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Biology

表面扩散和酵母染色体免疫染色

doi: 10.3791/53081 Published: August 9, 2015

Introduction

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在芽殖酵母提供了许多优势,为生物过程的分子机制,包括控制染色体功能的蛋白质的研究研究。虽然有出芽酵母基因,分子和生物化学研究的公知的优点,蛋白质在细胞核分布的细胞学研究是由它的小尺寸复杂。典型的酵母核的直径小于一微米,这是可见光的只有约5倍的分辨率极限。因此,对核蛋白质,可以从常规的免疫染色或通过使用荧光蛋白标记,如绿色荧光蛋白(GFP)来获得的分配信息的数量是有限的。一个有用的方法来表征蛋白质的亚核的分布是染色体的表面扩散。该方法包括去除细胞壁,扰乱细胞和核膜,和一个llowing核的不溶性内容沉降到显微镜载玻片的表面上。这些不溶性组分包括核基质和染色体。除了允许去除可溶性核内容,从而增强检测的染色质结合的蛋白质的能力,所述染色体扩频方法导致染色体大幅度减压,使得传播核具有的直径约3至5微米的(对于二倍体减数分裂核)和2至3微米为二倍体有丝分裂核。这种减压使检测核亚结构是相对困难或不可能解决在完整的细胞核。

一个明显的缺点,以染色体扩频这样的可能性,即在扩展过程可以部分或完全破坏感兴趣的结构。特别值得关注的是,一个特定的染色体结合蛋白可能会丢失作为扩展过程的结果。这种潜在的并发症寿LD解释数据时必须牢记这一点。的蛋白质的一个例子是于扩展过程敏感的β-微管蛋白。在某些情况下,主轴,其由主要的微管蛋白,被扩频3中保存。主轴的可视化往往是有益的舞台感兴趣的原子核。然而,可视化微管蛋白需要有高浓度的固定剂处理;主轴下述的标准条件下丢失。这个实施例说明,在分析以前未表征的蛋白质的分布时,它改变固定液以确定蛋白质如何敏感是这种变化的浓度是重要的。尽管关于扩频条件对染色体结构的影响的关注,扩展方法的实用性和功率已被证明在许多情况下,具有在有丝分裂的表征,特别是减数分裂细胞4-7广泛的用途。

TWø扩频方法已被广泛使用。第一这些方法,通过修整和吉鲁8研制,避免了使用洗涤剂的,并且可以得到显示时染色的DNA特异性染料DAPI具有相对保存良好染色体形态传播的制剂。然而,这种方法是比较困难的完善和传播核的质量显着地发生变化,当一个滑动件的一个区域被与其他区域相比。这个问题变得更复杂,涉及很多成像细胞核未选定从一个幻灯片,以避免数据采集偏见定量方法。第二种染色体传播方法,通过Loidl和克莱因1发达,要平衡固定由多聚甲醛,用裂解和染色质解由洗涤剂溶液提升。当适当地进行,该方法提供了用更少的区域对区域的变化非常可重复的结果相比,德莱和吉鲁方法。本演讲将重点在modified版,因为它的可靠性和简易Loidl和克莱因的方法,。

染色体扩展并不复杂或费时;高达100幻灯片可以用于免疫染色在一天制备。此外,传播制剂可贮存在冷冻多年之前免疫染色,因此实验室可以开发冷冻染色体差,可以当新的生物问题出现的或新的染色试剂变得可用可使用的存储库。

染色体扩频方法是最常用的与免疫染色和宽场荧光显微镜组合,但是也可能制备载玻片超分辨率光学显微镜方法如受激发射损耗(STED)显微镜。

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Protocol

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注:以下一些步骤的协议要求在清洁通风橱工作。另外,该方法需要一个酵母四分体解剖显微镜配备一个10X长工作距离物镜并监控原生质球。显微镜应设置在提前罩。取出显微手臂和板夹从范围和放置这些物品在安全的地方,远离工作区。

1.准备原生质球

  1. 生长所需条件下酵母。使用约2×10 8个细胞的每个样品,如4毫升培养的在OD 600 1.4 = 5×10 7个细胞/ ml。虽然样品的即时处理可以优选在某些情况下,对于大多数应用,细胞等份可以存储在冰上达8小时处理之前。
  2. 转移细胞悬液至15ml离心管中,自旋在临床离心机中以设置图5(2345转/ 857.5 XG)处理3分钟,以沉淀细胞。 倒出培养基照顾不从粒料输细胞。轻轻重悬细胞于1ml ZK缓冲,然后添加40微升的1M二硫苏糖醇(DTT)。孵育2分钟,轻轻混合。如前颗粒细胞(见步骤1.2)。
  3. 重悬粒料在1ml ZK缓冲器。添加酶解酶100T的新鲜制备的溶液已被充分混合5微升。孵育20-30分钟,在30℃以除去细胞壁和产生原生质球。
  4. 测定在显微镜载玻片上的细胞悬浮液的10微升液滴,以确定是否原生质球是完整。细胞解剖显微镜下观察无盖玻片。细胞应该会出现浮肿和圆形而非略呈长方形,应该裂解以下加入20微升的水。如果细胞不能裂解,返回样品至30℃,并重新测定每10分钟,直到水诱导裂解容易观察到。如前颗粒细胞(见步骤1.2)。
  5. 轻轻悬浮和洗涤细胞沉淀我ñ2.5毫升冷MES /山梨糖醇缓冲。如前颗粒细胞(见步骤1.2)。轻轻悬浮细胞沉淀在300-400微升冷MES /山梨糖醇缓冲。细胞可以保持在冰上,在此阶段进行数小时。

2.染色体传播

注:玻璃表面在其染色体将被传播,无论是幻灯片或盖玻片,应提前准备时间。每张幻灯片或盖玻片应浸入水中,然后乙醇,然后干燥,抛光用镜头纸。如果染色体将被摊在盖玻片,盖玻片应贴有一个透明胶带或橡皮泥滑。除非另有说明,否则该协议的其余部分将介绍在任幻灯片或传播盖玻片

  1. 使用P20移液管,移液管20微升细胞悬浮液到一个干净的载玻片的表面上。
  2. 3%PFA /蔗糖溶液中使用的是P200的移液器,加入40微升,轻轻混合搜索解决方案N以“纷飞”用手滑动,直到纹影线消失。将滑动显微镜下,确认细胞是关注的焦点。煤灰溶液应该是新制备在使用的当天通风柜。
    注意:如果目的蛋白质尚未审查的方法以前,最好是准备使用包含2和4%PFA解决方案,以确定是否保持该蛋白质是固定条件敏感附加幻灯片。 4%PFA /蔗糖溶液中使用的情况下,期望的可视化有关的微管蛋白的微管。较高固定液浓度的缺点是,染色体将是“underspread,”2%PFA中也往往产生“underspread”染色体。
  3. 采用P200的移液器,加80微升1%LIPSOL的,如前漩涡混合解决方案,尽可能完整地,启动一个定时器。如果LIPSOL不可用,80微升1%NP40或80微升的dh 2 O可能取代(见代表结果,图2)。
  4. 观看细胞仔细,轻轻地旋转幻灯片每15秒。当细胞大约80%的裂解(消失)停止计时,立即从显微镜取出载玻片上,加80微升的PFA /蔗糖溶液和漩涡混合。裂解应启动定时器之后发生从30至90秒。
    注意:如果若干幻灯片显示裂解在大约相同的时间,可以最终省略微观监测用于幻灯片的其余部分,简单地仔细计时加成LIPSOL和另外的固定剂的最终等分试样之间的时期。然而,从同一样品准备多张幻灯片时,这个捷径是唯一可靠的。最好是监视各样品的裂解显微镜时不同载玻片从在不同时间采集的样品或来自不同文化的制备。
  5. 放置幻灯片上清洁的平面上并扩散,液体在整个无结霜面传热e。使用保持低于“水坑”的弯月面,但在滑动本身, 表面上方的清洁,一次性牧场吸管的侧滑动的。不“耙”与吸管滑动的表面上。不要重复使用吸管在不同的幻灯片,以避免样品的污染。
  6. 离开幻灯片在通风柜干燥过夜。不溶性的核部件将落户到滑动面和绑定到它。对于大型实验,规划利用空间的干燥步骤是重要的。
  7. 一旦干燥,最佳结果是通过发展到免疫染色阶段在同一天获得。然而,干燥的蔗糖溶液中嵌入扩频染色体在一个“蜂蜜”,允许样品的冷冻:幻灯片可以被转移到一个塑料载玻片盒,并存储在-20℃多年。

3.免疫染色

  1. 浸载玻片在0.2%光弗洛30秒。除去蜂蜜。精益幻灯片上的边缘,以在纸巾边缘休息,以去除残留的光弗洛。
  2. 浸载玻片在1×TBS中5分钟以洗涤。通过在边缘滑靠在去除多余的液体,但不要让他们干出来的。
  3. 铺设幻灯片磨砂朝上,吸管300微升TBS / BSA上横跨滑板的无结霜部滑动。
  4. 孵育在潮湿室中在室温持续15分钟。 (下穿孔金属板或塑料滑梯盒内衬水的纸巾用饱和纸巾大型塑料容器)。
  5. 由搁在纸巾上滑动的一个短边和靠在一个适当的支持所述滑动件(如一个试管架)漏的幻灯片。不要让表面干燥。
  6. 立即应用80微升含有适当稀释的第一抗体的TBS / BSA缓冲液。如果抗体限制,使用40微升和22×22毫米盖玻片。对于粗兔血清,这是一个典型的1/50和1/500稀释之间。
    注意:执行滴定新抗体制剂。最稀制剂能够产生高信号上述背景选择。为了控制的背景染色的水平,核应从适当缺失突变株和/或重复的载玻片制备应与预免疫血清被染色。
  7. 将在幻灯片上避免气泡抛光22×50毫米盖玻片。握住拇指和食指沿长边之间的盖玻片在靠近一短边缘位置做到这一点。保持盖玻片,在30°角相对于滑动,从手指的短边最远被降低,直到其位于所述滑动只是“水坑”最接近载片的磨砂区域的边缘内侧。然后慢慢放下盖玻片,在平滑的运动,直到拿着幻灯片触摸板凳手指,然后松开。不要试图一次它的土地调整盖玻片的位置。
    注:如果利差染色体上制备贴盖玻片(而不是直接在载玻片的表面上),该样品盖玻片将保持固定到整个染色和洗涤步骤的幻灯片。染色和随后丢弃期间额外盖玻片将被放置在样品上盖玻片均匀分布抗体溶液的顶部。
  8. 在一个密封的腔潮湿的地方幻灯片和孵化一夜之间在4℃。
  9. 保持磨砂边缘转移的幻灯片到载玻片染色齿条和淹没在含有TBS一个染色缸。
  10. 轻轻蘸上下滑动,除去盖玻片。尽量不要用力过猛做到这一点。通过浸没在TB​​S洗载玻片2×10分钟。从机架上卸下幻灯片和通过触摸边纸巾排出多余液体。不要让表面干燥。
  11. 在柔和的灯光工作,立即加入含1/1000倍稀释荧光标记的二次抗体(或40微升用22×22毫米盖玻片)的80微升TBS / BSA。广告ð盖玻片作为前孵育在4℃下2小时,在湿室中在黑暗中。
  12. 除去盖玻片和以前一样,漏的幻灯片,并允许表面风干1至2小时在黑暗中。如前纸巾精益幻灯片。
    注:如果在安装盖玻片进行传播,干燥分离前从幻灯片盖玻片。如在先前步骤中描述的幻灯片盖玻片,然后干燥。
  13. 在柔光的工作,加入约30微升含安装DAPI(3个10微升滴)中,然后小心地放下盖玻片。如果利差盖玻片上,将安装介质的液滴在干净的玻片,降低盖玻片,染色体端下来,到幻灯片。
  14. 仍在柔和的光,等待2分钟的盖玻片定居和密封盖玻片用透明指甲油的边缘。将幻灯片平坦滑动箱。
    注:对于STED显微镜,用安装延长黄金。使用30微升延长黄金的没有DAPI并允许治愈过夜。用指甲油密封是不必要的。
  15. 查看幻灯片由宽视场荧光显微镜用40或100X目的使用适当的设置进行DAPI集中的过滤器。可选择存放在4℃的幻灯片在黑暗中了好几个星期。不要冷冻。

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Representative Results

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传播核的外观需要依靠染色体固定和脱压实之间的平衡。即使当试剂被适当平衡,变异在染色体脱压实度可发生在相同的幻灯片之间和/或不同的幻灯片的不同区域。因此,图像被解释之前以幻灯片的给定区域差的质量进行评估。

可使用抗减数分裂重组蛋白来说明的“笼压”和“underspreading”的影响。在图1中 ,减数分裂细胞核双重免疫染色两种真核生物链交换的蛋白质的Rad51和DMC1和计数器染色的DNA用DAPI。的最佳传播核的两个例子示于图1A。图1B示出了underspread核和两个9:19细胞核图1C的例子的一个例子。注意这Rad51蛋白和DMC1较少灶在两个及以上核underspread相比正常传播核观察。在underspread核的情况下,一些灶失焦,因为样品是不足够平坦。此外,表位可访问可能向不能检测所有病灶。此外,较小直径的传播可以排除紧密间隔的结构的分辨率。在9:19核的情况下,蛋白质可以因为固定不足和/或过度的洗涤剂处理的丢失。

标准方法的变化,可避免使用LIPSOL的。最初的版本由Loidl等人描述的扩展方法的。利用LIPSOL,一个礼实验室玻璃器皿清洗剂1。虽然这种洗涤剂目前用于许多实验室染色体扩展,则原制剂是不再市售和正在该名称销售的产品已被重新配制。 Furthermore,是LIPSOL原配方也不可用(弗朗茨·克莱恩,个人通信)。在努力克服这个问题,我们进行了在其中可商购和化学上确定的洗涤剂NP40代替LIPSOL用于实验;标准协议的这样修正,发现,得到令人满意的结果,其中传播减数分裂细胞核进行染色的Rad51和ZIP1,联会复合( 图2A)的中央区域的组分的实验。有趣的是,取代具有卫生署2 0的相同体积的LIPSOL溶液也取得了令人满意的结果( 图2B)。尽管这些研究结果表明,上述的扩展方法也可以成功地使用,而不LIPSOL,它是可能的一些先前所述结果取决于用途LIPSOL的并且将不会被再现的,如果NP40或H 2 O中使用它的位置。个人学习的传播方法英里GHT合理选择首先在地方LIPSOL使用NP40和/或H 2 O。在该方面遇到困难的情况下,研究者可以请求LIPSOL的等分试样从所获得的试剂的储存它被中断之前一个实验室; LIPSOL是便宜的,一个可能命令的最小量为足以产生数以百万计的幻灯片。

扩展方法是适合于与超分辨率光学显微镜方法中。该联会复合体由每个组织一对姐妹染色单体为一组循环阵列,绑定到一个元素每次循环的基础两个线性轴向/横向的元素。粗线期染色体已经synapsed对在100纳米的距离由形成联会复合的中心区域的蛋白在保持平行的横向元件。这些成对的横向元件无法通过常规的宽视场荧光显微镜来解决,但可以通过超解像度来解决化的方法。在图3中 ,粗线核示出被染色的相同抗体ZIP1蛋白,用于实验2所示。将样品也染色RED1蛋白,轴向/侧向元件的组件。结果表明,ZIP1抗体识别ZIP1的横向元件结合区,而不是细长的α-螺旋卷曲螺旋结构域的横向元件结合区之间。因此,与此ZIP1抗体中观察到的染色模式揭示成对横向元件的并行路径。相比于ZIP1灶灶RED1沿横向元素分布相对稀疏,但双染法显示,RED1灶一般躺在附近ZIP1灶定义的线性路径。这些发现与在相同的扩展方法来制备样品用于通过电子显微镜分析以前的工作相一致;该联会补偿的三方结构在传播过程中的lex被保留。在图3中所示的图像是由STED显微镜9产生。

图1
图1:传播核的实例染色DMC1(绿色),的Rad51(红色),以及DNA减数分裂细胞核(DAPI,蓝色)。棒= 1微米。 (A)的最佳扩散核2例。 (B)一种underspread核的一个例子。 (℃)9:19细胞核的两个例子。在左边的例子是在其中仅上部罩上一个核。

图2
图2:在不使用LIPSOL的制备减数分裂核传播从阶段减数分裂细胞核标明染色的Rad51(红),。ZIP1(绿),和DNA(DAPI,蓝色)。需要注意的是由于发生从细胞到leptonema过渡粗线期染色体压实很大程度上保留。

图3
图3:通过STED显微镜联会复合体的可视化粗线细胞核染色ZIP1(绿色)和RED1(红色)。该数据用的DeconvolutionLab ImageJ的插件10来运行100次迭代使用理查森-露模型与测量STED PSF处理。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zymolyase US Biological  Z1004 Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol  L.I.P. Ltd  no longer commercially available Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40 USB 19628 Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20 Sigma P2287
Slides Corning 2948-75x25
Standard coverslip Fisher 12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips Fisher 12-542-B
Photo-Flo 200 solution Kodak P-7417 Prepare 0.2% (v/v) solution in water. 
TBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA Sigma A2153 Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit Invitrogen A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI Vector
Laboratories
H-1200
ProLong Gold Invitrogen P36930
Plastic slide box Fisher 03-448-1 Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box Fisher 12-587-10 Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar Fisher 08-816 Use as a wash basin for slides. 

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References

  1. Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100, (4), 221-228 (1991).
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Grubb, J., Brown, M. S., Bishop, D. K. Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes. J. Vis. Exp. (102), e53081, doi:10.3791/53081 (2015).More

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