Posizionare il chitosano nella cultura piatto tessuti più vicino possibile alla lampada UV nella cappa di sicurezza biologica ed esporre alla luce UV per 15 min. Utilizzando pinze sterili, collocare il chitosano sterilizzato in un contenitore di vetro. Sciogliere chitosano utilizzando filtrato 0.15M acido acetico ad una concentrazione finale compresa tra 0,5% e 1% (w / v).
- Pesare 0,1 g del sale sodico dell'acido alginico e sciogliere in 10 ml deionizzata (DDI) di acqua distillata per ottenere una soluzione all'1% (w / v). Mescolare il sale sodico dell'acido alginico per almeno 2 ore sul vortex per garantire la completa dissoluzione. Filtrare la soluzione di alginato attraverso 0,2 micron filtro siringa. Conservare la soluzione di alginato a 4 ° C.
- Ricostituire fattori umani ricombinanti crescita come fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) o beta - nerve growth factor (NGF), come raccomandato dal costruttore.
2. Disegno di fibre IPC
- Mescolare proteine, fattori di crescita o altre biomolecole in 10-20 microlitri aliquota della soluzione polielettrolita che ha una carica netta simile. Molecole biologiche con carica negativa (ad esempio albumina di siero bovino [ASC]) al netto deve essere miscelato con la soluzione di alginato. Molecole biologiche con carica positiva netta (ad esempio VEGF) devono essere mescolati consoluzione chitosano.
- Inserire piccole aliquote (10-20 mL) di chitosano e alginato su una superficie piana e stabile che è coperto con parafilm. Le goccioline di chitosano e alginato devono essere posti in prossimità ma non in contatto tra loro.
- Leggermente immergere ogni punta su un paio di pinze nelle chitosano e alginato goccioline. Portare le goccioline di polielettroliti insieme stringendo la pinza. Quando le goccioline entrano in contatto tra loro, tirare lentamente la pinza verticalmente verso l'alto per disegnare la fibra IPC dall'interfaccia delle due gocce (Figura 1A).
- Posizionare accuratamente l'estremità della fibra IPC disegnato sulla pinza su un collettore, ad esempio una matrice polimerica piatta apposto su un mandrino rotante (vedere la sezione 3 e 4). Ruotare il mandrino ad una velocità fissa di 10 mm / sec per permettere la formazione di uniforme e beadless fibre IPC. Aumentando la velocità di trarre le fibre IPC formeranno perline, che provocherà una raffica di rilascio incorporataterminazione fibra biochimica e prematura. 10
- Per determinare l'efficienza di incorporazione, raccogliere tutte le rimanenti liquidi lasciati sul parafilm diluendo con 500 ml di 1X tampone fosfato salino (PBS). Misurare la proteina o la crescita dei contenuti fattore residuo attraverso BCA assay (per BSA), ELISA (per VEGF e NGF) o un test appropriato per rilevare biomolecola incorporato.
3. Realizzazione di composito Hydrogel impalcatura di Pullulan-destrano (PD) polisaccaride e Fibre IPC
- Realizzazione telaio pullulan sacrificale per la raccolta fibra IPC
- Pesare polisaccaride pullulan e mescolare con deionizzata distillata (DDI) acqua per creare un 20% (w / v) in soluzione acquosa. Mescolare la soluzione pullulan O / N per assicurare l'omogeneità.
- Cast 15 g di soluzione di pullulano in un 10 centimetri coltura di tessuti diametro polistirene (TCPS) piatto. Asciugare la soluzione pullulan O / N a 37 ° C. Tagliare i film pullulano in 7mm x 7 mm cornici quadrate.
- Preparazione soluzione polisaccaride pullulano destrano
- Creazione di un 30% (w / v) di polisaccaridi pullulan e destrano (rapporto 3: 1) in acqua DDI. Mescolare O / N per assicurare l'omogeneità della soluzione polisaccaride. Aggiungere lentamente in bicarbonato di sodio alla soluzione di polisaccaride per ottenere una concentrazione finale del 20% (w / v). Mescolare O / N per assicurare l'omogeneità della soluzione. Conservare la soluzione polisaccaride a 4 ° C.
- Raccolta fibre IPC sul telaio pullulano
- Fissare il telaio pullulan sacrificale (punto 3.1) con un coccodrillo. Stick il coccodrillo e cornice pullulan sull'estremità del mandrino rotante con nastro adesivo plastificato. Ruotare il mandrino con il telaio affisso a una velocità costante di 10 mm / sec. Il telaio pullulan può essere apposto sul mandrino rotante orientamenti desiderati.
- Disegnare le fibre IPC con un paio di pinze (sezione 1) e attach fine disegnato delle fibre IPC sul telaio pullulan rotante. Disegnare le fibre IPC a velocità costante. Raggiunta l'estremità terminale della fibra IPC, asciugare il costrutto O fibre-on-frame / N a RT.
- Incorporare fibre IPC nel PD idrogel ponteggio
- Per reticolare ogni grammo di soluzione pullulan-destrano, aggiungere 100 ml di 11% (w / v) di sodio trimetafosfato soluzione acquosa e idrossido di sodio 10M 100 microlitri. 7 Mescolare la soluzione a 60 rpm con una stirplate per 1 a 2 min. Dopo l'aggiunta di trimetafosfato di sodio e idrossido di sodio, la soluzione polisaccaride sarà reticolare quasi immediatamente. Versare la soluzione polisaccaride viscosa sul costrutto fibre-on-frame da incorporare completamente le fibre IPC. Incubare le fibre pullulan-destrano-IPC combinate (PD-IPC) a 60 ° C per 30 minuti per formare un reticolato chimicamente scaffold compositi (Figura 1B).
- ATTENZIONE: Eseguire il punto 3.3.2 della cappa e il corretto utilizzo equi di protezionepment come acido acetico è un corrosivo e infiammabile.
- Per indurre la formazione di pori nella scaffold PD-IPC, immergere l'intera impalcatura nel 20% (w / v) di acido acetico per 20 min.
- Rimuovere i reagenti che non hanno reagito per lavaggio impalcature PD-IPC in 1X PBS per 5 minuti agitando a 100 rpm. Ripetere questa operazione 2 volte.
- Rimuovere l'eccesso di PBS e congelare immediatamente i ponteggi PD-IPC a -80 ° CO / N. Lyophilize i ponteggi, almeno 24 ore prima dell'utilizzo in qualsiasi rilascio o di bioattività dosaggi controllati.
4. Realizzazione di composito impalcatura di PCL e fibre IPC
ATTENZIONE: diclorometano è una sostanza pericolosa. Utilizzare la cappa e dispositivi di protezione personale quando si impiega diclorometano.
- Creazione incontaminate e fantasia PDMS substrati
- Creare un polidimetilsilossano incontaminato (PDMS) substrato elastomerico con un pezzo di TCPS di dimensione desiderata mediante processo di litografia soffice. Crea pattePDMS rned substrati utilizzando metodi litografiche soft di serie di poli (metilmetacrilato) modelli con la topografia desiderata. 12
- Realizzazione sacrificale telaio PCL per la raccolta fibra IPC
- Pesare PCL e sciogliere in diclorometano per creare un 0,9% (w / v). Per ogni 1 cm 2 superficie del substrato PDMS, goccia 500 ml di soluzione di PCL 0,9%. Consentire tutto il solvente diclorometano di evaporare completamente nella cappa. Ripetere il processo di colata 0,9% PCL per addensare il film fino allo spessore desiderato. Rimuovere la pellicola PCL essiccato dal substrato PDMS. Creare un foro nel telaio PCL utilizzando un perforatore di dimensioni adeguate. 2
- Raccolta fibre IPC sul telaio PCL
- Fissare il telaio PCL sacrificale con foro (da 4.2.1) in un coccodrillo. Attaccare il coccodrillo sul mandrino rotante utilizzando nastro adesivo plastificato. Collegare l'estremità tratto della fibra IPC sul fram PCLe prima di iniziare la rotazione ad una velocità costante di 10 mm / sec (sezione 2). Dopo la fine del IPC filatura della fibra, asciugare la fibra-on-frame costrutto O / N a 4 ° C.
- Incorporare fibra-on-frame costrutto in fantasia substrato PCL
- Cada 500 ml di soluzione di PCL 0,9% sul substrato PDMS di creare una base PCL incontaminata o fantasia, come richiesto. Cast strati multipli di soluzione PCL 0,9% per ottenere un ponteggio con lo spessore desiderato. Consentire tutto il solvente diclorometano di evaporare completamente nella cappa.
- Posizionare il costrutto fibra-on-frame (sezione 4.3.1) sulla parte superiore della base PCL. Aggiungere la soluzione PCL 0,9% sui più volte fibra-on-frame costruire per ottenere lo spessore desiderato e incorporare completamente le fibre IPC, fabbricare un ponteggio composita PCL-IPC (Figura 1C).
5. Misura di emissione di agenti biologici da Composite IPC Ponteggi
- Mettere in composito PD-IPC oImpalcature PCL-IPC e stand-alone fibre IPC separatamente in una piastra da 24 pozzetti.
- Immergere il patibolo e stand-alone fibre IPC con 500 ml di PBS 1X. Incubare i campioni a 37 ° C. Raccogliere PBS in vari momenti (Comunicato stampa) e sostituirlo con 500 ml di PBS 1X.
- Misurare la quantità di proteine o di fattore di crescita nei mezzi di rilascio utilizzando un saggio BCA (BSA), ELISA (VEGF e NGF) o altri test appropriato calcolare il profilo di rilascio cumulativo per la biomolecola incorporato.
6. Semina di Celle compositi IPC Ponteggi testare bioattività di agenti biologici Usciti
- Sterilizzare i liofilizzati PD-IPC o PCL-IPC ponteggi compositi usando la luce UV nella cappa di sicurezza biologica per almeno 20 minuti.
- Utilizzare tecniche standard di coltura cellulare per ottenere una sospensione di cellule di 2 x 10 5 cellule in 200 microlitri terreni di crescita. Seme la sospensione cellulare concentrata sulle impalcature compositi. After 20 min, top-up il volume di terreni di crescita per immergere completamente i ponteggi.
- Misurare l'attività delle cellule attraverso tecniche standard quali Alamar blu metabolico attività di analisi, PC12 neurite saggio escrescenza o immunofluorescenza.
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Representative Results
In questo articolo, abbiamo cercato di creare impalcature compositi con fibre IPC per il rilascio prolungato di diverse biomolecole. Caratteristiche delle biomolecole utilizzati in questo studio sono presentati nella tabella 1. Fibre IPC sono stati incorporati in un PD idrogel idrofila per creare un'impalcatura composita PD-IPC (Figura 1B). Modello molecola BSA è stata testata prima di determinare la possibilità di utilizzare un ponteggio in composito per il rilascio controllato biomolecole. BSA è stata incorporata in impalcature PD-IPC con efficienza del 45 ± 0,97%. BSA rilasciato dal PD-IPD mostrava una cinetica quasi lineare con un rilascio scoppio attenuato iniziale seguita da uno stato stazionario concomitante (Figura 2). Dopo 2 mesi, BSA ha raggiunto una liberazione totale del 97%. Al contrario, le fibre IPC standalone mostravano un rapido rilascio di 80% di BSA entro 4 ore.
Successivamente, abbiamo controllato il profilo di rilascio e bioattività di VEGF con PD-IPC Scaffolds. VEGF è stato incorporato con un'efficienza di 75,5 ± 2,7%, e ha mostrato un rilascio prolungato per almeno 1 settimana (Figura 3A). Ombelicale cellule endoteliali umane della vena (HUVECs) sono state seminate sui ponteggi PD-IPC per determinare la bioattività di VEGF. HUVECs sui ponteggi PD-IPC ha mostrato un aumento significativo in blu riduzione Alamar e l'attività metabolica rispetto scaffold PD pianura giorno 1, indicando buona conservazione della funzione VEGF dopo essere stato liberato dalla impalcature PD-IPC (Figura 3B). Blu riduzione Alamar nei giorni 3, 6 e 7 è sceso a raggiungere livelli paragonabili con il PD ponteggio pianura (Figura 3B).
Le impalcature compositi PCL-IPC sono stati testati anche per il rilascio controllato e confrontati con fibre IPC standalone. Abbiamo inserito NGF come molecola rappresentante nelle impalcature compositi PCL-IPC, con un rendimento incorporazione di 66.38 ± 2.71%. PCL-IPC scaffolds compositi mostrato lineaar rilascio prolungato e circa l'80% di rilascio cumulativo dopo 18 giorni (figura 4A). D'altra parte, IPC stand-alone fibra ha mostrato un rilascio scoppio 70% entro 24 ore seguita da un tasso di rilascio stagnante. Utilizzando un saggio escrescenza PC12 neurite, abbiamo esaminato la bioattività del NGF rilasciato (Figura 4B). La crescita dei neuriti di cellule PC12 coltivate su PCL-IPC Media rilascio patibolo composito ha mostrato livelli simili con cellule PC12 in coltura in 30 ng / ml NGF integrato dei media. Ciò indica che il NGF rilasciato rimasto bioattivo per almeno 7 giorni.
Combinazione di topografia e il fattore di crescita sostenuta consegna possono mimare il microambiente cellulare meglio. La metodologia versatile di PCL-IPC fabbricazione ha permesso la realizzazione di un biochemically- e scaffold composito topograficamente controllato. Abbiamo inventato un ponteggio composita PCL-IPC con struttura griglie di dimensioni nanometriche (NP-PCL-IPC patibolo). Abbiamo osservato l'ef sinergicofetto della topografia e sostenuta rilascio NGF valutando la differenziazione neuronale di cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) (Figura 5). hMSCs coltivate sulle impalcature compositi NP-PCL-IPC hanno mostrato maggiore espressione della proteina associata Microtubule 2 (MAP2), indicativo di differenziamento neuronale. D'altra parte, l'espressione della proteina MAP2 era sostanzialmente inferiore a hMSCs coltivati su PCL-IPC con soltanto rilascio NGF o fantasia PCL (NP-PCL).
Figura 1. Incorporazione di fibre IPC in impalcature idrofili e idrofobi. (A) Disegno di fibre IPC a livello di interfaccia di positivo (chitosano) e negativamente (alginato) soluzioni polielettrolita cariche. (B) Schema che mostra incorporazione di fibre IPC in soluzione PD idrofila per creare PD-IPC composit e patibolo. (C) Schema che mostra incorporazione di fibre IPC in idrofoba PCL patibolo per creare PCL-IPC patibolo composito. Questa cifra è adattato da Cutiongco et al., 2014. 7 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. rilascio controllato di BSA da PD-IPC patibolo composito. BSA è stata incorporata in PD-IPC scaffolds compositi e il suo rilascio è stata misurata in vari momenti con test BCA. BSA cumulativo rilasciato viene fornito come una percentuale della quantità totale di BSA (in mg) incorporati nelle fibre IPC e sono rappresentati percentuale media ± deviazione standard. Questa cifra è adattato da Cutiongco et al., 2014. 7/www.jove.com/files/ftp_upload/53079/53079fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. rilascio controllato e bioattività di VEGF da PD-IPC patibolo composito. (A) profilo di rilascio cumulativo di VEGF da PD-IPC scaffolds compositi. Rilascio di VEGF è stata misurata in vari momenti con ELISA specifico per VEGF. (B) La vitalità cellulare delle cellule endoteliali coltivate su PD-IPC scaffold compositi, come misurato da Alamar blue assay metabolica. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando una via ANOVA con test post-hoc di Tukey. * Denota p <0.05. Questa cifra è adattato da Cutiongco et al., 2014. 7 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. rilascio controllato e bioattività di NGF da PCL-IPC patibolo composito. (A) profilo di rilascio cumulativo di NGF da PCL-IPC scaffolds compositi. Rilascio NGF è stata misurata in vari momenti con ELISA specifico per NGF. Inserire mostra profilo di rilascio cumulativo di NGF da PCL-IPC patibolo per la prima 8 ore. (B) bioattività di NGF misurata come conseguenza di cellule neurali PC12. PC12 conseguenza è stata misurata attraverso l'analisi delle immagini. Questa cifra è adattato da Teo et al., 2014. 2 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5. Differenziazione hMSC su NP-PCL-IPC patibolo. Confocale a scansione immagine al microscopio di hMSC coltivate su diversi ponteggi compositi. (A) NP-PCL-IPC, (B) NP-PCL, (C) PCL-IPC, (D) ponteggi PCL incontaminate. Verde macchia denota MAP2, un marker linea neuronale. Macchia rossa indica F-actina, che mostra il citoscheletro cellulare. Blu macchia indica il nucleo. Questa cifra è adattato da Teo et al., 2014. 2 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Caratteristiche delle sostanze biochimiche utilizzate per il rilascio controllato da impalcature IPC compositi.
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Discussion
Fibre IPC sono formate dall'interazione di due polielettroliti carica opposta. Il processo utilizza l'estrazione del complesso dall'interfaccia dei polielettroliti, facilitando il processo di auto-assemblaggio di fibra formazione stabile. Il meccanismo di formazione della fibra IPC garantisce che qualsiasi biomolecola aggiunto nella polielettroliti con carica simile può essere incorporato durante il processo di complessazione. 10,11 contrario, l'aggiunta di una biomolecola nel polielettrolita carica opposta determina la precipitazione istantanea. La semplice metodologia di fabbricazione per le fibre IPC presta versatilità nell'integrazione vari materiali biologici come cellule, fattori di crescita e molecole di piccole dimensioni. Questa caratteristica critica di fibre IPC è stata anche osservata in entrambi i ponteggi in composito PD-IPC e PCL-IPC, in cui i fattori di crescita con diverse proprietà fisiche e biomolecolari (carica e peso molecolare) sono stati incorporati con alta efficienza. In contrast, efficienza incapsulamento utilizzando metodologie microsfere per VEGF e NGF può essere basso come 16% 6 e 8% 13, rispettivamente.
Sia PD-IPC e ponteggi PCL-IPC hanno anche dimostrato il controllo temporale del rilascio biomolecole. VEGF da impalcature PD-IPC ha mostrato rilascio lineare per almeno 7 giorni. Al contrario, ha riferito VEGF profili di rilascio di microsfere polimeriche hanno mostrato un rilascio scoppio iniziale entro 24 ore, rilasciando almeno il 60% del contenuto totale di VEGF. 5,14,15 Allo stesso modo, NGF ha dimostrato di avere una crescita sostenuta fattore consegna da PCL-IPC impalcature, mentre altri sistemi di lancio fattore di crescita basato polimerici, presentano un plateau di rilascio da 20 giorni dalla pubblicazione. 13,16 Presumibilmente, le diverse componenti dei ponteggi compositi entrambi contribuiscono fattori di crescita cinetica di rilascio. Meccanismi di rilassamento Polymer, porosità e tortuosità possono influenzare notevolmente il rilascio di biomolecole idrofili. 17 Inoltre, il ccaratteristiche ad agenti chimici del ponteggio polimerico può avere attrazione elettrostatica e repulsione verso i fattori di crescita che colpisce rilascio biomolecole. Così, le caratteristiche della matrice polimerica sono critici nel determinare profili di rilascio e biomolecole con rilascio temporalmente controllato. Ad esempio, mentre il ponteggio PD mostrato rilascio pressoché lineare BSA, un'impalcatura composita simile usando poli (vinil alcool) idrogel mancava permeabilità al BSA. 18 scaffold polimerici che possono essere utilizzati in combinazione con fibre IPC può richiedere test preliminare per determinare la permeabilità gamma.
Oltre a rilascio controllato biochimica, la capacità di trattenere la bioattività di fattori di crescita è una caratteristica importante per qualsiasi sistema di consegna biomolecola. L'ambiente alcalino duro della soluzione PD e la presenza di solvente organico DCM in PCL hanno il potenziale di degradare qualsiasi tipo di biomolecole. Ad esempio, la consegna microsfere sistema che ha utilizzato diclorometano ha mostrato un trend costante di diminuzione bioattività con l'aumento timepoint a causa del degrado di NGF. 16 Tuttavia, abbiamo osservato che la bioattività del VEGF e NGF viene mantenuta, inoltre ribadendo che un vantaggio chiave di fibre IPC sono assimilati all'interno del composito impalcature.
L'uso di un sacrificale, polisaccaride biocompatibile o telaio polimerico che può essere facilmente incorporato in scaffold bulk dà la versatilità per creare un'impalcatura composita con fibre multiple IPC allineate in diverse configurazioni. 7 Pertanto, è necessario che i supporti polimerici da applicare con fibre IPC hanno la capacità di ulteriore assimilazione un'impalcatura bulk. Il processo di assimilazione è importante incorporare completamente fibre IPC nella matrice polimerica. Abbiamo osservato questo fenomeno nel pullulan sacrificale e cornici PCL, entrambe facilmente disciolta nel solvente del PD rinfusa oPatibolo PCL. Inoltre, il metodo a passo singolo per IPC fabbricazione e biomolecole incorporazione dà la flessibilità per il numero di biomolecole erogabile da un unico ponteggio composito. La semplicità della metodologia permette anche la messa a punto delle efficienza costitutivo e rilascio cinetica cambiando identità polielettrolita o la concentrazione. Il polielettroliti naturali chitosano e alginato sono stati utilizzati per la sua alta densità di carica e somiglianza vari carboidrati ECM trovati nei tessuti animali. Eppure collagene metilato e terpolimero 8,19 o chitina e alginato 20 possono essere utilizzati anche per la formazione della fibra IPC a diversi effetti. Fibre IPC multiple rilasciano diversi segnali biochimici con differenti cinetiche possono essere realizzati per creare un composito ponteggio multifunzionale. Per esempio, le proteine della matrice extracellulare, come fibronectina caricati in fibre IPC possono fornire una piattaforma per l'adesione cellulare controllato spazialmente. 7 SOSTENUTErilascio di antibiotici e fattori di crescita sono anche auspicabili per le applicazioni di rigenerazione dei tessuti. Questo può essere possibile utilizzando PCL-IPC, che può includere idrofobiche, farmaci piccola molecola e idrofili, fattori di crescita a base di proteine in diversi comparti del patibolo composito. 2
La nostra metodologia presentata anche permesso la realizzazione di un ponteggio con due spunti topografiche e biochimici. Abbiamo osservato che il patibolo NP-PCL-IPC aveva la più alta valorizzazione del hMSC differenziazione in linea neuronale, il che implica che imitando molteplici aspetti della nicchia cellulare biofisico e biochimico è utile nel dirigere il comportamento cellulare. La facilità della metodologia presentata permette la sua applicazione ad altri sistemi polimerici patternable come poliacrilammide 21 o polietilene glicole 22, a condizione che il processo di reticolazione non influenzerà significativamente integrità fibra IPC. Ad esempio, ponteggi PD erano chosen in questo studio per il suo meccanismo di reticolazione unica che si verifica in condizioni ambientali e acquose. 24 Ciò può potenzialmente fornire più fisiologicamente rilevanti per substrati in vitro e in vivo. Inoltre, incorporando fibre IPC in un ponteggio composito può supplire alla mancanza di resistenza meccanica delle fibre IPC 23 fornendo resistenza alla trazione. Infatti, PCL 25 è stato scelto per la sua elevata resistenza meccanica.
In sintesi, è stato descritto un metodo semplice per la creazione di ponteggi compositi per la consegna biomolecole. Abbiamo dimostrato come fibre IPC può essere utilizzato per la consegna costante di biomolecole, senza compromettere la sua bioattività e l'efficienza di incorporazione. Abbiamo dimostrato con la creazione di impalcature compositi con due varianti: PD-IPC e ponteggi PCL-IPC. Applicabilità di fibre IPC non è limitato a incorporazione in PD- e scaffold PCL-based, ma può essere potenzialmente esteso ad altri sistemi polimericie per fornire altre biomolecole.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale delle Ricerche Singapore amministrata da uno dei suoi Centri di Ricerca di eccellenza, l'Istituto mechanobiology, Singapore. MFAC è sostenuta dall'Agenzia per la Scienza, Tecnologia e Ricerca (Singapore) e l'Agenzia Nazionale per la Ricerca (Francia) programma comune con il numero 1122703037. BKKT progetto è sostenuto dall'Istituto mechanobiology. Ringraziamo il Sig Daniel HC Wong per il manoscritto e la signora Alba JH Neo per contribuire alla realizzazione di video di lettura a prova di.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pullulan | Hayashibara Inc Okayama Japan | Molecular weight (MW) 200 kDa. This material is pharmaceutical grade pullulan used to make pullulan frames and PD-IPC scaffolds. | |
| Dextran | Sigma Aldrich | D1037 | MW 500 kDa. This material is no longer being produced by Sigma Aldrich. Alternative suggested is catalog number 31392 (Sigma Aldrich). This material is used to make PD-IPC scaffolds. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Sodium bicarbonate must be slowly added to the pullulan-dextran polysaccharide solution. Rapid addition of sodium bicarbonate will result in precipitation. |
| Sodium Trimetaphosphate | Sigma Aldrich | T5508 | This chemical is hygroscopic and must be stored in the dehumidifying cabinet. Aqueous solution of sodium trimetaphosphate must always be made fresh. |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | This material is hazardous and must be handled with proper protective equipment such as nitrile gloves. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | 448877 | MW 190-310 kDa. Acetylation degree of 75% to 85%. Purification of chitosan is required to create stable IPC fibers. |
| Acetic Acid | Merck | This can be replaced by another brand type. This material is corrosive and flammable. Protective equipment such as face shield, nitrile gloves, lab coat and shoe cover must be worn when handling this chemical in the fume hood. | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae, low viscosity | Sigma Aldrich | A2158 | Dissolve in water overnight. Filter through sterile 0.2 µm syringe filter before use. Store at 4 °C. |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent | Dissolve in sterile PBS and filter using 0.2 µm syringe filter before use. | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | This kit was used to measure BSA release from PD-IPC scaffolds. |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor | R&D systems | 293-VE | Dissolve growth factor in 0.2% heparin solution to a final concentration of 5 mg/ml. |
| Heparin Sodium Salt From Porcine | Sigma Aldrich | H3393 | This can be replaced by another brand type. Dissolve heparin salt in sterile water at a final concentration of 1% and filter through 0.2 µm syringe filter before use. |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Lonza | C2517A | This primary cell type was used in the assay to determine VEGF bioactivity after release from PD-IPC scaffolds. |
| Alamar blue | Life Technologies | DAL1025 | This is used to measure cell metabolic activity. Incubate Alamar blue with cells and maintain in standard cell culture conditions for 2 to 4 hours. Measure absorbance at 570 nm to determine Alamar blue percent reduction, which is correlated to the cell activity. |
| ScanVac Coolsafe Lyophilizer | Labogene | 7.001.200.060 | This is a non-programmable freeze dryer that operates at -105 to -110 °C. This can be replaced by other standard lab lyophilizers. |
| Polycaprolactone (PCL) | Sigma Aldrich | 181609 | MW 65 kDa. This is no longer being manufactured by Sigma Aldrich. This can be replaced by Sigma Aldrich catalog number 704105. |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | V800151 | This can be replaced by another brand type. This material is hazardous and must be handled in the fume hood. Protective equipment must be worn at all times when handling this chemical. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS; 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow Corning | (240)4019862 | The elastomer kit comes with polymer base and crosslinker. Mixing the polymer base and crosslinker in different ratios will result in different stiffness of the PDMS. |
| Human Recombinant Beta-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D systems | 256-GF | Reconstituted in sterile DI water to a final concentration of 100 µg/ml. Aliquot and store in -20 °C until use. |
| Human Mesenchymal Stem Cells (hMSC) | Cambrex | This cell type was used in the assay to determine synergistic effect of NGF and nanotopography. | |
| Rat PC12 Pheochromocytoma Cells | ATCC | This cell type was used in the neurite outgrowth assay to determine bioactivity of NGF. After exposure to release media with NGF, measure number of cells with neurite extensions and normalize to total number of cells. | |
| Grade 93 filter paper | Whatman | Z699675 | This is used for the purification of chitosan after its precipitation with sodium hydroxide at pH 7. |
| Swing bucket centrifuge | Eppendorf | 5810R | To be used during the purification of chitosan using 1,200 x g speed. |
| Motor with mandrel rotating at constant speed | Rhymebus | RM5E | The motor is used for the fabrication of IPC fibers on pullulan or PCL frame. |
| Phosphate buffered saline | FirstBase | Sterilize through filtration (0.2 µm filter) and autoclave. | |
| 10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS) | Greiner | The TCPS dish is used for casting of pullulan frame. | |
| Human VEGF ELISA kit | R&D systems | DVE00 | The ELISA kit is used for detection of VEGF in the release medium. |
| Human NGF ELISA kit | R&D systems | DY256 | The ELISA kit is used for detection of NGF in the release medium. |
| Plastic Coated Adhesive Tape | Bel-Art | 9040336 | The adhesive tape is used to securely stick the alligator clip to the rotating mandrel |
References
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- Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
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