Introduction
De flesta bakterieceller har möjlighet att anställa både plankton (fritt levande) och utanpå bifogas (fastsittande) sätt tillväxt 1. I ytan lösa läge för tillväxt, bakterieceller utsöndrar och innesluta sig i stora mängder extracellulära polymera substanser (EPS) för att bilda biofilmer. EPS består huvudsakligen av proteiner, exopolysackarid, extracellulär DNA och är väsentligt för biofilmbildning 2. Den fungerar som en fysisk klätterställning genom vilken bakterier kan använda för att skilja spatialt och skyddar bakterierna från skadliga miljöförhållanden och värdsvar. Olika komponenter av EPS har distinkta roller i biofilmbildning 3 och förändringar i expression av EPS-komponenter kan dramatiskt omforma biofilm strukturerna 4. EPS komponenter kan också fungera som signalmolekyler 5 och senare studier har visat vissa EPS komponenter som interagerar med mikrobiella celler för att vägleda sina migration och biofilm differentiation 6-8.
Forskning om EPS har i hög grad avancerade baserad på morfologiska analyser av biofilmer producerats av mutanter defekta i en viss del av EPS 9,10. Dessutom är EPS kännetecknas vanligen på makroskala (bulk karakterisering) 11. Morfologiska analyser kan dock sakna kvantitativa detalj och bulk karakterisering, som returnerar medelvärden, förlorar detalj som finns inom heterogenitet biofilmen. Det finns nu en ökande trend att gå vidare till realtid karakterisering av de mekaniska egenskaperna av EPS på mikroskala. Detta protokoll visar hur partikelspårning microrheology kan bestämma Spatiotemporal effekterna av matrixkomponenter Pel och PSL exopolysackarider på viskoelasticitet och effektiv tvärbindning av Pseudomonas aeruginosa biofilmer 4.
Passiv microrheology är en enkel och billig rheology metod som ger den högsta genomströmningen av rumslig microrheological provtagning av ett material som hittills 12,13. I passiva microrheology är sond sfärer placeras i provet och deras Brownsk rörelse, driven av termiska energier (k B T) följs av video mikroskopi. Flera partiklar kan spåras simultant, och de tidsberoende koordinater partiklarna följer en konventionell slumpmässig promenad. Därför, i genomsnitt, de partiklar blir kvar i samma position. Emellertid standardavvikelsen för förskjutningarna eller medelkvadrat förskjutningen (MSD) för partiklarna, inte är noll. Eftersom viskösa vätskor flöda, partikeln MSD i en trögflytande vätska växer linjärt eftersom tiden går. Däremot polymertvärbindning som finns i viskoelastisk eller elastiska substanser hjälper dem att motstå flöde och partiklar blir begränsade i deras förskjutning, vilket leder till platåer i MSD-kurvan (Figur 1A). Denna observation följer relationen MSDαt
Storleken, densitet och ytkemin hos partikeln är kritiska för den korrekta tillämpningen av microrheological experimentet och är valda med avseende på det system studerats (i detta fall polymerema i biofilmen matrisen, se figur 1B). För det första mäter partikeln reologin av ämnet med strukturer som är mycket mindre än själva partikeln. Om ämnets strukturer är av liknande omfattning till partikeln, rörelse partikel störs av formen och orienteringen av de individuella strukturerna. Men om de strukturer som omger partikeln är mycket mindre, är denna effekt liten och utjämnas, presentera en homogen miljö till partikeln (Figur 1B). För det andra bör densiteten för partikeln vara liknande till mediet (1,05 g ml -1 för vattenbaserade medier), så att sedimentering undviks och tröghetskrafter är försumbara. De flesta partiklar med polystyren gitter uppfyller ovanstående kriterier. Helst omfattar partikeln inte interagerar med polymererna biofilmen matris enligt den reologiska tolkningen av partikel MSD gäller endast om rörelse är slumpmässig, drivet av värmeenergi och kollision med ämnesstrukturerna. Detta kan observeras genom att kontrollera huruvida sonden partikel tenderar att binda eller studsa ytan av en pre-vuxen biofilm. Men trots avsaknaden av attraktion till biofilmen måste partiklarna kunna inkorporeras i matrisen.Dessutom kan den fysiokemiska heterogenitet biofilmen resultera i olika partiklar är mer lämpade som sönder i olika regioner i biofilmen. Sålunda bör partiklar av olika storlek och ytkemi appliceras på biofilmen.
Som sådan, är partikel MSD kan ge användbar information om hur olika komponenter bidrar till reologi och spridning av biofilm. Vidare har användningen av olika sönder tillåter en att härleda information om den rumsliga fysiokemiska heterogenitet av biofilmen. Denna metod kan användas för att testa effekten antimikrobiell behandling på de mekaniska egenskaperna hos biofilmen, eller för bland biofilmer arter att undersöka hur de mekaniska egenskaperna hos biofilmen ändras från införandet av en annan art. Partikel muskuloskeletala sjukdomar kan även vara användbara för karakterisering av biofilm spridning. Sådana studier skulle vara till hjälp i vår förståelse av biofilmer, potentiellt förbättra biofilm behandlingar pernd engineering av biofilmer för nyttiga aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biofilm Odling
- Framställning av Bakteriestammar
- 1 dag före biofilm odling, förbereda planktonbakteriekulturer genom ympning 2 ml lämpligt odlingsmedium från frysta bakteriekultur. Använd Luria-Broth-medium (10 g L -1 NaCI, 10 g L -1 jästextrakt och 10 g L -1 trypton) för mukoid P. aeruginosa och dess Δ PEL och Δ PSL defekta mutanter. Inkubera över natten vid 37 ° C och 200 rpm skakning betingelser. Späd övernattskulturer till en OD 600 av 0,40 med användning av en spektrofotometer.
- Montera flödescell inställning, som har beskrivits tidigare 14, företrädesvis på en mobil station eller vagn som kan föras in i mikroskopet utrymme för avbildning av flödescellen utan demontering.
- Förbered sterilt odlingsmedium i 2 L eller 5 L flaskor för varje flödescell. Använd minimalt medium M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM NH4CI, 9 mM NaCI, 2 mM MgSO 4, och 0,1 mM CaCl2) kompletterat med 0,04% glukos (vikt / volym) och 0,2% (vikt / volym) kasaminosyror) för P. aeruginosa flödescell biofilmer.
- Alikvotera fluorescerande mikrosfärer i mikrocentrifugrör och spinn ner i sterilt H2O under 5 minuter i centrifug vid 9,391.2 g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 1 ml odlingsmedium för att avlägsna natriumazid (desinfektionsmedel) före tillsats till odlingsmedium i 2 L eller 5 L medel flaskor.
OBS: Olika storlekar av mikrosfärer finns i olika koncentrationer och bör spädas i enlighet med anvisningarna. Exempelvis dispergera 120 | il av mikrosfärer med diametern 1,0 | im, 15 | il av mikrosfärer med diametern 0,5 | im och 0,96 | j, l av mikrosfärer med diametern 0,2 | am till 2 liter tillväxtmedium för att ge 2,18 x 10 6 mikrosfärer ml -1 för varje partikelstorlek. - Fäst medel flaska att upstbunt av flödescell och tillåta tillväxtmedium att strömma genom hela installationen. Stoppa flödet och injicera utspädda övernattskulturer i flödescellkamrarna. Låta bakterier att fästa på täckglas substrat för ett h före fortsatt flöde av odlingsmedium vid en flödeshastighet av cirka 5,5 x 10 -3 m sek -1, eller 8 varv per minut med en peristaltisk pump.
OBS: Biofilmer är vanligtvis odlas vid rumstemperatur (25 ° C) under 3-7 dagar. - Alternativt, för statisk odling inställning, späd natten kulturer 100 gånger i mikrocentrifugrör genom att tillsätta 10 pl av natten kulturen till en ml tillväxtmedium med partiklar. Öka partikelkoncentrationen i odlingsmediet för statisk odling med cirka 500 gånger jämfört med den som används för flödes biofilmer (t.ex. tvätta och resuspendera 600 il sfärer 1,0 um diameter i 10 ml odlingsmedium) som flödescell biofilmer ständigt fylls med partiklar men statiska kulturer inte.
- Lägg 2001, l utspädd natten kultur med partiklar till kamrarna 8 och diabilder. Inkubera vid 37 ° C under statiska betingelser. Biofilmer är vanligtvis odlas för en dag. Byt förbrukade odlingsmedium dagligen med färskt tillväxtmedium med partiklar om biofilm odlas i mer än en dag.
2. Mikroskopi
- På dag 3 och 5, stänga av flödet från peristaltisk pump och föra flödesinställnings cellen i mikroskopi rummet. Klämma slangen nära ingången och utförsel av flödescellkamrarna för att förhindra avdrift (ett systematiskt fel orsak av förändringar i miljön) från flödet. Placera flödescellen på mikroskop scenen av en upprättstående mikroskop.
OBS: Använd ett inverterat mikroskop för avbildning av mikrobrunnar. - Använd fluorescerande mikroskopi med 40x olja mål att ta videor av mikrosfär rörelse inbäddade i biofilmen på olika platser (microcolonies och platta odifferentierade skikt) och i olika dagar (dag 3 och 5) förtids- och rums utredningar. Ta kortare videoklipp med högre bildfrekvens för att undersöka händelser som inträffar inom kort tidsramar (t.ex. 1,5-3 min filmer hos bildhastighet på 25-50 bilder per sekund för snabba dynamik), och längre filmer med lägre bildhastighet för att undersöka händelser under längre tid vågar (t.ex. 15-30 min filmer hos bildhastighet på 2,5-5 bilder / sek för långsammare dynamik).
OBS: En video innehåller typiskt 5-10 partiklar, och är typiskt 1,0-2,5 GB i filstorlek. Större microcolonies kan hålla fler partiklar. Ta 5-10 videoklipp för varje kategori (t.ex. 5-10 videos olika microcolonies och olika platser i platta odifferentierade skikt). Biofilmen har en heterogen arkitektur som kan bestå av microcolonies, kanaler, tomrum och platta odifferentierade skikt. - Spara video i lämpligt format som kan läsas av Fiji / ImageJ (t.ex. czi, tif).
- Kolla videoklipp för drift genom att bläddra genom färdiga VIDeo och observera att partiklarna inte röra sig i samma riktning samtidigt. Drift kan orsakas av z-stegs rörelse, strömmar i flödescellen, obalans av antivibrationsbord, lufttryck eller temperaturförändringar. Korrekt mindre drivande användning av efterbehandlingstekniker vanligtvis försedda med mikroskop programvara. Kasta några filmer där drift inte kan åtgärdas. Registrera följande parametrar, som behövs under Particle Tracking Analys: Upplösning (px / um), Antal ramar, varaktighet.
- Ta bort flödescell från mikroskop scenen och starta peristaltikpump att fortsätta odla biofilmen.
3. Partikel Tracking Analysis
- Skaffa partikel banor med hjälp av plug-in TrackMate i öppen källkod (ImageJ). Ladda Fiji på http://fiji.sc/Fiji. Öppna video med Fiji och under Plugins menyn, välj Tracking och TrackMate.
- Kontrollera eller justera inställningarna i the fönster tyder inledande kalibreringsinställningar för att matcha videoparametrar som registrerats i steg 2.4.
- Detect partiklar i TrackMate med ImageJ.
- Välj "log-detektor", input partikeldiameter och tröskelvärdet (t.ex. 1000). Bläddra igenom videon samtidigt att klicka på "Preview" för att kontrollera att de lila cirklar följer partiklarna hela videon. Justera värden diameter och tröskel som behövs: höja tröskelvärdet om lila cirklar visas i det tomma utrymmet. Minska tröskelvärdet om det inte tillräckligt med partiklar detekteras. Klicka på nästa för att slutföra upptäckt partiklarna.
- Klicka på nästa knappen när du presenteras med möjlighet att lägga till eller ta bort partiklar som upptäcks i "Initial tröskel", "Välj en vy" och "Välj ett filter" fönster för att fortsätta utan justering om initial detektion partikel var tillfredsställande.
- Välj "Simple LAP tracker" i optipå bar "Välj en tracker metod" fönster som partiklar sällan flytta från fokus i biofilmen och lätt spåras. Använd föreslås eller låg länkning och gap-stängnings max avståndsvärden, och klicka på Nästa.
- Kontrollera att partikelspårning är tillfredsställande genom att bläddra igenom videon för att se att partiklar följer spåren teckningar av TrackMate, och att det inte finns några oönskade eller saknade spår. Hoppa över olika filtreringsstegen. Gå till det sista fönstret "Välj en åtgärd". Välj "Exportera spår till xml-fil" från rullgardinsmenyn och klicka på "Kör". Välj en mapp du vill spara spåren.
OBS: Det finns olika program som finns tillgängliga i det offentliga rummet för analys av partikelbanor och användning av microrheology. msdanalyzer och TrackArt är exempel på partikel spårning analys program som körs i Matlab miljön.
- Förbered Matlab för att importera partikel banor i xml-filer genom att välja i menynMatlab File> Set Path ... och lägga till skript mappen finns med Fiji paketet.
- Att analysera partikel banor med msdanalyzer, ladda ner länkar till zip-filen eller tar.gz-filen at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- Extraheramsdanalyzer mappen 15 och släpp den i en mapp som hör till Matlab sökvägen (t.ex. C: Documents and Settings <användarnamn> Mina dokument Matlab). Starta Matlab och initiera analysatorn genom att skriva:
ma = msdanalyzer (2, "um", "sec")
där um och sek är det fysiska utrymmet och tidsenheter i videon.- Importera partikel banor genom att skriva:
[spår, md] = importTrackMateTracks (FileName.xml ',' clipZ ", "ScaleT)
ma = ma.addAll (spår);
där "clipZ" avlägsnar z dimension en 2D-video, och "scaleT". - Rita banor till millimeter använder:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - Beräkna belastningsbesvär hos partiklarna med hjälp av:
ma = ma.computeMSD;
ma.msd - Rita säkerhetsdatabladet i varje partikel:
figur
ma.plotMSD - Kombinera partikel banor från andra filmer i samma categery (t.ex. partiklar inbäddade i vildtyp microcolonies på dag 3) genom att upprepa 3.5.1.1 till 3.5.1.4).
- Rita ensemblen medelvärdet eller genomsnitt över alla kurvor:
ma.plotMeanMSD
Ändra y- och x-axeln från linjär till logaritmisk skala. Vid långa ledtider, MSD kurvorna blir bullriga på grund av otillräckliga statistik på längre tidsskalor. MSD-kurvor kan också stiga kraftigt på grund av dynamiska fel. Dessa regioner av kurvan kan tas bort med hjälp av penselnatt välja slutet av kurvan och välja "Borsta"> "Ta bort oborstad" i Verktyg-menyn.
- Importera partikel banor genom att skriva:
- Hämta Ezyfit på http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ och lägg Ezyfit till en mapp som tillhör Matlab sökvägen (t.ex. C: Documents and Settings <användarnamn> Mina dokument Matlab). Installera Ezyfit menyn genom att skriva i Matlab workspace efmenu installera. Starta MATLAB med Ezyfit menyn i figuren fönstret. Montera MSD kurvorna till makt lag genom att välja i Ezyfit menyn "Visa Fit> Power> 'a * x ^ n' var n är den beräknade diffusiva exponent α.
OBS: msdanalyzer kräver Curve Montering Toolbox i Matlab för montering av MSD kurvor. Ezyfit är ett alternativ och gratis programvara som kan utföra kurvan montering. - Ta bort aktuella partikelbanor och muskuloskeletala sjukdomar för att beräkna nya partikelbelastningsbesvär på andra platser eller tid:
klar Efter beräkning av olika genomsnittliga MSD kurvor av partiklar i medium (kontroll), och microcolonies och odifferentierade områden av olika stammar, kopiera och klistra in kurvorna i en kurva för jämförelse. Prov styvhet och tvärbindning ökar med lägre MSD värden. Platta kurvor har lägre α och provet är mer elastisk än brantare kurvor med högre α. - Välj kurvan och gå till "Verktyg" för att titta på data statistik, såsom medianen och intervallet. MSD på pärlan är proportionell mot krypkomplians, J (t) för det material i vilket vulsten är inbäddad enligt sambandet,
där J = krypkomplians, d = partikeldiameter, k B = Boltzmans konstant, T = temperatur och t = tid.
- Extraheramsdanalyzer mappen 15 och släpp den i en mapp som hör till Matlab sökvägen (t.ex. C: Documents and Settings <användarnamn> Mina dokument Matlab). Starta Matlab och initiera analysatorn genom att skriva:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lokala viskoelastiska egenskaperna hos biofilmen i olika regioner av biofilmen, som omfattade hålrummen (medel ovanför biofilmen), slätter (odifferentierad plant skikt av celler) och mikrokolonier (se etiketterna i Figur 2A) undersöktes. De tidsmässiga förändringar i viskoelastiska egenskaper biofilmen under mognaden från dagar 3 till fem bestämdes också. MSD av partiklarna i hålrummen användes som en kontroll och jämförbar med MSD av partiklar i ren mediet. I motsats, partiklar fastnar i biofilmen vibrerade på fasta positioner och MSD-värden varierade från de typiska för viskoelastiska material starkt elastiska geler (Figur 3).
Mukoida P. aeruginosa vildtyp och dess stammar Δ PEL mutanta (fig 2a och 2b) utvecklade mikrokolonier utspridda på ett tunt slätt vid dag 3 i sina biofilmer. Slätten dag 3 var för tunn förundersökning av reologiska egenskaper. I båda biofilmer som bildas av mukoid P. aeruginosa vildtyp och Δ PEL stammar, MSD av partiklar i dag 3 microcolonies var oberoende av tiden för tidsfördröjningar på 0,1 sek till 10 sek (α = 0), vilket indikerar att microcolonies var elastiska (Figur 4, Tabell 1) . Mediankryp efterlevnad beräknats från motsvarande partikelbelastningsbesvär var 4,3 x 10 -2 Pa -1 och 3,6 x 10 -2 Pa -1 respektive. Vid dag 5 kryp efterlevnad av microcolonies i mukoid P. aeruginosa vildtypstammen ökade till 2,5 x 10 -1 Pa -1, vilket indikerar en minskning i effektiv tvärbindning inuti matrisen. Dagen 5 microcolonies fortfarande elastisk med α = 0. Δ pel förändrades inte i reologi från dag 3 till 5. slätterna i mukoid P. aeruginosa vildtyp och A PEL stammar var similar i elasticitet (α = 0) och effektiv tvärbindning till dag 3 microcolonies, som kan vara reflekterande av deras mognad (odifferentierade struktur).
Biofilmer bildas av Δ PSL mutantstam (Figur 2C) var mindre differentierad och fördröjd utveckling. Detta resulterade i biofilmer med tjocka slätter som utvecklade microcolonies efter dag 3. MSD-värden visade att biofilmer var mycket mindre effektivt tvärbunden än P. aeruginosa vildtyp och A PEL-stammar (Figur 4, Tabell 1). Slätterna var viskoelastiska, med α = 0,12 och 0,26 vid dag 3 och 5 resp. Median krypkomplians dag 3 och 5 slätterna var 1,0 Pa -1. När microcolonies hade utvecklats i dag 5, hade krypkomplians minskade till 2,8 x 10 -1 Pa -1, vilket indikerar att en tröskel tvärbindning krävs för microcolony differentiering. However, var ännu större än krypkomplians yngre dag 3 mukoida P. kryp efterlevnad aeruginosa vildtyp och Δpel mikrokolonier. Dagen 5 microcolonies var viskoelastiska med α = 0,34. Sålunda P. aeruginosa biofilmen är elastiskt och kraftigt tvärbunden i frånvaro av Pel. I avsaknad av Psl blev biofilmen viskoelastiska och mindre tvärbunden. I mogna biofilm strukturer såsom microcolonies, uttryck av både Pel och PSL exopolysackarider resulterat i tydliga reologiska skillnader över tiden. Minskningen av tvärbindning kan bero på en minskning av Psl till Pel exopolysackarider i biofilmen matrisen under mognad.
Figur 1:. Partikel tracking microrheology i en biofilm (A) Grå cirklar visar partikel MSD i en viskös substans, som växer linjärt med tiden ochα = 1. Svart trianglar visar partikel MSD av ett elastiskt ämne, som är oberoende av tid och a = 0. (B) Diagram över sondpartikel vibrerar i EPS biofilmen. Partikeln är modellerad som en bakteriecell och är liknande i diameter. De matrispolymerer som omsluter partikeln är mycket mindre än partikel.
Figur 2: P erspecti v e och sektions vi e w d y 5 biofilmer (grön) b y con f OCAL microsco p y efter conti n nuerlig < strong> f eeding med 1,0 μ m (lila), 0,5 μ m (röd) och 0,2 μ m (orange) pa r larna med negativt laddad karboxylerad yta. Biofilmer bildas från (A) mukoid P. aeruginosa, och mutanter (B) Δ pel och (C) Δ psl stammar. Partiklar är införlivade i alla regioner i biofilmen. Exempel på mikrokolonier, slätter och håligheter är märkta i (A). Modifierad från Chew et al., MBio 2014 4. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
fig3.jpg "/>
Figur 3:. Partikelbanor Jämförelse av ett spår av en partikel utför Brownsk rörelse i odlingsmedium (flerfärgad) jämfört med spår av partiklar vibrerar i biofilm microcolonies (mörkblå). De segmenterade färgerna indikerar avbrott i spårning på grund av partikel flyttar ofokuserad i z-planet.
Figur 4:. Belastningsbesvär på 1,0 um partiklar i biofilmer mukoid P. aeruginosa är elastiskt och microcolonies minskas i effektiv tvärbindning från dag 3 till 5; Δ pel är elastisk och inte förändras i reologi från dagar 3-5; Δ PSL är viskoelastiska och främst består av slätter som inte ändras avsevärt reologi från dagarna 3-5.
| Anstränga | Dag | Regionen </ td> | Median krypkomplians (Pa -1) |
| vild typ | 3 dag | Mikrokoloni | 4,3 x 10 -2 |
| vild typ | 5 dag | Mikrokoloni | 2,5 x 10 -1 |
| vild typ | 5 dag | Vanlig | 4,1 x 10 -2 |
| Δpel | 3 dag | Mikrokoloni | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 dag | Mikrokoloni | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 dag | Vanlig | 3,2 x 10 -2 |
| Δpsl | 3 dag | Vanlig | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 dag | Vanlig | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 dag | Mikrokoloni | 2,8 x 10 -1 |
Tabell 1: Median kryp överträdelser och uppskattade diffusa exponenter av vildtyp och mutantstammar enligt biofilm ålder och region.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microrheology är ett användbart verktyg för lokala reologiska mätningar i heterogena system, såsom mikrobiella biofilmer. Det är en icke-förstörande teknik, gör det möjligt för realtidsövervakning av reologiska förändringar inom samma biologiska provet över flera tidpunkter. I detta protokoll var partikel-tracking microrheology tillämpas på Pel och PSL mutanter exopolysackarid för att undersöka hur de påverkar elasticiteten och effektiv tvärbindning av biofilmen matrisen. PSL gynnar utvecklingen av elastiska biofilmer med hög effektiv tvärbindning, medan Pel gynnar viskoelastiska och lösare biofilmer. När båda exopolysackarider produceras, blir biofilmmikrokolonier mindre effektivt tvärbindas som biofilmen mognar, förenligt med en minskning av Psl över Pel.
Biofilmer bildas av olika bakteriearter har olika EPS kompositioner. EPS av mukoid P. aeruginosa stammar som användes i denna studie huvudsakligen eventutrym m av exopolysackarider 16. Andra arter kan använda stora extracellulära adhesionsproteiner 17 och DNA 18 som deras huvudkomponenter i EPS. Tillvägagångssättet som beskrivs här kan användas för att bestämma den reologiska bidrag övriga EPS komponenter och deras effekt på tillväxten. Dessutom kan biofilmer odlas i olika uppställningar har drastiskt olika fysikaliska egenskaper som påverkar deras reologi. Till exempel, mukoida P. aeruginosa kompletterat med glukos bildar mer biofilm med mycket differentierade strukturer under flöde jämfört med statiska förhållanden. Studier har också visat att biofilmer utsätts för skjuvspänning såsom flöde gör biofilmer mer sammanhängande och elastisk 19,20. Viktiga steg och faktorer att tänka på för en framgångsrik biofilm partikelspårning microrheology studien är följande:
Systemet dimensioner för utredning eller omfattningen av intresse med avseende på tid och rum
innehåll "> När man överväger rumsliga skalor, måste en överväga storleken på de strukturer som ger upphov till de viskoelastiska egenskaperna hos systemet (i vårt fall, polymererna biofilmen matrisen) bör. Polymererna som omger sond partikeln vara mycket mindre i struktur än partikeln och presentera ett isotropt miljö till partikeln. Högupplöst avbildning krävs för att fånga små partiklar rörelse eller vibrationer, men kommer att minska den areal avbildas för motsvarande filstorlek. När man överväger tidsskalor, elastiska biofilmer som uppvisar långsam dynamik kräver du spelar in video över längre tidsskalor (t.ex. hr) och med hjälp av låga frame rates (t.ex. min). Kortare video kan tas för viskoelastiska biofilmer med snabba dynamik (min), men kräver högre bildfrekvens (s eller millisekunder). Använda lämpliga upplösning, bildhastighet, video varaktighet för varje experiment kommer att hålla filstorlekar låg för lätthanterligt analys.Biofilm viskoelasticitet, hanterogeneity och dimensioner
Partikel rörelse kan vara odetekterbara i mycket elastiska biofilmer (MSD <10 -4). I sådana fall aktiva microrheological tekniker som tillämpar kraft för att förskjuta partikeln är att föredra. Reologisk provtagning av olika regioner av biofilm bör göras för att säkerställa den mekaniska heterogenitet biofilmen fångas. Heterogena morfologi, dock inte nödvändigtvis en bra indikator på mekanisk heterogenitet, som trots homogena framträdanden biofilmen kan vara komplicerat i reologi: Δpsl biofilmer är mer homogena i morfologi och försenade i differentiering, men har en komplex och heterogen reologisk profil. Däremot Δpel biofilmer har en heterogen utseende med väl differentierade mikrokolonier men en konstant reologi hela biofilmen. För biofilmer med stora microcolony dimensioner (t.ex.> 50 mikrometer i diameter och höjd), kan det vara menings sTudy de reologiska skillnader enligt höjd (toppen och botten av microcolonies), eller avstånd från microcolony kant.
Val av probpartiklar
Såsom beskrivits ovan, bör storleken av partiklarna vara större än strukturerna för de material som ger upphov till dess viskoelastiska egenskaper. Dessutom kan partiklar med olika ytkemi resultera i bindning till olika områden och EPS komponenter inom biofilmen. Således effekterna av partiklar med olika ytkemi bör undersökas så kan anses att biofilm heterogenitet. Alla sond partiklar bör ha en hög zeta potential att minimera agglomerering. Partiklar som binder samman kan inte användas som exakta prober och bör undantas från analysen.
Minimering av avdrift
Drift kan orsakas av temperatur- eller lufttrycksförändringar, mikroskop scenen rörelse (vanligtvis i z-riktningen), anti-vibration bord obalans och internt flöde i systemet. Drivor brukar resultera i superdiffusion av partikeln och α> 1. En α> 1 anger att andra än värmeenergi, aktiva processer är involverade rörliga partikel och passiv microrheology är inte tillämplig.
Korrekt biofilmodlingsunderhåll
Flödesceller måste vara korrekt monterade för att förhindra läckage och biofilmer måste hållas fria från föroreningar. Biofilmer kan också odlas i andra uppställningar alternativ till flödescellen, såsom rutschbanor och mikrobrunnarna för statiska odlingsbetingelser. Ett inverterat mikroskop bör användas för avbildning av mikrobrunnar.
Sammanfattningsvis är spårning partikel microrheology en användbar teknik som kan användas med hjälp av mikroskop standard till ett biologiskt laboratorium. Därutöver kan program som är inblandade i beräkning och analys av partikelbelastningsbesvär är lättillgänglig i det offentliga rummet.Till exempel, msdanalyzer och TrackArt 21 (http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart) är program som körs i Matlab miljön. Men eftersom teknik bygger endast på termisk energi för att flytta partiklarna, är det inte kan lösa mellan prover med högre elasticitet. Aktiva tekniker, såsom magnetisk tweezing, applicera en kraft på partikeln att agera på och flytta inom provet och skulle kunna bestämma viskoelasticiteten av mycket elastiska prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av National Research Foundation och undervisningsministeriet Singapore under dess forskningscentrum of Excellence-programmet, igångsättnings Grants (M4330002.C70) från Nanyang Technological University, och AcRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) från undervisningsministeriet, Singapore. Författarna tackar Joey Yam Kuok Hoong för att ha deltagit i demonstrationen av detta protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A.
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
