Bredspredning og immunfarvning af gærkromosomer
Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
Den knopskydende gær Saccharomyces cerevisiae giver mange fordele til undersøgelser af molekylære mekanismer i biologiske processer, herunder analyse af de proteiner, der styrer kromosom funktion. Selv om der er velkendte fordele ved knopskydende gær af genetiske, molekylære og biokemiske undersøgelser, er cytologiske undersøgelser af fordelingen af proteiner i cellens kerne kompliceret af dens lille størrelse. Den typiske gær kerne har en diameter på mindre end en mikron, som kun er omkring 5 gange opløsningsgrænsen af synligt lys. Således er mængden af information om fordelingen af nukleare proteiner, der kan opnås fra konventionelle immunfarvning eller ved anvendelse af fluorescerende protein-tags, såsom grønt fluorescerende protein (GFP), er begrænset. En nyttig metode til at karakterisere den subnuclear fordeling af proteiner er kromosom overflade spreder. Denne fremgangsmåde indebærer at fjerne cellevæggen, forstyrre celle og nukleare membraner, og enllowing de uopløselige indhold kernen til afvikling på overfladen af et objektglas. Disse uopløselige bestanddele indbefatter det nukleare matrix og kromosomerne. Udover at tillade fjernelse af opløselige nukleare indhold, som forbedrer evnen til at detektere kromatin bundne proteiner, kromosomet sprede metode resulterer i væsentlig dekompression af kromosomer, således at de spredte kerner har diametre på omkring 3 til 5 um (for diploide meiotiske kerner) og 2 til 3 um til diploide mitotiske kerner. Denne dekompression tillader detektering af nuklear understruktur, som er forholdsvis vanskeligt eller umuligt at løse i intakte kerner.
En indlysende mangel på kromosom spredning er muligheden at spreading procedure delvist eller fuldstændigt kan forstyrre strukturen af interesse. Af særlig bekymring er, at et bestemt kromosom bundet protein kan gå tabt som følge af spredningen procedure. Denne potentielle komplikation should skal holdes for øje ved fortolkning af data. Et eksempel på et protein, der er følsom over for spredning procedure er beta-tubulin. Under visse betingelser spindlen, som består hovedsagelig af tubulin, bevares under spredning 3. Visualisering af spindlen er ofte nyttigt at fase kerner af interesse. Men visualisere tubulin kræver behandling med en høj koncentration fiksativ; spindler er tabt under de standardbetingelser, der er beskrevet nedenfor. Dette eksempel illustrerer, at, når man analyserer fordelingen af en tidligere ukarakteriseret protein, er det vigtigt at variere koncentrationen af fiksativ til at bestemme, hvor følsom proteinet er at sådan variation. På trods af bekymring for virkningen af de spreder betingelser på kromosom struktur, har nytte og magt sprede metoden blevet påvist i mange sammenhænge og har bred anvendelighed i karakterisering af mitotiske og, især meiotiske celler 4-7.
Two spredning fremgangsmåder er blevet anvendt i udstrakt grad. Den første af disse metoder, udviklet af Dresser og Giroux 8, undgår brugen af rengøringsmiddel og kan rentespændet præparater, der synes at have relativt velbevaret kromosom morfologi når farves for DNA-specifikke farvestof DAPI. Imidlertid er relativt vanskelige at perfektionere denne fremgangsmåde og kvaliteten af de spredte kerner varierer dramatisk, når en region i en objektglasset i forhold til andre regioner. Dette problem kan komplicere kvantitative metoder, der involverer billeddannelse mange fravalgte kerner fra et dias for at undgå data erhvervelse bias. Den anden kromosom sprede metode, udviklet af Loidl og Klein 1, indebærer afvejning fiksering af paraformaldehyd, med lyse og kromatin dekompression fremmes af en rengøringsmiddel. Når udføres korrekt, denne metode giver meget reproducerbare resultater med mindre region-til-region variation sammenlignet med Dresser og Giroux metoden. Denne præsentation fokuserer på en modifiéd version af metoden ifølge Loidl og Klein, på grund af dens pålidelighed og enkelhed.
Kromosom spreder er ikke kompliceret eller tidskrævende; op til 100 slides kan være forberedt til immunfarvning på en enkelt dag. Endvidere kan de spredte præparater opbevares i fryseren i årene før immunfarvning, og dermed labs kan udvikle et lager af frosne kromosomspredninger, der kan bruges, når nye biologiske spørgsmål opstår eller nye farvningsreagenser bliver tilgængelige.
Kromosomet spredning metode er mest almindeligt anvendt i kombination med immunfarvning og Vidvinklet fluorescensmikroskopi, men det er også muligt at fremstille dias til super-beslutning lys mikroskopiske metoder såsom stimuleret emission depletion (STED) mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
References
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
- Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. , (1988).
- Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).
- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
