Introduction
معظم الخلايا البكتيرية هي قادرة على توظيف كل من العوالق (حرة المعيشة) و (لاطئة) وسائط المرفقة سطح النمو 1. في وضع المرفقة سطح نمو الخلايا البكتيرية تفرز ويغلف أنفسهم في كميات كبيرة من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) لتشكيل الأغشية الحيوية. وEPS يتكون أساسا من البروتينات، exopolysaccharide، DNA خارج الخلية وضروري لتشكيل بيوفيلم 2. وهو بمثابة سقالة المادية التي البكتيريا يمكن استخدامها للتمييز مكانيا، ويحمي البكتيريا من الظروف البيئية الضارة والاستجابات المضيفة. مكونات مختلفة من EPS لها أدوار متميزة في تشكيل بيوفيلم 3 والتغيرات في التعبير عن مكونات EPS يمكن إعادة تشكيلها بشكل كبير هياكل بيوفيلم 4. يمكن مكونات EPS تعمل أيضا يشير إلى جزيئات 5، وأظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا بعض المكونات EPS التفاعل مع الخلايا الميكروبية لتوجيه الهجرة وبيوفيلم فرق بهمerentiation 6-8.
البحث عن EPS وكثيرا المتقدمة بناء على التحليلات المورفولوجية الأغشية الحيوية التي تنتجها المسوخ المعيبة في مكون محدد من EPS 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، وعادة ما تميزت به EPS على المستوى الكلي (توصيف بالجملة) 11. الصرفية يحلل ومع ذلك، يمكن تفتقر إلى التفاصيل الكمي وتوصيف بالجملة، والتي ترجع متوسط القيم، يفقد التفاصيل الموجودة داخل تجانس بيوفيلم. الآن هناك اتجاه متزايد للتقدم إلى توصيف الوقت الحقيقي من الخصائص الميكانيكية للEPS على النطاق الصغير. يوضح هذا البروتوكول كيف microrheology الجسيمات تتبع غير قادرة على تحديد الآثار الزمانية المكانية من مكونات المصفوفة عرض بيل وexopolysaccharides البولندي على زوجة مطاطية وفعال يشابك الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية 4.
microrheology السلبي هو الم بسيط وغير مكلفطريقة eology التي توفر أعلى سرعة نقل العينات microrheological المكانية للمادة حتى الآن 12،13. في microrheology السلبي، وتوضع دوائر التحقيق في العينة ويتبع حركتها البراونية، مدفوعا الطاقات الحرارية (ك B T) بواسطة المجهر الفيديو. يمكن تتبع عدة جزيئات في وقت واحد، والإحداثيات التي تعتمد على الوقت من الجسيمات يتبع المشي العشوائي التقليدية. لذلك، في المتوسط، تبقى جسيمات في نفس الموقف. ومع ذلك، فإن الانحراف المعياري للنزوح أو متوسط تربيع النزوح (MSD) من الجسيمات، ليس صفرا. منذ تدفق سوائل لزجة، والجسيمات MSD في السائل اللزج ينمو خطيا مع مرور الوقت. في المقابل، يشابك البوليمر وجدت في اللزجة أو المواد المرنة تساعدهم على مقاومة التدفق، وتصبح جزيئات محدود في نزوحهم، مما أدى إلى الهضاب في منحنى MSD (الشكل 1A). هذه الملاحظة تتبع العلاقة MSDαt
حجم وكثافة وسطح الكيمياء من الجسيمات حاسمة لتطبيق الصحيح للتجربة microrheological ويتم اختيار فيما يتعلق بنظام درس (في هذه الحالة البوليمرات المصفوفة بيوفيلم، انظر الشكل 1B). أولا، الجسيمات يقيس الريولوجيا للمادة مع الهياكل التي هي أصغر بكثير من الجسيمات نفسها. إذا هياكل مادة هي على نطاق مماثل لالجسيمات، وحركة المساواةومن دواعي جسيما من جانب الشكل والتوجه للهياكل الفردية. ومع ذلك، إذا الهياكل المحيطة الجسيمات هي أصغر من ذلك بكثير، وهذا التأثير هو صغير ومتوسط من، تقديم بيئة متجانسة إلى الجسيمات (الشكل 1B). ثانيا، يجب أن تكون كثافة الجسيمات مماثلة إلى متوسطة (1.05 ز مل -1 لوسائل الإعلام تعتمد على الماء) بحيث يتم تجنب الترسيب وقوات بالقصور الذاتي تكاد لا تذكر. معظم الجسيمات مع الشبكات البوليسترين تفي بالمعايير أعلاه. من الناحية المثالية، والجسيمات لا تتفاعل مع البوليمرات المصفوفة بيوفيلم كما تفسير الانسيابية من الجسيمات MSD صالحا إلا إذا كان الاقتراح هو عشوائي، مدفوعا الطاقة الحرارية والتصادم مع الهياكل الجوهر. هذا يمكن ملاحظتها عن طريق فحص ما إذا كانت الجسيمات التحقيق يميل إلى ربط أو ترتد على سطح بيوفيلم قبل نمت. ومع ذلك، على الرغم من عدم وجود جاذبية للبيوفيلم، يجب أن تكون قادرا على أن تدرج في مصفوفة الجسيمات.بالإضافة إلى ذلك، عدم تجانس الفيزيائية للبيوفيلم قد يؤدي إلى جزيئات مختلفة كونها أكثر ملاءمة كما تحقيقات في مناطق مختلفة من بيوفيلم. وهكذا، والجسيمات ذات الأحجام المختلفة والكيمياء السطحية يجب أن تطبق على بيوفيلم.
على هذا النحو، والجسيمات MSD غير قادرة على تقديم معلومات مفيدة عن كيفية مختلفة تساهم المكونات إلى الريولوجيا وانتشار بيوفيلم. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام مجسات مختلفة يسمح احد لاستخلاص المعلومات عن التجانس الفيزيائية المكاني للبيوفيلم. هذه الطريقة يمكن استخدامها لاختبار تأثير العلاج المضادة للميكروبات على الخواص الميكانيكية للبيوفيلم، أو تطبيقها على الأغشية الحيوية الأنواع المختلطة لمعرفة كيف يتم تغيير الخواص الميكانيكية للبيوفيلم من إدخال أنواع أخرى. قد تكون الجسيمات العضلية الهيكلية مفيدة أيضا لوصف بيوفيلم تشتت. ومن شأن هذه الدراسات أن تكون مفيدة في فهمنا للالأغشية الحيوية، ويحتمل أن تحسين العلاجات بيوفيلم لالهندسة الثانية من الأغشية الحيوية للأنشطة مفيدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بيوفيلم زراعة
- إعداد السلالات البكتيرية
- 1 يوم قبل زراعة بيوفيلم، وإعداد الثقافات البكتيرية العوالق، فحقن 2 مل من متوسط النمو المناسب من ثقافة البكتيرية المجمدة. استخدام لوريا، مرق المتوسطة (10 ز L -1 كلوريد الصوديوم، و 10 غرام L -1 خلاصة الخميرة، و 10 ز L -1 تريبتون) لمخاطي P. الزنجارية وااا Δ Δ والبولندي المسوخ التي المعيبة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة يهز ظروف. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD 600 0.40 باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
- تجميع الإعداد خلية تدفق، التي وصفت في وقت سابق 14، ويفضل على محطة المحمول أو العربة التي يمكن جلبها إلى غرفة المجهر لتصوير الخلية تدفق دون التفكيك.
- إعداد معقم متوسط النمو في 2 L أو 5 زجاجات L لكل خلية التدفق. استخدام الحد الأدنى من المتوسط M9 (48 ملي نا 2 هبو 4 و 22 مليKH 2 PO 4، 19 ملي NH 4 الكلورين، 9 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي MgSO 4، و 0.1 ملي CaCl 2) تستكمل مع 0.04٪ الجلوكوز (وزن / المجلد) و 0.2٪ (وزن / المجلد) casamino الأحماض) لP. الزنجارية تدفق الأغشية الحيوية الخلية.
- المجهرية قسامة الفلورسنت في أنابيب microcentrifuge وتدور باستمرار في H 2 O معقمة لمدة 5 دقائق في أجهزة الطرد المركزي في 9،391.2 ز. إزالة وطاف resuspend في 1 مل نمو متوسط إلى إزالة أزيد الصوديوم (مطهر) قبل إضافة إلى نمو متوسط 2 L أو 5 زجاجات L المتوسطة.
ملاحظة: أحجام مختلفة من المجهرية تأتي في تركيزات مختلفة ويجب تخفيفه وفقا للتعليمات. على سبيل المثال، تفريق 120 ميكرولتر من 1.0 ميكرون المجهرية قطر، 15 ميكرولتر من 0.5 ميكرون المجهرية قطر و0.96 ميكرولتر من 0.2 ميكرون المجهرية قطر إلى 2 L من متوسط النمو لإعطاء 2.18 × 10 6 المجهرية مل -1 لكل حجم الجسيمات. - نعلق زجاجة متوسطة إلى upstماعون من خلية تدفق والسماح النمو المتوسطة في التدفق من خلال الإعداد بأكمله. وقف تدفق وضخ الثقافات بين عشية وضحاها المخفف إلى غرف الخلية التدفق. تسمح للبكتيريا ان نعلق على قوام ساترة لمدة 1 ساعة قبل مواصلة تدفق وسط النمو بمعدل تدفق ما يقرب من 5.5 × 10 -3 م ثانية -1، أو 8 دورة في الدقيقة مع مضخة تحوي.
وعادة ما نمت الأغشية الحيوية في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 3-7 أيام: ملاحظة. - بدلا من ذلك، على سبيل ثابت الإعداد الثقافة، وتمييع الثقافات بين عشية وضحاها 100 أضعاف في أنابيب microcentrifuge بإضافة 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 1 مل النمو المتوسطة مع جزيئات. زيادة تركيز الجسيمات في وسط النمو للثقافة ثابتة قبل ما يقرب من 500 أضعاف مقارنة مع تلك المستخدمة في الأغشية الحيوية تدفق (مثل غسل و resuspend 600 ميكرولتر من 1.0 ميكرون المجالات قطر في 10 مل من متوسط النمو) كما الأغشية الحيوية خلية تدفق تتجدد باستمرار مع الجسيمات ولكن الثقافات ثابتة ليست كذلك.
- إضافة 2001؛ لتر من الثقافة بين عشية وضحاها المخفف مع جزيئات لغرف 8 الشرائح جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة. وعادة ما نمت الأغشية الحيوية لمدة 1 يوم. استبدال قضى المتوسطة النمو يوميا مع متوسط نمو جديدة مع الجسيمات إذا نمت بيوفيلم لأكثر من 1 في اليوم.
2. المجهر
- في يوم 3 و 5، وإيقاف تدفق من مضخة تحوي وجلب تدفق إعداد الخلية إلى غرفة الفحص المجهري. المشبك أنابيب بالقرب من مدخل ومخرج للغرف خلية تدفق لمنع الانجراف (سبب الخطأ المنهجي بالتغيرات التي تطرأ على البيئة) من التدفق. وضع خلية تدفق على خشبة المسرح مجهر المجهر تستقيم.
ملاحظة: استخدام مجهر مقلوب لتصوير microwells. - استخدام المجهر الفلورسنت مع 40X الهدف النفط لاتخاذ أشرطة الفيديو من microsphere الحركة جزءا لا يتجزأ من بيوفيلم في مواقع مختلفة (microcolonies وطبقات متمايزة مسطحة) وفي أيام مختلفة (يوم 3 و 5) لالتحقيقات الزمانية والمكانية. اتخاذ أشرطة الفيديو أقصر مع ارتفاع معدل الإطار للتحقيق في الأحداث التي وقعت ضمن جداول زمنية قصيرة (على سبيل المثال 1.5-3 أشرطة الفيديو دقيقة في معدل الإطار من 25-50 لقطة في الثانية لديناميكية سريعة)، وأشرطة الفيديو أطول مع انخفاض معدل الإطار للتحقيق في الأحداث على مر الزمن الطويل جداول (مثل أشرطة الفيديو 15-30 دقيقة في معدل الإطار من 2.5-5 لقطة / ثانية لديناميات أبطأ).
ملاحظة: يحتوي الفيديو عادة 5-10 الجسيمات، وعادة ما يكون من 1،0-2،5 GB في حجم الملف. microcolonies أكبر قد عقد المزيد من الجسيمات. تأخذ 5-10 أشرطة الفيديو لكل فئة (على سبيل المثال 5-10 أشرطة الفيديو من microcolonies مختلفة ومواقع مختلفة في طبقات متمايزة مسطحة). بيوفيلم لديه بنية متجانسة التي قد تتكون من microcolonies، قنوات، الفراغات وطبقات متمايزة مسطحة. - حفظ ملفات الفيديو في الشكل المناسب الذي يمكن قراءتها من قبل فيجي / يماغيج (على سبيل المثال czi، TIF).
- تحقق من أشرطة الفيديو لالانجراف عن طريق التمرير من خلال فيد النهائيEO وأشار إلى أن الجزيئات لا تتحرك في نفس الاتجاه في وقت واحد. يمكن أن يكون سبب الانحراف تلو مرحلة Z الحركة، والتيارات في الخلية التدفق، والخلل في جدول مضادة للاهتزاز، وضغط الهواء أو التغيرات في درجات الحرارة. قاصر الصحيح الانجراف باستخدام تقنيات ما بعد المعالجة التي تقدم عادة مع برنامج المجهر. تجاهل أي أشرطة الفيديو حيث لا يمكن تصحيح الانحراف. تسجيل المعلمات التالية، وهي مطلوبة من خلال تحليل الجسيمات تتبع: القرار (بكسل / أم)، عدد من إطارات، المدة.
- إزالة خلية تدفق من مرحلة المجهر وإعادة تشغيل مضخة تحوي على مواصلة زراعة بيوفيلم.
3. الجسيمات تحليل تتبع
- الحصول على مسارات الجسيمات باستخدام المكونات في TrackMate في مجال البرمجيات مفتوحة المصدر (يماغيج). تحميل فيجي في http://fiji.sc/Fiji. فتح الفيديو مع فيجي وضمن القائمة الإضافات، حدد تتبع وTrackMate.
- تحقق أو ضبط الإعدادات في الالبريد يوحي إعدادات المعايرة الأولية لتتناسب مع المعلمات الفيديو كما هو مسجل في الخطوة 2.4 النافذة.
- كشف الجسيمات في TrackMate باستخدام يماغيج.
- اختر 'للكشف عن سجل "، ومدخلات قطر الجسيمات وقيمة العتبة (على سبيل المثال 1000). التمرير عبر الفيديو في حين النقر على الزر "معاينة" للتأكد من أن الدوائر الأرجواني تتبع الجسيمات في جميع أنحاء الفيديو. ضبط القطر والعتبة القيم عند الضرورة: زيادة قيمة العتبة في حالة ظهور الدوائر الأرجواني في المساحة الفارغة. تخفيض قيمة عتبة إذا تم الكشف عن الجسيمات ليست كافية. انقر على زر المقبل لاستكمال الكشف عن الجسيمات.
- انقر على زر التالي عندما قدم مع خيار لإضافة أو إزالة الجزيئات المكتشفة في "العتبة الأولية '،' حدد طريقة عرض" و "اختر مرشح 'ويندوز لمواصلة دون تعديل إذا كان الكشف عن الجسيمات الأولية مرضية.
- اختر 'LAP تعقب بسيط "في غروبعلى شريط "حدد طريقة تعقب 'نافذة كما الجسيمات نادرا ما ينتقل من التركيز في بيوفيلم ويتم تعقبها بسهولة. استخدام المقترح أو منخفضة الربط والفجوة بين اقفال قيم أقصى مسافة، وانقر فوق التالي.
- تأكد من أن تتبع الجسيمات غير مرضية عن طريق التمرير من خلال الفيديو لمعرفة أن الجسيمات يتتبعون التي رسمها TrackMate، وأنه لا توجد مسارات غير المرغوب فيها أو في عداد المفقودين. تخطي مختلف خطوات الترشيح. انتقل إلى نافذة النهائي "حدد الإجراء". اختر 'مسارات تصدير إلى ملف xml' من القائمة المنسدلة وانقر فوق "تنفيذ". اختيار مجلد لحفظ المسارات.
ملاحظة: هناك العديد من البرامج المتاحة في المجال العام لتحليل مسارات الجسيمات واستخدام microrheology. msdanalyzer وTrackArt أمثلة من الجسيمات تتبع برامج التحليل التي تعمل في بيئة ماتلاب.
- إعداد مطلب لاستيراد مسارات الجسيمات في ملفات XML عن طريق اختيار في قائمةملف ماتلاب> تعيين مسار ... وإضافة مجلد البرامج النصية المتاحة مع حزمة فيجي.
- لتحليل مسارات الجسيمات مع msdanalyzer، تحميل رابط لملف مضغوط أو tar.gz الملف at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- استخراج المجلدmsdanalyzer 15 وأسقطه في المجلد الذي ينتمي إلى مسار ماتلاب (على سبيل المثال C: الوثائق وإعدادات <اسم المستخدم> المستندات ماتلاب). بدء مطلب وبدء محلل بكتابة:
أماه = msdanalyzer (2، 'أم'، 'ثانية')
حيث أم والثانية هي وحدة المكان والزمان المادية في الفيديو.- استيراد مسارات الجسيمات عن طريق الكتابة:
[المسارات، MD] = importTrackMateTracks ('FileName.xml'، 'clipZ ".، 'scaleT')
أماه = ma.addAll (مسارات)؛
حيث 'clipZ "يزيل البعد Z للحصول على فيديو 2D، و" scaleT. - رسم المسارات على الرسم البياني باستخدام:
ma.plotTracks.
ma.labelPlotTracks. - حساب العضلية الهيكلية من الجسيمات باستخدام:
أماه = ma.computeMSD.
ma.msd - رسم العضلية الهيكلية كل الجسيمات:
الشكل
ma.plotMSD - الجمع بين مسارات الجسيمات من أشرطة الفيديو وغيرها من نفس categery (على سبيل المثال الجزيئات جزءا لا يتجزأ من النوع البري microcolonies في يوم 3) بتكرار 3.5.1.1 ل3.5.1.4).
- رسم يعني الفرقة أو متوسط على كل المنحنيات:
ma.plotMeanMSD
تغيير Y- ومحور س من الخطية إلى مقياس لوغاريتمي. في بعض الأحيان فارق زمني طويل، منحنيات MSD تصبح صاخبة بسبب إحصاءات كافية في فترات زمنية أطول. قد ترتفع منحنيات MSD أيضا بشكل حاد بسبب خطأ الديناميكي. ويمكن إزالة هذه المناطق من منحنى باستخدام أداة الفرشاةلتحديد نهاية منحنى واختيار 'تنظيف'> 'إزالة Unbrushed "في القائمة أدوات.
- استيراد مسارات الجسيمات عن طريق الكتابة:
- تحميل Ezyfit في http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ وإضافة Ezyfit إلى مجلد تنتمي إلى المسار ماتلاب (على سبيل المثال C: الوثائق وإعدادات <اسم المستخدم> المستندات ماتلاب). تثبيت القائمة Ezyfit عن طريق كتابة في Matlab مساحة العمل efmenu تثبيت. إعادة تشغيل MATLAB مع القائمة Ezyfit في إطار الشكل. تناسب منحنيات MSD للقانون الطاقة عن طريق اختيار في القائمة Ezyfit 'عرض صالح'> 'الطاقة'> 'ل* س ^ ن' كانت n هو الأس α ناشر المقدرة.
ملاحظة: msdanalyzer يتطلب المنحنى تركيب أدوات في Matlab لتركيب منحنيات MSD. Ezyfit هو بديل والبرمجيات الحرة التي يمكن أن تؤدي منحنى المناسب. - واضحة مسارات الجسيمات الحالية والمشاكل العضلية الهيكلية لحساب العضلية الهيكلية جسيمات جديدة في مواقع أو زمنية أخرى:
صافي بعد احتساب مختلف منحنيات متوسط MSD الجسيمات في المتوسطة (السيطرة)، وmicrocolonies والمناطق غير متمايزة من مختلف السلالات، ونسخ ولصق المنحنيات في رسم بياني واحد للمقارنة. صلابة عينة ويشابك الزيادة مع القيم MSD أقل. المنحنيات المستوية لها α الدنيا والعينة هي أكثر مرونة من منحنيات حاد مع ارتفاع α. - تحديد منحنى وانتقل إلى "أدوات" لإلقاء نظرة على البيانات الإحصائية، مثل الوسيط والمدى. وMSD للحبة يتناسب مع الامتثال زحف، J (ر) من المادة التي تم تضمين حبة وفقا للعلاقة،
حيث J = الامتثال الزحف، د = الجسيمات قطر، ك B = بولتزمان ثابتة، T = درجة الحرارة ور = الوقت.
- استخراج المجلدmsdanalyzer 15 وأسقطه في المجلد الذي ينتمي إلى مسار ماتلاب (على سبيل المثال C: الوثائق وإعدادات <اسم المستخدم> المستندات ماتلاب). بدء مطلب وبدء محلل بكتابة:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم التحقيق خصائص اللزجة المحلية للبيوفيلم في مناطق مختلفة من بيوفيلم، والتي تضمنت الفراغات (متوسطة فوق بيوفيلم) والسهول (طبقة مسطحة غير متمايزة من الخلايا) وmicrocolonies (انظر التسميات في الشكل 2A). 3-5 حددت أيضا التغيرات الزمانية في الخصائص اللزجة من بيوفيلم خلال النضج من الأيام. تم استخدام MSD للجسيمات في الفراغات كوسيلة لمراقبة وقابلة للمقارنة إلى MSD الجسيمات في وسط النقي. في المقابل، الجسيمات المحاصرين في بيوفيلم صدي في مواقع ثابتة وتراوحت قيم MSD من تلك نموذجية من المواد اللزجة على المواد الهلامية مرنة بقوة (الشكل 3).
مخاطي P. الزنجارية من النوع البري وسلالات متحولة Δ ااا لها (الشكل 2A و 2B) وضعت microcolonies المنتشرة في سهل رقيقة يوم 3 في الأغشية الحيوية الخاصة بهم. كان سهل في يوم 3 رقيقة جدا لالتحقيق في خصائص الانسيابية. في كل من الأغشية الحيوية التي شكلتها P. مخاطي الزنجارية من النوع البري وΔ ااا السلالات، وكان MSD الجزيئات في يوم 3 microcolonies مستقل من الوقت لالفارق الزمني من 0.1 ثانية إلى 10 ثانية (α = 0)، مشيرا إلى أن microcolonies كانت مرنة (الشكل 4، الجدول 1) . كانت الإذعان زحف متوسط المحسوبة من المشاكل العضلية الهيكلية الجسيمات المقابلة 4.3 × 10 -2 باسكال -1 و 3.6 × 10 -2 باسكال -1 على التوالي. يوم 5 امتثال زحف من microcolonies في مخاطي P. زاد الزنجارية من نوع السلالة البرية إلى 2.5 × 10 -1 باسكال -1، مما يشير إلى انخفاض في يشابك فعال داخل المصفوفة. لا تزال اليوم 5 microcolonies مرونة مع α = 0. Δ ااا لم يغير في الريولوجيا من أيام 3 إلى 5. والسهول في مخاطي P. كانت الزنجارية من النوع البري وسلالات ااا Δ سيميلار في مرونة (α = 0) ويشابك فعال ليوم 3 microcolonies، التي يمكن أن تكون تعبيرا عن نضجها (الهيكل المشوه).
وكانت الأغشية الحيوية التي شكلتها Δ سلالة متحولة البولندي (الشكل 2C) أقل متباينة، وتأخر في عملية التنمية. وأدى ذلك إلى الأغشية الحيوية مع السهول سميكة التي وضعت microcolonies بعد يوم 3. القيم وMSD أظهرت أن الأغشية الحيوية كانت أقل بكثير crosslinked فعالية من P. الزنجارية من النوع البري وسلالات ااا Δ (الشكل 4، الجدول 1). وكانت السهول اللزجة، مع α = 0.12 و 0.26 في أيام 3 و 5 على التوالي. كان الامتثال زحف متوسط يوم 3 و 5 السهول 1.0 باسكال -1. عندما microcolonies قد وضعت في يوم 5، وكان امتثال زحف انخفضت إلى 2.8 × 10 -1 باسكال -1، مما يدل على أن يشابك عتبة مطلوب للمستعمرة مجهرية التمايز. Howeveص، وكان الامتثال زحف لا يزال أكبر من الامتثال زحف يوم الاصغر 3 مخاطي P. الزنجارية من النوع البري وmicrocolonies Δpel. كان يوم 5 microcolonies اللزجة مع α = 0.34. وهكذا، فإن P. الزنجارية بيوفيلم هو مرن وcrosslinked غاية في غياب عرض بيل. في غياب قانون الأحوال الشخصية، وأصبح بيوفيلم اللزجة وأقل crosslinked. في هياكل بيوفيلم ناضجة مثل microcolonies، أدى التعبير عن كل من عرض بيل وexopolysaccharides البولندي في الخلافات الريولوجية متميزة مع مرور الوقت. يمكن أن يعزى إلى الحد من البولندي لexopolysaccharides عرض بيل في المصفوفة بيوفيلم خلال نضوج انخفاض يشابك.
الشكل 1: الجسيمات تتبع microrheology في بيوفيلم (A) الدوائر الرمادية تصور الجسيمات MSD في مادة لزجة، الذي ينمو خطيا مع الوقت وα = 1. مثلثات سوداء تصور الجسيمات MSD من مادة مرنة، وهي مستقلة عن الوقت و= 0. (B) رسم تخطيطي لتحقيق الجسيمات تهتز في EPS بيوفيلم. وعلى غرار الجسيمات مثل خلية البكتيريا ويشبه في القطر. البوليمرات المصفوفة التي تغلف الجسيمات هي أصغر بكثير من الجسيمات.
الشكل 2: P erspecti ضد الإلكترونية والاقسام السادس ه w من د ذ 5 الأغشية الحيوية (الأخضر) ب ص يخدع و OCAL microsco ص ص بعد ن كونتي uous < قوية> و eeding مع 1.0 μ م (الأرجواني)، و 0.5 μ م (الأحمر) و 0.2 μ م (برتقالي) سنويا ص جسيمات سالبة الشحنة مع سطح carboxylated. الأغشية الحيوية تشكلت من (A) مخاطي P. الزنجارية، والمسوخ (B) ااا Δ و (C) Δ سلالات البولندي. تدرج الجسيمات في جميع مناطق بيوفيلم. وصفت أمثلة microcolonies والسهول والفراغات في (A). تعديل من تشيو وآخرون، mBio، 2014. (4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
fig3.jpg "/>
الرقم 3: مسارات الجسيمات مقارنة بين مسار جسيم تنفيذ الحركة البراونية في النمو المتوسطة (متعدد الألوان) مقارنة مسارات الجزيئات تهتز في microcolonies بيوفيلم (الأزرق الداكن). الألوان مجزأة تشير فواصل في تعقب بسبب الجسيمات تتحرك من التركيز في ض الطائرة.
الرقم 4: العضلية الهيكلية من 1.0 ميكرون الجسيمات في الأغشية الحيوية مخاطي P. الزنجارية هي مرنة ويتم تخفيض microcolonies في يشابك اعتبارا من يوم 3-5. Δ ااا غير مرنة ولا تغيير في الريولوجيا من أيام 3-5. Δ البولندي هو اللزجة ويتكون أساسا من السهول التي لا تتغير بشكل ملحوظ في الريولوجيا من أيام 3-5.
| سلالة | يوم | المنطقة </ td> | متوسط زحف الامتثال (باسكال -1) |
| من النوع البري | 3 يوم | مستعمرة مجهرية | 4.3 × 10 -2 |
| من النوع البري | 5 أيام | مستعمرة مجهرية | 2.5 × 10 -1 |
| من النوع البري | 5 أيام | عادي | 4.1 × 10 -2 |
| Δpel | 3 يوم | مستعمرة مجهرية | 3.6 × 10 -2 |
| Δpel | 5 أيام | مستعمرة مجهرية | 3.6 × 10 -2 |
| Δpel | 5 أيام | عادي | 3.2 × 10 -2 |
| Δpsl | 3 يوم | عادي | 1.0 × 10 0 |
| Δpsl | 5 أيام | عادي | 1.0 × 10 0 |
| Δpsl | 5 أيام | مستعمرة مجهرية | 2.8 × 10 -1 |
الجدول 1: الإذعان زحف متوسط والدعاه ناشر المقدرة من النوع البري وسلالات متحولة وفقا للسن بيوفيلم والمنطقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microrheology هو أداة مفيدة لقياس الريولوجية المحلية في الأنظمة غير المتجانسة، مثل الأغشية الحيوية الميكروبية. وهو أسلوب غير مدمرة، مما يتيح رصد في الوقت الحقيقي من التغييرات الانسيابية داخل نفس العينة البيولوجية على نقاط زمنية متعددة. في هذا البروتوكول، تم تطبيق تتبع الجسيمات microrheology لعرض بيل والمسوخ exopolysaccharide البولندي من أجل التحقيق في الكيفية التي تؤثر على مرونة ويشابك الفعال لمصفوفة بيوفيلم. البولندي يفضل تطوير الأغشية الحيوية المرنة مع يشابك فعالية عالية، في حين عرض بيل تفضل اللزجة والأغشية الحيوية مرونة. عندما يتم إنتاجها على حد سواء exopolysaccharides، وmicrocolonies بيوفيلم يصبح crosslinked أقل فعالية مع نضوج بيوفيلم، بما يتفق مع انخفاض في قانون الأحوال الشخصية على عرض بيل.
الأغشية الحيوية التي شكلتها الأنواع البكتيرية المختلفة لها التراكيب EPS متميزة. العائد على السهم من مخاطي P. سلالات الزنجارية المستخدمة في هذه الدراسة أساسا consi القديسان من exopolysaccharides 16. الأنواع الأخرى قد تستخدم كبيرة البروتينات التصاق الخلية 17 و 18 DNA كما مكوناتها الرئيسية للEPS. ويمكن استخدام النهج المبين هنا لتحديد مساهمة الريولوجية من مكونات EPS الأخرى وتأثيرها على النمو. بالإضافة إلى ذلك، قد الأغشية الحيوية التي تزرع في الاجهزة المختلفة لديها مختلف جذريا الخصائص الفيزيائية التي تؤثر على الريولوجيا بهم. على سبيل المثال، مخاطي P. الزنجارية تستكمل مع الجلوكوز أشكال أكثر بيوفيلم مع هياكل متباينة للغاية في ظل تدفق بالمقارنة مع ظروف ثابتة. وقد أظهرت الدراسات أيضا أن الأغشية الحيوية تتعرض لإجهاد القص مثل تدفق يجعل الأغشية الحيوية أكثر تماسكا ومرونة 19،20. الخطوات الهامة والعوامل في الاعتبار لنجاح بيوفيلم دراسة microrheology الجسيمات تتبع هي كما يلي:
أبعاد نظام للتحقيق أو حجم الفائدة فيما يتعلق الزمان والمكان
محتوى "> وعند النظر في نطاقات مكانية، لا بد من النظر في حجم الهياكل التي تؤدي إلى الخصائص اللزجة من النظام (في حالتنا، والبوليمرات المصفوفة بيوفيلم) يجب. البوليمرات المحيطة الجسيمات التحقيق أن يكون أقل من ذلك بكثير في هيكل من الجسيمات وتقديم بيئة الخواص إلى الجسيمات. مطلوب عالية الدقة التصوير لالتقاط حركة الجسيمات الصغيرة أو الاهتزازات، ولكن سوف يقلل من مقدار المساحة تصوير لحجم ملف ما يعادلها. وعند النظر في جداول الزمنية، الأغشية الحيوية المرنة التي تظهر بطيئة ديناميكية تتطلب اتخاذ أشرطة الفيديو على جداول زمنية أطول (على سبيل المثال ساعة) وتستخدم انخفاض معدلات الإطار (على سبيل المثال دقيقة). يمكن أن تؤخذ الفيديو أقصر لالأغشية الحيوية اللزجة مع ديناميكية سريعة (دقيقة)، ولكنها تتطلب أعلى معدلات الإطار (ثانية أو millisec). عن طريق مناسبة القرار، معدل الإطار، مدة الفيديو لكل تجربة سيبقي ملف أحجام منخفضة لتحليل لين العريكة.بيوفيلم زوجة مطاطية، وقال انهterogeneity والأبعاد
قد تكون الجسيمات الحركة لا يمكن الكشف عنها في الأغشية الحيوية مرنة جدا (MSD <10 -4). في مثل هذه الحالات، وتقنيات microrheological النشطة التي تنطبق قوة لتهجير الجسيمات هي الأفضل. وينبغي بذل الريولوجية أخذ العينات من مناطق مختلفة من بيوفيلم لضمان القبض على التجانس الميكانيكي للبيوفيلم. التشكل غير متجانسة، لكن، ليست بالضرورة مؤشرا جيدا على عدم التجانس ميكانيكي، وعلى الرغم من المظاهر متجانسة بيوفيلم يمكن أن تكون معقدة في الريولوجيا: الأغشية الحيوية Δpsl هي أكثر تجانسا في التشكل وتأخر في التمايز، ولكن لديها الشخصي الانسيابية معقدة وغير متجانسة. في المقابل، الأغشية الحيوية Δpel لها مظهر غير متجانس مع microcolonies متباينة بشكل جيد ولكن الريولوجيا ثابتة طوال بيوفيلم. لالأغشية الحيوية ذات أبعاد مستعمرة مجهرية كبيرة (على سبيل المثال> 50 ميكرون في القطر والارتفاع)، قد يكون من الصورة ذات مغزىtudy الخلافات الانسيابية وفقا لارتفاع (أعلى وأسفل microcolonies)، أو المسافة من حافة مستعمرة مجهرية.
اختيار الجسيمات التحقيق
كما هو موضح أعلاه، يجب أن يكون حجم الجسيمات أكبر من الهياكل من المواد التي تؤدي إلى خصائصه اللزجة. بالإضافة إلى ذلك، قد الجسيمات مع الكيمياء السطحية مختلفة تؤدي في ملزمة لمختلف مكونات المناطق وEPS داخل بيوفيلم. وهكذا فإن آثار الجسيمات مع الكيمياء السطحية مختلفة ينبغي استكشافها حتى يمكن اعتبار أن عدم التجانس بيوفيلم. يجب أن يكون جميع الجزيئات التحقيق إمكانات زيتا عالية للحد من التكتل. الجزيئات التي تربط معا لا يمكن أن تستخدم تحقيقات دقيقة وينبغي استبعاد من التحليل.
التقليل من الانجراف
يمكن أن يكون سبب الانحراف في درجة الحرارة أو الضغط الجوي التغييرات، حركة المسرح المجهر (عادة في ض الاتجاه)، ومكافحة Vاختلال الجدول ibration والتدفق الداخلي داخل النظام. الانجرافات عادة ما يسفر فائقة حاجز للجسيمات α و> 1. إن α> 1 يشير إلى أن البعض من الطاقة الحرارية، والعمليات النشطة يشاركون الجسيمات تتحرك وmicrorheology السلبي ليس قابلا للتطبيق.
بيوفيلم السليم صيانة الثقافة
تدفق الخلايا يجب أن يتم تجميعها بشكل صحيح لمنع التسرب ويجب أن تبقى الأغشية الحيوية خالية من التلوث. ويمكن أيضا أن تنمو الأغشية الحيوية في الاجهزة الأخرى بديلا لخلية تدفق، مثل الشرائح وmicrowells لظروف زراعة ثابتة. وينبغي استخدام مجهر مقلوب لتصوير microwells.
باختصار، microrheology تتبع الجسيمات هو تقنية مفيدة يمكن توظيفها باستخدام المجاهر العادية إلى المختبر البيولوجي. بالإضافة إلى ذلك، البرامج الداخلة في احتساب وتحليل المشاكل العضلية الهيكلية الجسيمات هي متاحة بسهولة في المجال العام.على سبيل المثال، msdanalyzer وTrackArt 21 (http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart) هي البرامج التي يتم تشغيلها في بيئة ماتلاب. ومع ذلك، لأن هذه التقنية تعتمد فقط على الطاقة الحرارية لتحريك الجزيئات، فإنه غير قادر على حل بين عينات من مرونة أعلى. تقنيات النشطة، مثل نتف الريش المغناطيسي، وتطبيق القوة على الجسيمات للعمل على والتحرك داخل العينة، وسوف تكون قادرة على تحديد زوجة مطاطية العينات مرنة للغاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويدعم هذا البحث من قبل مؤسسة البحوث الوطنية ووزارة التربية والتعليم سنغافورة تحت مركز البحوث في برنامج التميز، والبدء المنح (M4330002.C70) من جامعة نانيانغ التكنولوجية، وAcRF المستوى (2 MOE2014-T2-2-172) من وزارة التربية والتعليم، سنغافورة. الكتاب أشكر جوي يام كيوك Hoong للمشاركة في مظاهرة من هذا البروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A.
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
