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Medicine

Motore e ippocampale Dependent apprendimento spaziale e valutazione della memoria di riferimento in un transgenici ratto modello di malattia di Alzheimer con ictus

doi: 10.3791/53089 Published: March 22, 2016

Summary

Per studiare la malattia di co-morbidità di Alzheimer (AD) e la condizione ictus in un nuovo modello, tre compiti di comportamento sono descritte che valutare sia il controllo del motore e comportamenti cognitivi. Queste attività includono il compito fascio-passeggiata, compito cilindro e labirinto d'acqua di Morris.

Abstract

La malattia di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa invalidante che si traduce in perdita di neurodegenerazione e la memoria. Mentre l'età è un importante fattore di rischio per l'AD, il colpo è stato anche implicato come fattore di rischio e un fattore esacerbando. Il co-morbidità dei risultati ictus e AD in peggioramento di controllo del motore ictus-correlata e deficit cognitivi legati AD se confrontato con ogni condizione da solo. Per modellare la condizione combinato di ictus e AD, un romanzo transgenico modello di ratto di AD, con una forma mutata della proteina precursore dell'amiloide (una proteina chiave coinvolti nello sviluppo di AD) incorporato nel suo DNA, viene dato un piccolo ictus striato unilaterale.

Per un modello con la combinazione di entrambi ictus e AD, test comportamentali che valutano il controllo motore ictus-correlata, locomozione e la funzione cognitiva AD-correlati devono essere attuate. Il compito del cilindro coinvolge un apparato multifunzione conveniente che valuta l'uso del motore zampa anteriore spontanea. In questo compito, un ratto viene posto in un apparecchio cilindrica, dove il ratto spontaneamente posteriore e contattare la parete del cilindro con le sue zampe anteriori. Questi contatti sono considerati uso del motore degli arti anteriori e quantificati in sede di analisi video dopo il test. Un altro compito motorio economicamente efficiente implementato è il compito fascio-passeggiata, che valuta il controllo degli arti anteriori, il controllo degli arti posteriori e locomozione. Questo compito implica un topo a piedi attraverso una trave di legno che consenta la valutazione del controllo motorio degli arti attraverso l'analisi delle scivola zampa anteriore, scivola e cade arti posteriori. La valutazione dell'apprendimento e della memoria si completa con Morris water maze per questo paradigma comportamentale. Il protocollo inizia con l'apprendimento spaziale, per cui il ratto individua una piattaforma nascosta stazionaria. Dopo l'apprendimento spaziale, la piattaforma viene rimosso e sia a breve termine e la memoria di riferimento spaziale a lungo termine è valutata. Tutti e tre questi compiti sono sensibili alle differenze comportamentali e completato entro 28 giorni per questo modello, rendendo questo paratempo-efficiente paradigma ed economicamente efficiente.

Introduction

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La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più diffusa di demenza nella popolazione anziana e una malattia neurodegenerativa debilitante. Istopatologico, AD si presenta come placche amiloidi, grovigli neurofibrillari e la perdita neuronale. Placche amiloidi sono costituiti principalmente da peptide beta-amiloide (Ap) che è stato prodotto mediante un clivaggio proteolitico alterata della proteina precursore dell'amiloide (APP) di β-secretasi e enzimi gamma-secretasi 1,2,3. Il prodotto di scissione, Ap, i depositi nel cervello creando placche amiloidi patologiche ed ha effetti tossici sul cervello che può portare a dei disturbi di apprendimento caratteristici e perdita di memoria. Tutti questi passaggi insieme sono indicati come la "cascata amiloide ipotesi" 3,4. Anche se questa ipotesi è importante nell'ambito delle indagini dC, altri cambiamenti cellulari sono stati trovati a precedere queste formazioni placca che si allontana dal sentiero cascata amiloide originale. questi altricambiamenti cellulari sono pensati per contribuire alla perdita di memoria all'inizio, menomazioni e altre disfunzioni cognitive coinvolte nella DC prima di formazione della placca 3,5,6 apprendimento.

Con dC diventando sempre più diffuso, i fattori di rischio per lo sviluppo di AD stanno diventando una messa a fuoco estremamente importante della ricerca. Anche se l'età è il principale fattore di rischio per le forme sporadiche di AD, sono stati identificati altri fattori di rischio, tra cui ictus 7,8. Ictus non è solo un fattore di rischio, ma può anche esacerbare demenze già presenti. Ad esempio, clinicamente, la progressione della AD ha dimostrato di essere peggiore in pazienti che avevano precedentemente sperimentato ictus 9. Inoltre, un aumento dell'espressione di APP e l'accumulo di A? È stato trovato in modelli animali sperimentali di tossicità Ap combinato con ictus indotto 10,11. Poiché non vi è questo importante interazione tra ictus e AD, è essenziale che questi due patologie essere ulteriormente studiateinsieme a modelli di co-morbidità per capire meglio fisiopatologia e comportamenti implicati in entrambe le condizioni.

Per indagare le condizioni di co-morbidità, un modello adeguato doveva essere sviluppato in cui un ictus potrebbe interagire con Ap per la produzione di patologia AD-like. Per la prima volta, un topo transgenico APP21 che ha un gene umano APP mutato incorporato nel suo DNA è stato usato per realizzare un modello appropriato di AD. Le mutazioni sono il doppio missense svedese e Indiana mutazioni missense singolo, che sono stati entrambi implicati in forme familiari di AD 4,8,12. In assenza di un insulto in più, questo modello di ratto età senza sviluppare le caratteristiche placche Ap o neurofibrillari grovigli 12. Pertanto, nel tentativo di indurre patologia del comportamento AD-like, un piccolo tratto viene introdotto nello striato diritto di imitare i piccoli colpi sottocorticali spesso presenti in pazienti affetti da demenza 9. La corsa del ra transgenici APP21t incarna la condizione di co-morbidità e permette di indagine dei vari tipi di cambiamenti comportamentali coinvolti in entrambe le condizioni di malattia. In particolare, questo induzione di deficit AD-come patologia e cognitivi nel ratto adulto ci permette di indagare i primi cambiamenti molecolari e cognitivi precedenti dC.

Dal momento che l'obiettivo è quello di determinare i primi segni di cambiamenti comportamentali e poiché sia ​​ictus e AD hanno patologie comportamentali molto diverse, quando si studia il modello di co-morbidità, i compiti di comportamento devono valutare una varietà di fenotipi comportamentali. Ci sono una serie di test relativamente sensibili che possono essere fatte per analizzare il motore e il comportamento cognitivo in modelli di roditori che implicano una serie di paradigmi e delle attrezzature. Per analizzare specificatamente la funzione zampa anteriore e motore degli arti posteriori, il compito compito cilindro e fascio-passeggiata sono state realizzate per individuare deficit motori e monitorare locomozione in questo modello. Altri compiti sensibili a valutare specificamente bene FOabilità relimb motore (cioè il compito scalinata e unico pellet compito di raggiungere) richiedono privazione di cibo 11,13,14. Al fine di evitare qualsiasi degli effetti noti di privazione di cibo sulle patologie malattia 15,16,17, questi test sono stati ritenuti non idonei per questo studio. Il compito del cilindro valuta l'uso spontaneo di arti anteriori del ratto durante l'allevamento in un ambiente nuovo e in grado di rilevare asimmetria tra arti anteriori nei ratti con ictus unilaterale 10,18. Un importante vantaggio di questo compito è che l'apparecchiatura può essere utilizzata per altre attività comportamentali, come la Porsolt forzata compito swim 19. Contrariamente al compito cilindro, il compito fascio piedi permette anche l'analisi di hindlimb e controllo motorio degli arti anteriori, oltre a locmotion 10,14. Bilanciere include un componente locomotore, un componente di equilibrio e il posizionamento del piede qualificato. Entrambi questi test sono economicamente efficiente, semplice, e in tempi rapidi e chiarire gli effetti di ictus e AD su d ifferences in arto funzionamento.

Oltre a cambiamenti nella funzione motoria, AD comporta deficit di memoria che possono presentare nelle prime fasi della progressione della malattia. Al momento di affrontare patologie AD-come in un modello di roditore, è fondamentale che l'apprendimento ippocampo dipendenti e la memoria è determinati, in quanto l'ippocampo è una importante struttura del cervello in gran parte influenzato in AD 2. L'ippocampo è una regione del cervello essenziale per l'apprendimento spaziale e la memoria e la sua funzione può essere testato con vari paradigmi labirinto nei roditori. Uno dei compiti labirinto per lo più ampiamente utilizzati per i modelli di roditori di diverse malattie è il labirinto d'acqua di Morris 20. La Morris water maze utilizza indizi spaziali per aiutare il topo nel localizzare una piattaforma nascosta fermo e test di memoria di riferimento spaziale quando la piattaforma viene rimosso. Un notevole vantaggio della configurazione water maze è che è altamente adattabile a seconda del proposto domanda di ricerca 20.

tenda "> Per la prima volta, le tecniche descritte sono stati utilizzati per valutare il motore e la funzione cognitiva in un modello di ratto di co-morbidità romanzo di ictus e AD. coinvolgendo piccoli colpi in un modello di topo transgenico APP21. Co-morbidità è stato raggiunto da indurre vasocostrizione dei vasi sanguigni nel corpo striato di produrre un piccolo ictus in APP21 topi transgenici. questo modello colpo è stato ben definito come una condizione di co-morbidità in un modello di ratto alternativo di aD 11. avanzamento in questo romanzo APP21 modello di ratto transgenico è stato destinato per la produzione di un modello più translationally prezioso. Mentre i compiti comportamentali sono descritti utilizzando un modello di ictus e aD rat co-morbidità, queste attività possono essere ulteriormente applicate ad altri modelli di ictus o modelli di altre malattie neurologiche (per esempio il morbo di Parkinson). Il generale metodologia descritta sarà ampiamente applicabile a questi altri stati di malattia, ma le scadenze di comportamento e paradigmi può richiedere modifiche in base alle proposte resdomanda earch e modello. Oltre ad essere adattabile, i compiti sono efficaci nel dimostrare deficit minori, pur essendo di costo e in tempi rapidi.

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Protocol

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Il comitato istituzionale adeguato etica animale dovrebbe approvare tutte le procedure comportamentali prima di iniziare la sperimentazione. Tutti i lavori animale qui descritto è stato approvato dal Western University Animal Usa sottocommissione e segue il Consiglio canadese sulle linee guida per la cura degli animali. Questi esperimenti sugli animali sono stati eseguiti durante la fase leggera.

1. Cilindro Task per la valutazione degli arti anteriori del motore lordo

  1. Impostazione attrezzature
    1. Acquisire un cilindro di plexiglas con un coperchio perforato che ospiterà la dimensione del ratto utilizzata per l'esperimento. La dimensione del cilindro non deve permettere il ratto per raggiungere la cima quando allevamento e dovrebbe consentire per 2 cm tra la parete e il naso del ratto e la base della coda del topo. La dimensione standard di un cilindro è di 23 cm di diametro e 40 cm di altezza per un 6 mesi (400-600 g) di ratto.
    2. Collocare uno specchio con un angolo di 45 ° sotto dell'apparato cilindro con il cilindro seduto su un Plexiglas basamento o qualche altra forma di supporto di circa 30 cm sopra tavolo.
    3. Impostare una videocamera su un treppiede ad una distanza appropriata di visualizzare l'intero diametro del cilindro nello specchio della videocamera.
    4. Girare l'illuminazione di un ambiente dimmer e giocare rumore bianco nella stanza (cioè basso volume, la musica sottili) per ridurre l'effetto di improvvisi rumori forti. Ciò dovrebbe contribuire ad incoraggiare il movimento e prevenire il congelamento a causa di rumori forti.
  2. Procedura sperimentale
    1. Spostare i topi nella stanza sperimentale 30 minuti prima dell'inizio della prima prova per acclimatarsi ratti alla stanza con la riproduzione di musica e luci dimmer.
    2. Scrivere le corrispondenti informazioni animale e di prova (cioè il numero degli animali, il giorno in timeline e il numero di prova) su un piccolo bordo bianco. Inserire questa scheda di fronte allo specchio.
    3. Premere RECORD sulla videocamera con la scheda bianca di fronte allo specchio, prendere il topo nei pressi della base of la coda, posizionare il topo nel cilindro e fissare il coperchio. Basamento a lato del cilindro per evitare interferenze con registrazione video.
    4. Rimuovere la scheda bianca da davanti allo specchio e lasciare che il record videocamera il topo nel cilindro per 5 minuti (utilizzare un timer per registrare 5 minuti da quando la scheda bianca è stato rimosso). Questa è una prova.
    5. Pulire il cilindro con tovagliolo di carta e acqua dopo un processo.
    6. Ripetere i punti 1.2.2-1.2.5 altre due volte a raggiungere un totale di tre prove. Ci dovrebbe essere un 20-30 min Tempo di inter-trial per diminuire il rischio di assuefazione al cilindro. Durante questo tempo, eseguire prove cilindri per gli altri ratti.
  3. Analisi Video
    1. Importare file video camera in programma di montaggio video (ad esempio iMovie)
    2. Compilare i video in clip per ogni prova. Disattivare il volume del video e diminuire la velocità del video al 25% dell'originale.
    3. Contare il numero di contatti forelimbcon la parete del cilindro per la zampa anteriore sinistra e destra. Per contatti simultanei a sinistra ea destra, contare questi contatti arti anteriori come "entrambi". Tenere presente che il video viene registrato attraverso uno specchio, quello che sembra essere dell'arto anteriore sinistro nel video corrisponde alla zampa anteriore destra dell'animale nella realtà.
    4. Calcolare l'uso per cento dell'arto anteriore interessata (controlaterale alla corsa) con la seguente equazione: [{/ totale contatti numero (contatti + ½ contatti bilaterali influenzato)} x 100]. Le prestazioni di entrambi i gruppi wild type e il gruppo transgenico senza corsa sono considerati gruppi di confronto per valutare la presentazione di problemi di malattia indotta.

2. Fascio-passeggiata Task per la valutazione Gross Motor

  1. Impostazione attrezzature
    1. Acquisire una trave di legno liscio sigillati che si trova a 2 cm di larghezza e lunga circa 120 cm (larghezza ottimale per un 200-600 g ratto).
    2. Inserire due tabelle o scaffalature uni suoi 100 cm. Le superfici di ogni unità dovrebbe essere di circa 40 cm da terra.
    3. Fissare entrambe le estremità del fascio al tavolo o superficie di scaffalatura con nastro. Circa 1 m di lunghezza della trave non supportata dovrebbero ora essere elevati a 40 cm da terra.
    4. Impostare una videocamera su un supporto, catturando l'intera lunghezza della trave. Per aumentare il contrasto del video, prendere in considerazione l'introduzione di un fondo nero dietro il fascio quando si utilizzano topi bianchi.
  2. Procedura sperimentale
    1. Spostare i topi nella stanza sperimentale 30 minuti prima dell'inizio della prima prova per acclimatarsi ratti alla stanza con la riproduzione di musica e luci dimmer.
    2. Posizionare tubi gabbia casa o arricchimento ambientale del ratto ad una estremità della trave e posizionare il ratto all'altra estremità della trave.
    3. Condurre un paio di basi non-registrato due giorni prima di prove sperimentali. Sia il ratto esplorare la zona e guida il topo verso la trave tenendo la base del ratto'S coda.
    4. Una volta che il ratto ha attraversato il fascio, spostare la gabbia o tubo per l'altra estremità della trave e ripetere. Quando il ratto attraversa il fascio liberamente in entrambe le direzioni, l'allenamento è finita. Mantenere il numero di formazione corre coerente tra tutti gli animali.
    5. Scrivere le corrispondenti informazioni animale e di prova (cioè il numero degli animali, il giorno in timeline e il numero di prova) su un piccolo bordo bianco. Nastro questo bordo bianco per il muro dietro la trave.
    6. Posizionare gabbia ambiente domestico o tubi arricchimento del ratto ad una estremità della trave.
    7. Premere registrare la videocamera e raccogliere il ratto dalla base della coda e posto alla fine della trave opposta alla gabbia casa o tubazione.
    8. Registrare la totalità del processo, che termina quando il ratto è completato correttamente attraversa l'intera lunghezza della trave elevata. Se le pause ratto midway attraverso il fascio, delicatamente scruff ratto dalla base della coda o toccare la coda del topo delicatamenteper promuovere il movimento attraverso il fascio. Non spingere il ratto in avanti in qualsiasi modo.
    9. Re-do processi in cui il topo gira di lato, mentre sulla trave, più volte si ferma a piedi o passeggiate in modo incoerente. Se un ratto cade e continua ad aggrapparsi alla trave, delicatamente raccogliere ratto e rimetterlo sulla trave nella posizione della caduta e continuare il processo.
    10. Spostare la gabbia casa o tubi per l'altra estremità della trave, modificare il processo # sul bordo bianco e registrare il successivo processo.
    11. Ripetere questa procedura fino a un totale di 6 prove sono state completate, con 3 prove in fase di registrazione per ogni direzione. Tutte le 6 prove per un topo possono essere registrate prima di iniziare le prove per la prossima topo.
  3. Analisi Video
    1. Importare i file video della telecamera nel programma di montaggio video (ad esempio iMovie).
    2. Compilare i video in clip per ogni prova e disattivare il volume del video. Analizzare ogni fotogramma video clip per fotogramma.
    3. Contare il numerodi passi totale ratto prende a camminare per tutta la lunghezza della trave e il numero totale di arti posteriori sinistra e destra e scivola arti anteriori e il numero totale di cadute. Le prestazioni di entrambi i gruppi di tipo selvatico e il gruppo transgenici senza corsa sono considerati in confronto al gruppo di co-morbidità per valutare comparsa di deficit unici per la condizione di co-morbidità.

3. Morris water maze per ippocampo-dipendente spaziale di apprendimento e di memoria di riferimento

  1. Impostazione attrezzature
    1. Fissare una videocamera posizionata sopra il centro di una vasca circolare (148 cm di diametro e 58 cm di profondità). Allineare i quattro quadranti designati correttamente con il contorno della piscina nel programma software di monitoraggio.
    2. Riempire la piscina circolare con acqua di circa 36 cm di profondità. L'acqua deve essere portata a temperatura ambiente per riempire la piscina alcuni giorni prima di iniziare il protocollo sperimentale.
    3. Aggiungere nero vernice acrilica un non tossicotil l'acqua è opaca quando si utilizzano topi bianchi. Utilizzare un colore chiaro, come il bianco, per i ratti di colore più scuro.
    4. Circondano la piscina con le superfici muro bianco, tra cui divisori, se necessario. Quando in piscina, il ratto non dovrebbe essere in grado di vedere gli sperimentatori.
    5. Tagliare 4 grandi spunti spaziali di forma diversa da diversi colori di cartoncino e allegare una forma sulla parete nord per designata, est, sud-est e sud-ovest posizioni piscina. Questi segnali devono essere leggermente superiore al bordo della piscina.
    6. Accendere una radio a basso volume nel quadrante nord-ovest per evitare che il ratto da essere distratti da forti rumori inaspettati durante il test.
    7. Posizionare una piattaforma circolare (diametro 11,5 centimetri, superficiale 2-3 cm sotto il livello dell'acqua) al centro del quadrante di destinazione.
    8. Spegnere principali luci della stanza e accendere una lampada da pavimento sul lato opposto del divisorio alla piscina per illuminare la zona.
  2. Configurazione computer Utilizzare un programma di monitoraggio che è stato progettato per compiti di comportamento Morris water maze e impostare il protocollo prima di iniziare gli esperimenti. Un esempio di un possibile programma è fornito in Figura 4.
  3. Set 4 giorni consecutivi con 4 prove di 90 secondi ciascuna per l'esperimento di apprendimento spaziale.
  4. Set 2 esperimenti sonda separata di 30 secondi ciascuno a 24 ore dopo l'ultima prova di apprendimento spaziale e 1 settimana dopo il primo esperimento della sonda.
  5. Set cued prove di apprendimento a 4 prove al giorno per 2 giorni consecutivi a partire 24 ore dopo il secondo esperimento sonda. Ogni prova deve essere totale 60 sec.
  6. Per ogni fase, impostare l'ordine di test in modo che vi sia un 20 min inter-trial intervallo tra ciascuna prova per ogni animale. Altri animali possono essere eseguiti durante questo intervallo inter-trial, finché ogni animale mantiene a 20 min inter-trial.
  7. Assicurarsi che la posizione della piattaforma deve essere definita dallo sperimentatore e che tutte le altre zone sono demultato dalla posizione della piattaforma designata.
  8. Impostare il programma per iniziare e terminare ogni prova manualmente.
  • Spatial Esperimento Learning
    1. Posizionare la piattaforma circolare nel quadrante sud-ovest. Dovrebbe essere allineato con la circolare zona designata "piattaforma" nel quadrante sul programma per computer.
    2. Inizia posizioni intorno alla piscina devono essere assegnati in modo casuale per ogni ratto. Rappresentano tutte le posizioni di partenza in ciascun gruppo di trattamento. N ratto inizia dalla posizione est per le prove di apprendimento spaziale nel paradigma presentati per consentire una posizione di partenza romanzo durante il test sonda.
    3. Tenere il ratto alla base della coda e delicatamente metterlo nell'acqua lungo la parete della piscina in posizione di partenza designato, e muoversi rapidamente fuori dalla vista del ratto.
    4. Avere l'altro sperimentatore avviare il software di monitoraggio non appena il ratto è in acqua. Un timer dovrebbe iniziare il conteggio da 0 sul programma di monitoraggio. Se il ratto individua la piattaforma, avere l'altro sperimentatore arrestare il processo nel computer e lasciare il ratto sulla piattaforma per almeno 30 secondi prima di recuperare esso. Se il ratto salta dalla piattaforma prima del processo si arresta sul computer, il processo continua.
    5. Se il ratto non trova la piattaforma nel tempo di prova assegnato, guida il topo alla piattaforma con la mano (o fare il topo seguire la mano o guidare il ratto dalla base della coda). Tenere il ratto sulla piattaforma per 30 sec.
    6. Rimuovere il ratto dalla piscina dalla base della coda al braccio dello sperimentatore che è coperto con un asciugamano o lasciare il ratto salire su una superficie portatile.
    7. Ripetere i passaggi 3.3.3-3.3.7 per un totale di 4 prove per Rat. Ci dovrebbe essere un intervallo inter-trial di 20 minuti per ogni ratto.
    8. Restituire i ratti a loro gabbia casa sotto una lampada di calore per almeno 10 minuti dopo prova apprendimento spaziale finale del ratto.
    9. Continuare la exact stesso protocollo di apprendimento spaziale per giorno da 2 a 4 giorni di apprendimento spaziale.
    10. Il giorno 2-4, non tenere il topo sulla piattaforma più a lungo. Lasciare che il topo di sedersi sulla piattaforma senza assistenza per 30 sec con gli sperimentatori fuori dalla vista. Questo può essere fatto durante le prove successive il giorno 1 in occasione.
  • Probe Experiment
    1. Rimuovere la piattaforma dalla piscina. Assicurarsi che la posizione della piattaforma precedente rimane definito sul computer (cerchio nel quadrante sud-ovest).
    2. Posizionare il ratto nell'acqua lungo la parete della piscina in posizione nord-est e muoversi rapidamente fuori dalla vista del ratto. L'uso del romanzo est posizione di partenza assicura che il topo ricorda la posizione della piattaforma indipendente dalla posizione iniziale precedentemente formati.
    3. Avere l'altro sperimentatore avviare il software di monitoraggio non appena il ratto è in acqua. Un timer dovrebbe iniziare il conteggio da 0 sul software di monitoraggio.
    4. Recuperare il ratto dalsud-ovest quadrante della piscina dalla base della coda e tenere su un braccio telo coperto o lasciare che il ratto salire su una superficie portatile.
    5. Restituire i ratti a loro gabbia casa sotto una lampada di calore per almeno 10 minuti dopo prova sonda di ogni ratto.
    6. Ripetere questo esperimento (gradini 3.4.1-3.4.5) dopo 1 settimana.
  • Cued Esperimento Learning
    1. Utilizzare nastro adesivo per fissare a 4 cm di diametro spunto sferica bianca su un supporto che è alto 8,5 cm sulla piattaforma (altezza totale di spunto è di 12,5 cm). La parte superiore della stecca sferica sarà di almeno 8,5 cm sopra il livello dell'acqua.
    2. Rimuovere le indicazioni spaziali dalle pareti che circondano la piscina.
    3. Randomize posizioni della piattaforma e iniziare a posizioni per ogni ratto in ciascun gruppo. Tutte le posizioni di piattaforma e di partenza devono essere rappresentati per ciascun gruppo di trattamento.
    4. Posizionare la piattaforma nella zona della piattaforma designata e definire nel software di monitoraggio.
    5. Posizionare il ratto nell'acqua lungo la parete della piscina al tha designato posizione di inizio e rapidamente spostare fuori dalla vista del ratto.
    6. Avere l'altro sperimentatore avviare il software di monitoraggio non appena il ratto è in acqua. Un timer dovrebbe iniziare il conteggio da 0 sul software di monitoraggio.
    7. Una volta che il ratto raggiunge la piattaforma, avere l'altro sperimentatore arrestare il processo nel computer. Se il ratto salta dalla piattaforma, il processo continua. Prima di recuperare il topo, il ratto permettono di sedersi sulla piattaforma per 15 sec.
    8. Recuperare il ratto dalla piscina dalla base della coda e tenere su un braccio telo coperto o lasciare che il ratto salire su una superficie portatile.
    9. Controllare la posizione della piattaforma per la prossima ratto e spostare la piattaforma in area corrispondente definita nel software di monitoraggio.
    10. Ripetere i passaggi 3.5.4-3.5.9 per i seguenti 3 prove. Ci dovrebbe essere un intervallo inter-prova di 15 min.
    11. Restituire i ratti a loro gabbia casa sotto una lampada di calore per almeno 10 minuti dopo fina di ogni rattol cued processo di apprendimento.
    12. Continuare lo stesso protocollo per il giorno 2 di apprendimento cued.
  • Analisi dei dati
    Nota: Il tempo trascorso in zone, la distanza percorsa in zone, velocità media, il numero di voci in zone e il tempo di prima dell'ingresso nella zona sono spesso utilizzati.
    1. Analizzare il tempo e la distanza per raggiungere la zona della piattaforma e la velocità media al giorno di spaziale e cued learning separatamente. Per gli esperimenti sonda, analizzare la latenza al primo ingresso nella zona target come un tempo crudo o una variazione percentuale dal sonda 1 per sondare 2.
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    Representative Results

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    I compiti comportamentali descritti sono stati usati per dimostrare gli effetti di ictus in un modello di topo transgenico APP21 della malattia di Alzheimer. La combinazione di ictus e del transgene APP21 si dovrebbe comportare una maggiore deficit motorio negli arti colpiti, così come un aumento dei deficit di memoria.

    Il compito del cilindro ha valutato la funzione motoria degli arti anteriori lordo ed è rappresentato come l'uso dell'arto anteriore interessata. Inoltre, il compito fascio-passeggiata è stato utilizzato per valutare specificamente la funzione motoria degli arti posteriori e locomozione. Dal momento che la corsa è stata indotta nello striato destra, la zampa anteriore sinistra dovrebbe mostrare un deficit motorio se presente. I dati presentati sia in Figura 2 e Figura 3a e 3b non statisticamente dimostrare che i ratti co-morbidità hanno un deficit zampa anteriore o degli arti posteriori, rispettivamente. Anche se questi animali non fanno appera di avere deficit degli arti anteriori o motorie degli arti posteriori, essi sembrano avere piccole differenze nella funzione del motore di pertinenza di locomozione. Nel compito fascio-passeggiata passi totali sono stati significativamente aumentati nei topi transgenici co-morbidità con corsa (p <0.05, figura 3c), suggerendo che il compito fascio-passeggiata è abbastanza sensibile per rilevare piccole modifiche nel portamento e locomozione. Il piccolo modello di ictus striato utilizzato produce piccoli colpi che probabilmente troppo piccoli per produrre grossi deficit motori, ma il deficit è stato dimostrato prima in altri modelli di ictus con questi due compiti 10,14. Ecco, queste attività possono semplicemente monitorare la funzione motoria e locomozione nell'ambito delle indagini i parametri presentati.

    la memoria e l'apprendimento di riferimento spaziale dipendente dell'ippocampo può essere efficacemente valutato utilizzando labirinto acquatico di Morris. Non ci sono state differenze apparenti nell'apprendimento tra i due gruppi (figura 5a >, Figura 5b), pertanto le differenze di apprendimento non possono spiegare eventuali differenze di prestazioni della memoria. APP21 topi transgenici con ictus hanno dimostrato un robusto deficit di memoria di riferimento a lungo termine rispetto ai ratti transgenici senza ratti ictus e wild type con ictus (p <0.05, Figura 5C).

    apprendimento cued è completato per garantire che i ratti hanno pari possibilità di usare indizi spaziali visivi per individuare la piattaforma nel Morris water maze. Come dimostrato nella Figura 6a e 6b Figura, non sono state osservate differenze nella latenza o il percorso di lunghezza per raggiungere la piattaforma durante l'apprendimento cued tra i gruppi. Inoltre, la velocità media di nuoto è stato coerente tra i due gruppi (Figura 6c) e dimostra che la motivazione per uscire e nuotare abilità è stato pari tra i due gruppi.

    figura 1 "src =" / files / ftp_upload / 53089 / 53089fig1.jpg "/>
    Figura 1:. Timeline per il motore e le valutazioni del comportamento cognitivo Stroke induce Day Surgery è assegnato giorno 0 e tutti i giorni di test sono in riferimento a questo giorno. (A) pre-intervento chirurgico e post-chirurgico di prova per compito cilindro (C) e il compito del fascio-passeggiata (BM). (B) Morris water maze apprendimento spaziale, il test della sonda e cued apprendimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    Figura 2:. Cilindro attività Utilizzare Percentuale di forelimb interessata è stato calcolato utilizzando l'equazione al punto 1.3.4 e standardizzato al giorno -3 valori basali. La linea tratteggiata rossa annota il valore 1.0 che rappresenta la parità di utilizzo di ogniforelimb nel compito cilindro. wild type è abbreviato come WT e transgenica è abbreviato come TG. Numeri animali sono i seguenti: WT + salina (n = 7), WT + ictus (n = 8), TG + salina (n = 8), TG + ictus (n = 6). Tutti i valori sono presentati come media ± SEM. (ANOVA a due vie, di Tukey post hoc). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3:. Compito Fascio-passeggiata La somma di tutti i scivola fatto con la (A) colpito e (B) degli arti posteriori inalterato attraverso 5 studi si presenta come un rapporto tra il numero totale di passi compiuti per attraversare il fascio. I valori sono stati standardizzati ai valori basali come segue: rapporto post-operatorio - rapporto di pre-intervento chirurgico. (C) I passaggi totali di attraversare il fascio o n giorno -7 e il giorno 21. tipo selvaggio è abbreviato come WT e transgenica è abbreviato come TG. il numero degli animali sono i seguenti: WT + soluzione fisiologica (n = 6), WT + ictus (n = 6), TG + soluzione fisiologica (n = 6), TG + ictus (n = 5). Tutti i valori sono presentati come media ± SEM e asterischi indicano significatività statistica. (One-way ANOVA, post-hoc di Tukey, p <0.05). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4: vista del programma che dimostra sezioni necessari per l'installazione e l'esecuzione di un esperimento Alcune caratteristiche del programma di monitoraggio utilizzato per Morris water maze evidenziato.. La vista apparecchiatura con il video della piscina ha caratterizzato sopra appare solo come presentato quando nella scheda Test.3089fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5: l'apprendimento spaziale e la memoria di riferimento nel Morris water maze apprendimento spaziale è stata misurata mediante (A) latenza e (B) lunghezza di percorso per raggiungere la piattaforma.. (C) di memoria di riferimento è stata misurata come variazione percentuale della latenza di primo ingresso nella zona di destinazione sul test della sonda giorno 19 rispetto al test della sonda giorno 12. wild type è abbreviato come WT e transgenica è abbreviato come TG. il numero degli animali sono i seguenti: WT + soluzione fisiologica (n = 8), WT + ictus (n = 7), TG + soluzione fisiologica (n = 7), TG + ictus (n = 8). Tutti i valori sono presentati come media ± SEM e asterischi indicano significatività statistica. (ANOVA a due vie per l'apprendimento spaziale e ANOVA per il test della sonda, di Tukey post hoc, P &# 60;. 0,05) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 6
    Figura 6:. CUED imparare a Morris water maze (A) Latenza e (B) lunghezza del percorso per raggiungere la piattaforma sono esposti come media di tutte le otto prove di apprendimento. Velocità (C) Swim si presenta come una media di tutte le otto prove di apprendimento. wild type è abbreviato come WT e transgenica è abbreviato come TG. il numero degli animali sono i seguenti: WT + soluzione fisiologica (n = 8), WT + ictus (n = 7), TG + soluzione fisiologica (n = 7), TG + ictus (n = 8). I valori sono presentati come media ± SEM. (One-way ANOVA, di Tukey post hoc). Clicca qui per vedere una versione più grande di questafigura.

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    Discussion

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    La combinazione di ictus e di malattia di Alzheimer risultati nelle patologie comportamentali ben distinte che possono influenzare sia il motore e la funzione cognitiva in base alla gravità di ogni condizione. Pertanto, è necessario fare uso di una varietà di compiti comportamentali per determinare i singoli contributi di queste condizioni, così come dare qualche informazione sugli effetti combinati e potenzialmente interattivi nella condizione co-morbidità. I dati presentati dimostrano tre economicamente efficiente, le attività di comportamento sensibili tempo efficiente e di valutare la funzione motoria e la memoria e l'apprendimento di riferimento spaziale dipendente dell'ippocampo in un APP21 co-morbidità modello di ratto transgenico romanzo con ictus. Oltre ai dati presentati, questi compiti sono stati verificati in modelli di ictus più gravi 10,14,18, nonché in modelli di AD 8,16 e dovrebbe essere ampiamente applicabile a diversi modelli di entrambe le malattie.

    Detto questo, non è un compito è senza Limitations. Per i compiti motori specificamente, alcuni guasti può essere richiesto se ratti abituandosi al cilindro e la trave. Nel compito cilindro, una motivazione può essere necessaria per assicurare il ratto raggiunge la giusta quantità di contatti zampa anteriore con la parete del cilindro. Per ottenere questo risultato, l'applicazione di un profumo atossico sul coperchio perforato o parete del cilindro può motivare il ratto posteriore e contattare la parete del cilindro con le sue zampe anteriori. Ad esempio, un po 'di burro di arachidi o vanillina può essere spalmato sulla parete interna vicino alla parte superiore del cilindro per incoraggiare ulteriormente ratti sedentari per esplorare le pareti del cilindro. Un anello di nastro colorato può essere applicato anche all'interno del ¾ cilindro dal fondo del cilindro. Un altro modo di promuovere l'allevamento comporta la rimozione di un topo sedentaria e di reintroduzione che al cilindro dopo qualche tempo è passato, che è stato realizzato con un intervallo inter-trial nel protocollo. PellicciaThermore, a seconda dell'altezza del cilindro rispetto alla lunghezza del ratto, rimuovendo il coperchio perforato metà un processo può richiedere allevamento e contatto zampa anteriore con la parete del cilindro. Questo non dovrebbe essere fatto se vi è una possibilità il ratto potrà fuoriuscire dal cilindro durante il test. Queste motivazioni possono contribuire ad aumentare il numero di parti posteriori, ma non devono influenzare l'uso delle zampe anteriori destra e sinistra durante il contatto a parete. Se c'è ancora una grande preoccupazione per un numero inadeguato di contatti arti anteriori dopo l'implementazione di questi suggerimenti, una prova può essere conclusa dopo il ratto ha fatto un totale di 10 posteriori, indipendentemente dalla lunghezza del tempo. Questo sarebbe diverso dai 5 prove minuti completato nel protocollo di cui sopra, come ogni ratto raggiungerebbe un totale di 10 retri in tempi diversi. Con un modello di ictus e AD comorbilità, è importante essere consapevoli del fatto che i cambiamenti nei livelli di prestazioni, l'ansia e l'attività cognitiva possono svilupparsi in questi ratti. Wentre tali modifiche non riguardano direttamente l'esito primario del compito cilindro (uso degli arti anteriori spontanea durante l'allevamento), la registrazione di altre osservazioni possono costituire una prova importante per i cambiamenti del comportamento non auto-correlati che si possono sviluppare. Nel compito cilindro, tali comportamenti possono potenzialmente essere osservati analizzando aumentato o diminuito l'allevamento comportamento, come l'allevamento è una forma di comportamento esplorativo motivato. Inoltre, altre misure come il tempo trascorso governare, tornitura e atterraggio in grado di fornire una visione su ansia e altri deficit fisici, rispettivamente.

    Per quanto riguarda il compito del fascio a piedi, utilizzando il tubo di arricchimento gabbia a casa di solito è una motivazione sufficiente per il ratto di attraversare la trave. Se un ratto continua a fermare a metà strada lungo la trave, un premio fragrante o trattare, come il burro di arachidi o zucchero precisione pellets, potrebbe essere introdotto in aggiunta ai tubi di arricchimento all'estremità opposta. Se ossequi sono dati, in modo che tutti i ratti ricevono abla stessa quantità di tratta sul giornata di test, indipendentemente dal loro prestazioni. Inoltre, piuttosto che correre tutte e sei le prove per un topo prima di passare al successivo ratto, le prove potrebbero essere sfalsati. Ad esempio, i primi due prove potrebbero essere compilate per tutti i ratti prima di iniziare la successiva due. Questo potrebbe impedire l'aumento del numero di fermate a metà strada attraverso la trave che può verificarsi sulle sperimentazioni più tardi, quando alcuni ratti diventano troppo comodo con l'ambiente fascio. Un'altra possibile soluzione in caso frequente di arresto è quello di diminuire il numero di prove. Questo potrebbe essere realizzato ponendo uno specchio dietro il raggio di analizzare gli arti destro e sinistro in ogni prova, consentendo in tal modo il numero di prove per essere diminuita. Inoltre, assuefazione alla trave può verificarsi dopo sessioni di test multipli e può portare a ratti che rifiutano di attraversare il fascio e rimanere seduti sulla trave, nonostante tutti gli sforzi per motivare l'animale. A causa di questo problema, valutazioni fascio non sono ideali per la prova ripetuta in loesperimenti ng termine. Nei protocolli che utilizzano ripetuti test, la compensazione può anche diventare una preoccupazione, oltre alla motivazione. Per superare i problemi di compensazione durante l'attraversamento del fascio, un fascio conico può essere utilizzato invece di un normale trave di legno 21.

    Anche in questo caso, cambiamenti cognitivi, tra cui una maggiore ansia e cambiamenti nei livelli di attività complessiva e la motivazione, si possono verificare in questo modello animale. Pertanto, è importante prendere nota di eventuali irregolarità tra i gruppi sperimentali per quanto riguarda la motivazione degli animali ad attraversare la trave, così come la loro velocità e il comportamento non-motorio (arresto, seduto, tremando, orientamento) durante l'attraversamento del fascio.

    la ricerca della malattia di Alzheimer comportamentale richiede test di memoria a breve termine e lungo termine, che è stato realizzato qui utilizzando il labirinto d'acqua di Morris. Molti protocolli considerano 24 ore dopo l'apprendimento spaziale per essere memoria a lungo termine 21, ma con questo protocollo aimeline di 24 ore dopo l'apprendimento spaziale è considerata memoria a breve termine e una settimana è considerata memoria a lungo termine. Durante questo periodo di tempo di una settimana in-tra la prova della sonda, i ratti non devono essere esposti ad altri compiti comportamentali o fattori di stress non necessari per evitare interferenze con la memoria di riferimento spaziale Morris water maze.

    Per quanto riguarda l'apprendimento spaziale, gli sperimentatori devono essere persistenti nel richiedere ratto di sedersi sulla piattaforma senza saltare per un certo periodo di tempo. Se il ratto si siede con successo sulla piattaforma, ma salta fuori come gli sperimentatori entrano in vista, il ratto deve essere collocato o guidato di nuovo alla piattaforma e necessario per sedersi sulla piattaforma fino a quando lo sperimentatore recupera l'animale. Per applicare l'apprendimento della piattaforma come l'unico modo per sfuggire l'acqua, i ratti non devono essere raccolti durante il nuoto, a meno che in un ambiente di prova sonda. Se i ratti riescono a saltare dalla piattaforma sul bordo della piscina, prendere in considerazione lo spostamento del platform più verso il centro della vasca di scoraggiare l'apprendimento di un percorso alternativo di fuga.

    Per garantire non ci sono pregiudizi spaziali durante l'apprendimento spaziale e cued, le posizioni di partenza e le posizioni della piattaforma cued per ogni ratto in un gruppo di trattamento devono essere randomizzati. Ciascun gruppo di trattamento deve avere un numero rappresentativo di ratti a partire da ogni posizione di partenza per l'apprendimento spaziale o seguenti la stessa posizione di inizio e la piattaforma di paradigma per l'apprendimento cued. Per l'assegnazione posizioni di partenza, Vorhees e Williams presentano una molto dettagliata serie di posizioni di partenza randomizzati per l'apprendimento spaziale e posizioni di inizio e di piattaforma randomizzati per l'apprendimento cued 20. Questo può essere utilizzato direttamente o come linea guida per assegnare le posizioni ad ogni ratto prima di iniziare il test di Morris water maze.

    Per l'analisi dei dati di Morris water maze, i suggerimenti del protocollo di cui sopra rappresentano come i dati qui presentati sono stati acquisiti. il DATuna rilevati nella fase 3.6 di cui sopra Morris water maze protocollo può essere usato per calcolare le varie misure di esito che possono essere utili per descrivere un deficit cognitivo. Ad esempio, al di là del set di dati numerici, software di monitoraggio offre anche lo sperimentatore l'opportunità di analizzare trame della pista, che può dare ulteriori approfondimenti nelle strategie di ricerca degli animali. Inoltre, la percentuale di tempo trascorso o distanza percorsa all'interno del quadrante bersaglio in relazione a tutti i quadranti può essere usato come misura di memoria di riferimento nelle prove sonda. E 'importante tenere a mente che questi modelli animali co-morbidità possono presentare alcuni deficit motori. Confrontando la velocità di nuotare tra i gruppi sperimentali in grado di dare una indicazione se un deficit potenziale del motore sta influenzando la capacità degli animali di svolgere nel Morris water maze. Inoltre, per escludere le prestazioni del motore di diventare un fattore di confusione in esito acqua labirinto, si consiglia di guardare la lunghezza del percorso per raggiungere la piattaformaoltre alla latenza e nuotare velocità come mostrato nella Figura 5 e 6. Se capacità di nuoto è compromessa in alcun modo, la lunghezza del percorso è la misura più accurata per valutare la funzione ippocampale.

    Mentre ci sono diverse linee temporali differenti che possono essere applicati a tutti questi compiti comportamentali descritti, la metodologia di esecuzione ogni esperimento dovrebbe rimanere lo stesso. I dati qui presentati sono stati ottenuti con un post-ictus punto di tempo di recupero 21 giorni, che cattura i primi eventi dopo l'ictus e la loro potenziale interazione con il metabolismo Ap nel cervello. Mentre i dati presentati qui era in un modello di co-morbidità di ictus e malattia di Alzheimer, queste attività possono essere applicati o adattati per soddisfare le varie domande e modelli di ricerca. Mentre il test del cilindro è una procedura standard meno modificabile, il compito piedi fascio può essere leggermente adattata alla gravità del deficit motorio previsto scegliendo appropriata Widt fasciohs. Il labirinto d'acqua è il test più versatile di tutti i paradigmi citati nel presente documento. Ad esempio, scegliendo vari intervalli tra la fine della fase di acquisizione e il processo sonda di memoria di riferimento spaziale può facilmente verificare breve termine e memoria a lungo termine. la memoria e la strategia di spostamento di lavoro, due componenti della funzione esecutiva, possono essere testati utilizzando l'impostazione acqua labirinto. Per valutare la memoria di lavoro, l'intervallo inter-prova può essere ridotto a meno di 1 min durante l'apprendimento acquisizione di una nuova posizione piattaforma. Inoltre, avendo gli animali imparano una seconda, nuova location della piattaforma dopo l'acquisizione di successo di una posizione iniziale di piattaforma può testare la flessibilità mentale o cambiamento di strategia. Considerando tutti questi possibili modifiche, vi è molta flessibilità con questi compiti comportamentali, che è un altro vantaggio importante oltre a tutti i vantaggi suddetti.

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    Disclosures

    Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Cylinder Western University Plexiglas Cylinder
    Cylinder Diameter: 23 cm
    Cylinder Height: 40 cm
    Platform Height: 30 cm
    Mirror Length: 35 cm
    Mirror Width: 26.5 cm
    This was made specifically by Western University Machine Services for our lab. Please contact your own chosen manufacturer to design this product.
    Handheld Video Camera JVC GZ-E200
    Video Camera Tripod Slik F163
    AM/FM Clock Radio Sylvania SCR1388
    White Board Walmart Width: 71.12 cm
    Height: 55.88 cm
    These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores)
    Dry-erase Marker Expo Expo Dry-erase Original Marker These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores)
    Wooden Beam Rona Plywood
    Width: 2 cm
    Length: 100 cm
    VWR General Purpose Laboratory Tape VWR Intl. 89097-920
    iMovie '11 Apple Inc. Version 9.0.9 (1795) This is the version used in this manuscript, but any other iMovie version or video editing software could be used.
    Morris Water Maze Pool with Platform Stoelting Co. 60136/60035 These are not the exact products used in the video, but these are essentially identical.
    Platform Cue - - The platform cue used was created using a small metal stand and white spherical foam ball. These can likely be purchased at any store with home improvement materials (i.e. Walmart, Rona etc.)
    Mainstays 71" Floor Lamp Walmart HW-F0377SLV
    ANY-Maze Behavioural Tracking Software Stoelting Co. 60000 There are ANY-maze® bundles that include the camera with or without a computer and accessories.
    Compact Video Camera Logitech V-U0023
    Laptop Hewlett-Packard HP Pavilion dv6 Notebook PC Laptop Specifics: AMD A6-3420M APU with Radeon HD Graphics 1.50 GHz, 6.00 GB RAM, 64-bit operating system.
    Americana Non-toxic Acrylic Paint DecoArt DAO67-9 This can be ordered on the DecoArt site or purchased in store at DecoArt retailers.
    Poster Board Walmart PA-1961

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    References

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    Motore e ippocampale Dependent apprendimento spaziale e valutazione della memoria di riferimento in un transgenici ratto modello di malattia di Alzheimer con ictus
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    Au, J. L., Weishaupt, N., Nell, H. J., Whitehead, S. N., Cechetto, D. F. Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke. J. Vis. Exp. (109), e53089, doi:10.3791/53089 (2016).More

    Au, J. L., Weishaupt, N., Nell, H. J., Whitehead, S. N., Cechetto, D. F. Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke. J. Vis. Exp. (109), e53089, doi:10.3791/53089 (2016).

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