Bioengineering

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

כלי רכב המבוסס על ננו-חלקיקי משלוח הראו הבטחה גדולה עבור יישומי מיקוד תאיים, מתן מנגנון לשנות איתות תאית וביטוי גנים ספציפי. ניתן לטעון כלי רכב אלה עם סמים, חלבונים, וחומצות גרעין נועדו להשפיע תגובות הסלולר ולהשיג אפקט רצוי ברקמות יעד. סוגים רבים של nanocarriers נחקרו לתועלת טיפולית ואבחון כוללים שומנים, פולימרים, סיליקון, וחומרים מגנטיים. מערכות אלו הן אטרקטיביות בשל הפוטנציאל שלהם למשלוח סמים מקומיים, גדל ריכוז טיפולי ברקמות יעד, והפחתה של רעילות מערכתית.

חלקיקים מוצקים שומנים (SLNs) הם דוגמא למדה היטב של מערכת מסירת ננו-חלקיקים שנוצר ככלי להעברת תרופות מבטיח בשנים האחרונות. SLNs אפשר לנסח בקלות ליישומים רבים, כולל ¹ חישת ביו, קוסמטיקה ^2, ולאמשלוח herapeutic ^3-7. השירות שלהם נובע מהעובדה שהם מורכבים כולו משומני resorbable, רעילים, וכתוצאה מכך ההתאמה ביולוגית משופרת. במהלך סינתזה, ניתן לשלב תרופות lipophilic לכלי רכב בלוטת זקיף, ובכך להגדיל את מסיסות תרופה והתאמת לממשל parenteral. כלי רכב בלוטת זקיף גם לעזור לייצב תרופות כמוסות, הפחתת השפלה ואישורם, ולמקסם את הפעולה טיפולית. כלי רכב אלה הם גם מתאימים במיוחד למשחק ארוך, הכנות שחרור מבוקר בשל היציבות שלהם ^ב3,4,8,9 טמפרטורת גוף. חשוב לציין, אנקפסולציה של תרופות בחלקיקי שומנים משנה את פרופילי pharmacokinetic הפנימיים של מולקולות התרופה. זה מספק יתרון פוטנציאלי על ידי המאפשר שחרור המבוקר של תרופות עם מדד טיפולי צר. שיעור השחרור של תרופות-התאגד בלוטת זקיף יכול להיות מכוון המבוסס על קצב פירוק שומנים או שיעור דיפוזיה התרופה במטריצת שומנים.

SLNs לעתים קרובות מהונדס להצטבר ברקמות יעד ספציפיות. לדוגמא, בגודל שלהם (בדרך כלל יותר מ -10 ננומטר) מגביר שייר במחזור, שבו כלי הדם הדולפים של רקמת גידול מקל בתצהיר. בנוסף, המסלול של ממשל חלקיקים הוכח לשנות biodistribution עם הפוטנציאל למקד מבנים פיסיולוגיים ספציפיים כגון בלוטות לימפה ^10,11. על התצהיר ברקמות יעד, השיג אינטראקציות הסלולר מתאימות והפנמה סופית של חלקיקים הוא מאתגר בשל היכולת של קרום תא לשלוט באופן סלקטיבי את הזרימה של יונים ומולקולות לתוך ומחוץ לתא ^12. כדי להקל על ספיגה תאית, ניתן לשנות nanocarriers עם ligands הספציפי כוללים פפטידים, מולקולות קטנות, ונוגדנים חד-שבטיים ^13,14. מספר מנגנונים כוללים שתי חדירה פסיבית ותחבורה פעילה של חלקיקיםעל פני קרום התא תוארו בעבר ^3,12,15. באופן כללי, זה כבר הוכיח כי אינטראקציות תא-ננו-חלקיקים מושפעות ממאפייני physicochemical של חלקיקים כולל גודל, צורה, תשלום פני השטח וכימיה של פני השטח, בנוסף לפרמטרי תא ספציפי כגון סוג תא או שלב מחזור תא ^12.

חקירה קודמת הדגימה את הסינתזה של תת-10 SLNs ננומטר עבור יישומי זיהוי אקטואליים ¹⁶ וסמן ביולוגי ¹ בשיטת טמפרטורת היפוך השלב (PIT) ^17. זוהי שיטת סינתזה עדינה שבו ² הרכב נשאר קבוע בעוד הטמפרטורה משתנה בהדרגה. ערבוב רציף של הפתרון המחומם, כפי שהוא מתקרר לתוצאות RT בnanoemulsion. תוצאות תהליך זה בסינתזה של SLNs עם גודל חלקיקים קטן יותר ¹ מזה שדווחו בעבר תוך שימוש בשיטות שונות לסינתזה של השומנים נאןoparticles ^17-22. הגודל בקנה מידה וכתוצאה מכך, פחות מ -20 ננומטר, מספק יתרון עבור יישומי מיקוד תאיים בשל הגדלת שטח פנים ואת הפוטנציאל לאינטראקציות סלולריות משופרות.

סכמטי של SLNs, נועד לספק צבע ניאון או טיפולי, מוצג באיור 1. SLNs מורכב (למשל, האלקאן ליניארי) מאפשר שילוב של תרכובות lipophilic (למשל, צבעים או הרפוי) וחיצוני פעילי שטח פנים שומנים (פעילי שטח לדוגמא, ליניארי nonionic) מוקף במים. במחקר זה, SLNs היו עמוס בצבע ניאון ומשמש כמודל לחקור אינטראקציות חלקיקי תאים. fibroblasts העיקרי אדם עור ותאים דנדריטים עכבר נחשפו לצבוע טעונים בלוטת זקיף לאורך זמן כדי לאפיין אינטראקציות ביחס לרעילות וספיגת חלקיקים. Assay 3 רומיד -2,5-diphenylphenyltetrazolium (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) (MTT) היה utilized כדי להקים רמות מינון מתאימות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי וcytometry זרימה היו שתי שיטות מועסקות לבחון ספיגת חלקיקים במבחנה.

איור 1. סכמטי של בלוטת הזקיף מראה את המרכיבים העיקריים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עיבוד של SLNs

סינתזה של SLNs
הערה: השתמש בשיטת PIT ^1,17,20 להכין 20 תת-SLNs ננומטר ^1.
1. השתמש בטכניקה מזוהמת, bioreagents או ריאגנטים כיתה תרבית תאים, וחומרי סטרילי (כלומר, טפטפות, מריות, בקבוקונים, וכו ').
2. השתמש בארון בטיחות ביולוגית לסינתזה של SLNs (איור 2).
3. שלב 0.6 מ"ג של צבע פלואורסצנטי (הנילוס אדום (ניר), ריכוז הניר הוא כ 0.3 מ"ג / מיליליטר) ו0.10 גרם של Heneicosane (שומנים בדם, 5 WT% WT ריכוז שומנים בדם /) לתוך בקבוקון (15 מיליליטר), שיתוף להמס ב 90 מעלות צלזיוס, ומערבבים.
4. להוסיף polyoxyethylene 0.11 גר '(10) אתר oleyl (פעיל שטח, 5.5% WT ריכוז חומרים פעילי שטח WT /). שיתוף להמס את התערובת וכתוצאה מכך על 90 מעלות צלזיוס ומערבבים.
5. להוסיף 1.79 גרם של מים סטריליים לתערובת, החום עד 90 מעלות צלזיוס, ומערבבים עד שnanoemulsion שקוף נוצר.
  שים לב: תחת ערבוב המשיך וקירור מבוקר, SLNS נוצרים. תנאים אלה גורמים היפוך של תחליב מים בשמן לתחליב שמן ב-מים. מולקולות lipophilic כגון מחיצת NiR לטיפי שומנים.
6. הכן nanoemulsion במקביל מבלי להוסיף צבע הניאון, כדי לשמש דוגמא שליטה. שלב 0.10 גרם של Heneicosane ו0.11 polyoxyethylene גרם (10) אתר oleyl לתוך בקבוקון (15 מיליליטר) שיתוף להמיס על 90 מעלות צלזיוס, ומערבבים.
  1. להוסיף 1.79 גרם של מים סטריליים לתערובת, החום עד 90 מעלות צלזיוס, ומערבבים עד שnanoemulsion שקוף נוצר.
7. נוסף לעקר כל nanoemulsion באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר סטרילי.
איור 2. סכמטי של סינתזה של SLNs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
גודל חלקיקים ופולydispersity
1. השתמש בפיזור אור דינמי (DLS) כדי למדוד את גודל החלקיקים וpolydispersity של SLNs ¹ באמצעות קובט זכוכית וכלי שנועד למדוד את גודל חלקיקים.
2. לפני המדידות של הדגימות, למדוד את גודל החלקיקים של שני סטנדרטים ידועים הבאים הפרוטוקול של היצרן לעריכה ולמדידת הסטנדרטים.
3. מלא את קובט הזכוכית עם 1.5 מיליליטר של תמיסה סטנדרטית ולמדוד את הפתרון הסטנדרטי באמצעות אותם תנאי המדידה כדוגמאות.
  הערה: הצעד קודם חזר על עצמו עבור כל תקן.
4. מדוד את הדגימות כפי שהוכן. לכל אחד, להשתמש בפרמטרים של הניסוי הבא: זמן ריצה של 100 שניות, מקדם שבירה של מים (1.33), צמיגות של מים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס (1.002 שניות · MPA).
  הערה: טכניקה זו משתמשת בתדירות השתנתה אור כדי למדוד את הגודל של חלקיקים.
5. דווח הקוטר הממוצע של החלקיקים וpolydispersity של Partiהתפלגות גודל CLE.
נקודת התכה וכמוסה חום של התכה
1. השתמש בקלורימטר סריקת ההפרש (DSC) מצויד ברכב-סמפלר ומקור קירור חנקן נוזלי כדי לחקור את התנהגות התרמית של SLNs ^1.
2. פיפטה SLNs המוכן כמו למחבת אלומיניום 40 μl עם מסה של כ 25 מ"ג והרמטית לאטום את המחבת באמצעות עיתונות crimper אוניברסלית כדי להקטין את איבוד לחות במהלך סריקת DSC.
3. למדוד כל nanoemulsion 5-80 מעלות צלזיוס.
4. דווח על נקודת ההתכה והחום הכמוס של היתוך מעלילת DSC, שבו העמק מייצג את נקודת ההתכה ונפרדת מהשטח מתחת לעקומה בעלילת DSC מחולקת בכמות החומר מייצגים את החום הכמוס של היתוך.

אינטראקציה 2. SLNs עם fibroblasts ותאים דנדריטים

תרבות של fibroblasts האדם היסודי
1. fi האנושי ראשוני התרבותbroblasts לפי הוראות היצרן במדיום נוזלי לתרבות של fibroblasts אדם עורי (הבינוני 106), בתוספת ערכת תוספת צמיחה בסרום הנמוכה (LSGS). שמור על תאים באווירת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ותת-תרבות עם הגעת מפגש 80%.
2. עבור שני MTT וניתוח הדמיה, תאי זרע בצלחת 96-היטב, בצפיפות של 2 x 10 ⁴ תאים לכל גם, ולאפשר לאזן ב 37 CO ° / N לפני חשיפת בלוטת זקיף.
3. בזמן אפס, לדלל SLNs במדיום מלא כפי שצוין (איור 4), ביחס לריכוז שומנים בדם, ולהוסיף 10 μl לכל גם לכל לשכפל גם בצלחת 96-היטב.
4. שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, בתקופת הדגירה.
MTT הרעילות Assay
1. לאחר 24 שעות של דגירה עם SLNs, לקבוע כדאיות סלולרית באמצעות assay MTT, על פי הפרוטוקול של היצרן. </ Li>
2. לשטוף את תאי פעם אחת ולהוסיף בינוני טרי היטב כל אחד (100 μl / טוב). הרוג בארות שליטה על ידי דוגרים בפתרון מתנול 70% במשך 10 דקות לפני החלפה עם מדיום חדש.
3. להוסיף מגיב MTT (10 μl לכל גם) היטב בכל microplate דגירה O / N על 37 מעלות צלזיוס.
4. לאחר הדגירה O / N, solubilize גבישים תאיים formazin עם תמיסת הניקוי סיפקה (לכל גם 100 μl) על פי הפרוטוקול של היצרן.
5. לאחר 3 שעות של דגירה על RT, לקבל ערכי הספיגה באורך גל של 570 ננומטר מדידה באמצעות קורא microplate.
  מגיב MTT משמש צריך להיות פחות מ 1% (w / v) 3 (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2 ברומיד, 5-diphenyl-tetrazolium: הערה.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי
1. בנקודות זמן ספציפיות הבאות מינון של fibroblasts עם בלוטות זקיף, לשטוף את fibroblasts פעמיים עם תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) ולתקן במשך 10 דקות עם מתנול 70% קרים.
2. לאחר 10 דקות, להחליף את מתנול עם PBS וללכוד תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, באמצעות לעבור להקה (BP) 690/50 ננומטר מערכת סינון.
תרבות של תאי עכבר מח עצם דנדריטים
1. לגרום לתאי עצם עכבר נגזר מח הדנדריטים (BMDC) כפי שתוארו לעיל ^23,24. בקצרה, השעיות תא בודד צלחת של C57BL מח עצם / 10 ב 100 מ"מ צלחות פטרי ב 2 x 10 ⁶ / צלחת עם הגורם מגרה מושבה רקומביננטי עכברי granulocyte-מקרופאג (GM-CSF, 300 U / ml) ועכברי רקומביננטי IL-4 (ב תא גירוי גורם, 200 U / ml). שינוי תקשורת בכל 3 ימים.
2. ביום 7, להוסיף SLNs הטעון-ניר למאכלים בריכוז סופי של 0.5 ו 5.0 מיקרוגרם / מיליליטר שומנים בדם ולשמור על התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור לאורך הרצוי של חשיפה.
3. איסוף תאים מהמנות על ידי aspirating כל אמצעי התקשורת בצלחת, לגבות אותו בצינור 50 מיליליטר, ואחרי שטיפה יסודית של הצלחת (כדי לסלק את המודעה באופן רופףתאי Herent) עם 5 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS) המכיל 4 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA). אסוף את ההשעיה התא שהושגה באותו הצינור 50 מיליליטר.
הערכה של SLNs התאגדות באמצעות cytometry הזרימה
1. קבע את הריכוז של ההשעיה התא שהושגה בנקודת 2.4.3 ולהפיץ 3x10 ⁵ תאים לתחתית עגולה צינור FACS 12 מ"מ x 75 מ"מ.
2. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מיליליטר של PBS ולאחר מכן צנטריפוגה הצינורות במשך 5 דקות ב 400 XG, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. בטל supernatant ו resuspend גלולה עם של PBS / 2 / 0.1% אלבומין בסרום שור mM EDTA 100 μl (BSA) (חיץ מכתים) המכיל נוגדנים חד שבטיים נגד CD11c-FITC (סופי 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר). דגירה של 30 דקות על קרח בחושך.
4. לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של PBS ואז צנטריפוגות הצינורות במשך 5 דקות ב 400 XG, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. בטל supernatant ו resuspend כלגלולה עם 400 μl של חיץ מכתים. התאים מוכנים לרכישת הדגימות עם cytometer זרימה (אולי מצויד בלייזרים כחולים ואדום) עכשיו.
6. באמצעות cytometry זרימת תוכנת ניתוח, להעריך את רמת התאגדות של SLNs ידי DC על ידי gating על האוכלוסייה של CD11c תאים + (FITC חיובי) ולהשוות את עוצמת הקרינה הקשורים SLNs (נמדדה בערוצי PerCP-Cy5.5 או APC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת PIT שימשה לסנתז SLNs וטמפרטורת היפוך השלב נקבעה ניצול אמבט מים. הדגימות היו מחוממות לאט ובעדינות נסערת עד הפתרון הופיע ברור. טמפרטורת היפוך השלב לSLNs נעשה באמצעות השומנים heneicosane היא 45 מעלות צלזיוס. טבלת 1 מסכמת את גודל חלקיקים, polydispersity, נקודת התכה וחום כמוס של היתוך לSLNs. SLNs מסונתז באמצעות תנאי העיבוד שתוארו לעיל הביא SLNs השליטה וSLNs הטעון-ניר עם קוטר חלקיקים ממוצע של 18.59 ו16.87 ננומטר ועם polydispersity של 5.83 ו4.47, בהתאמה (איור 3). היציבות של פיזור SLNs הייתה פיקוח על ידי המדידה של גודל החלקיקים מעל 6 ימים בשתי טמפרטורות שונות אחסון (4 ו -23 מעלות צלזיוס). גודל החלקיקים לא ישתנה במשך 6 ימים (מידע לא מוצג).

התנהגות התרמית של SLNs הייתה investigated באמצעות סריקת calorimetry ההפרש. יש לי SLNs מסונתז נקודת התכה של 38.0 (± 0.4) ו36.8 (± 0.2) מעלות צלזיוס במשך SLNs השליטה וSLNs הטעון-ניר, בהתאמה. לעומת זאת, נקודת ההתכה לשומנים בדם בכמות גדולה היא 40.0 מעלות צלזיוס, המציין את הדיכוי של נקודת SLNs ביחס לשומנים בתפזורת ההיתוך. כצפוי, הריתוק לממדים קטנים ויחס אזור בנפח גבוה משטח לדכא את נקודת התכת ¹ ננו-חלקיקים. יתר על כן, החום הכמוס של היתוך לSLNs השליטה וSLNs הטעון-ניר הוא 5.1 (± 0.2), ו4.0 (± 0.1) J / g, בהתאמה. תוצאות אלו מצביעות על כך שרמת crystallinity של SLNs מושפעת מהמטען, שבו נטען SLNs-ניר הראה crystallinity נמוך בהשוואה לSLNs השליטה.

איור 3
התפלגות גודל חלקיקים 3. דמותו שלnanoemulsions הטיפוסי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לִטעוֹם	גודל חלקיקים (ננומטר)	Polydispersity	נקודת התכה (מעלות צלזיוס)	חום כמוס של היתוך (J / g)
SLNs (בקרה)	18.59	5.83	38.0 ± 0.4	5.1 ± 0.2
הניר-SLNs	16.87	4.47	36.8 ± 0.2	4.0 ± 0.1

סיכום טבלה 1. התכונות הפיסיקליות והתנהגות תרמית של SLNs השליטה וSLNs הטעון-ניר כולל גודל חלקיקים, polydispersity, נקודת התכה וחום כמוס של הַתָכָה.

כדי לחקור את האינטראקציות של חלקיקים ודגמים סלולריים, מגבלות המינון של בלוטת הזקיף מיושמות באופן ישיר לתאים ראשוניים בתרבות, הוקמו ראשון. באמצעות assay MTT, השפעת המנה-תגובה על חילוף חומרים תאיים נמדדה, שבו ריכוז חלקיקים גובר הביא לירידה בכדאיות סלולרית (ביחס לתאי קבוצת הביקורת). לא היה הבדל שנצפה ברעילות בין התאים שנחשפו לבלוטת הזקיף לבד מול בלוטות זקיף טעונים-ניר במינונים שנקבעו מראש אלה. במקביל, תאים נבדקו מבחינה ויזואלית לדבקות בקלקר תרבית הרקמה ותמונות נלקחו להפגין שתי מורפולוגיה הנציג סלולרית ואת הספיגה של חלקיקי ניאון לאורך זמן (איור 5). שימוש במינון שווה לשומנים בדם / מיליליטר 5 מיקרוגרם (כ -80% כדאיות סלולרית) ספיגת חלקיקים נצפתה בדואר חשיפה 2 שעות.

י"ש ">

הכדאיות 4. איור של fibroblasts עורי האנושי הראשוני לאחר דגירה 24 שעות עם חלקיקים. הכדאיות נמדדה באמצעות assay MTT, והנתונים מייצגים תאי קיימא אחוזים ביחס לבקרות שלא טופלו. ריכוזים מייצגים שומנים משקל / נפח. הנתונים משקפים לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים, שבוצעו בשלושה עותקים. ברים שגיאה מצביעים סטיית ההתקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. fibroblasts עורי האנושי יסודי לאחר () 2 ודגירת 24 שעות עם חלקיקים טעונים-ניר. ריכוז Nanoparticle שווה 5 מיקרוגרם / מיליליטר שומנים בדם (B).תמונות נציג של לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים, שבוצעו בשני עותקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בהתבסס על התוצאות של מחקרי הגבלת המינון, המתאם בין המינון של SLNs ורמת התאגדות בBMDC עכברי נחקר. תאים אלה נחשבים נרחב ביותר במודל חוץ גופית של תת מרובים DC הקיים in vivo ולאפשר לחקירות רמת מחקר בסיסיות של שני תופעות תאיות ומולקולריות של מניפולציות שנועדו. BMDC היה מטופל או חשוף O / N לאו 0.5 או 5.0 מיקרוגרם / מיליליטר של שומנים SLNs הטעון-ניר (בדומה לפיברובלסטים אנושיים, שימוש של 50 מיקרוגרם / מיליליטר שומנים בדם הביא תאי קיימא פחות מ -10%) ורמת התאגדות ננו-חלקיקים שנקבעה על ידי מדידת עוצמת הקרינה הניר בBMDCs באמצעות cytometry זרימה. קור ישירויסות בין הריכוז של SLNs משמש ואת כמות הקרינה שהוערכה בBMDCs נצפה (איור 6 א). ניתוח הקינטית של התאגדות SLNs טעונה-ניר גילה ספיגה מהירה מאוד על ידי BMDC. אות ניאון בלוטת הזקיף הייתה כבר ברורה אחרי שעה 1 של חשיפה, ואילו plateauing בסביבות 5 שעות של חשיפה (איור 6).

איור 6
איור התאגדות 6. בלוטת זקיף על ידי תאים דנדריטים בקורלציה עם ריכוז של חשיפה. (א) בתאים שמקורם במח עצם Murine הדנדריטים (BMDC) נחשפו O / N לניר-SLNs, בריכוז של שומנים בדם הצביע, ורמת התאגדות העריכה באמצעות cytometry זרימה. כל שכבות היסטוגרמה הם מגודרת על CD11c + האוכלוסייה. (ב) קינטי התאגדות בלוטת זקיף על ידי BMDC. תאים נחשפו לניר-SLNs (5מיקרוגרם / מיליליטר) לזמן המצוין ורמת הקרינה (על CD11c + תאים מגודרות) הוערך על ידי cytometry זרימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, הסינתזה של SLNs ותחולתם ליישומי מיקוד תאיים נחקרו. חלקיקים ביולוגית אלה הראו הבטחה ככלי רכב משלוח עבור יישומים רבים, כולל משלוח סמים, השתקת גנים, וטכנולוגיות חיסון ^25-30. SLNs קטן במיוחד היו מסונתז באמצעות תהליך קליל, ויחסי הגומלין שלהם עם תאי עור עיקריים ותאים חיסוניים ראשוניים נחקרו. SLNs נועד כוללת אנקפסולציה של צבע פלואורסצנטי (ניר), ששימש כמטען טיפולי מודל.

שיטת PIT הועסקה לסנתז בלוטות זקיף ואת המאפיינים וכתוצאה מכך חלקיקים (גודל חלקיקים, polydispersity, נקודת התכה, וסמוי חום של היתוך) הוערכו באמצעות פיזור אור דינאמי וסריקת calorimetry ההפרש. גודל חלקיקים וניתוח polydispersity חשפו את הסינתזה של SLNs קטן במיוחד עם polydispersity הצר, אידיאלי למטרה תאיתיישומי ing. כפי שדווח בעבר, גודל חלקיקים יכול לשחק תפקיד חשוב באינטראקציות הסלולר ^12. הגודל של חלקיקים הוכח להיות השפעה דרמטית, המשפיע על יעילות ספיגה, בחירת מסלול הפנמה, לוקליזציה תאית, ורעיל ^12. חלק מהמגמות הכללית ביחס לאינטראקציות תא-ננו-חלקיקים מתועדים בספרות כולל: גודל קריטי יכול להשתנות עם מאפייני סוג התא ופני שטח של חלקיקים, ויש לי חלקיקים קטנים הסתברות גבוהה יותר ליופנם על ידי פסיבי עד-לקחת יותר גדולים אלה ¹² . ניתוח תרמי של החלקיקים במחקר זה גילה רמת crystallinity (כלומר, חום כמוס של היתוך) בין SLNs השליטה ואלה עמוסים בצבע NiR שונה. Crystallinity של SLNs ירד בשל התוספת של צבע הניאון, אשר משמש כטומאה. Crystallinity של מערכת המסירה הטיפולית הוכח bדואר גורם חשוב שמשפיע על המשלוח והמנה ^31. ירידה בcrystallinity של רכב בלוטת הזקיף יכולה להשפיע פרמטרים כגון קיבולת טעינה טיפולית וקינטיקה שחרור תרופת ^31. שיטת PIT היא טכניקה עדינה יותר סינתזה בהשוואה לשיטות אחרות, עם ההגבלה שרק תרופות lipophilic ניתן לשלב חלקיקים. למרות מגבלה זו, SLNs מסונתז בשיטה זו היא ביולוגית מאוד, מה שהופך את פלטפורמת אספקה לאחר מכן מתאימה ליישומים רבים במחקר ביו-רפואי.

ההשפעות של אינטראקציה בלוטת זקיף על כדאיות פיברובלסטים עור אנושית נותחו באמצעות assay MTT. ירידה תלויה-מינון בכדאיות נצפתה עם עלייה בריכוזים של בלוטות זקיף. במהלך סינתזת בלוטת זקיף, חלקיקי השומנים הם התייצבו בשכבה פעילי שטח. כגודל החלקיקים יורד, מגדיל את פני שטח, כפי שעושה את הפוטנציאל לאינטראקציות פני תא ולא חשיפה סלולריתo השכבה פעילי השטח, שעלול לפגוע בקרום תא. ניסויים אלה אפשרו לקביעת ריכוז המינון שבו ספיגה תאית של חלקיקים יכולה להיבחן תוך הימנעות מירידה משמעותית בכדאיויות תא בשל שיבוש קרום. ניתוח MTT הוא טכניקה כמותית שיכול להיות מיושמת באופן נרחב להבנת בריאות סלולרית. במקביל, תאים נבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להמחיש את הקרינה של צבע ניאון מטען, ניר. שימוש בטכניקה זו, ספיגת חלקיקים נצפתה רק לאחר 2 שעות של דגירה עם fibroblasts אדם. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספק מידע איכותי הקשורים למורפולוגיה ומאפיינים סלולריים. יש להקפיד להימנע מהכתמת רקע מוגזמת והדמיה של חפצים. בנוסף, כמודלים של עכברים הם בדרך כלל הבחירה הראשונה לעומק סלולארי וחקירות מולקולריות, נתחנו את יחסי הגומלין בין SLNs ותאים עכברי. בפרט, גדולעניין טמון בשימוש בננו-חלקיקים לשחרור סלקטיבי ומבוקר של תרופות שהיו לשנות את ההתנהגות של המערכת החיסונית. כתוצאה מכך, cytometry זרימה הועסק למדוד את הספיגה של חלקיקים על ידי תאי דנדריטים עכבר. נתונים אלה אישרו כי תאי phagocytic כמו תאים דנדריטים יכולים לסבול טווח דומה של ריכוז SLNs (עם כדאיות מופחתת שנצפתה ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר שומנים בדם כמו עם fibroblasts עורי האנושי) ורמת התאגדות ישירות בקורלציה עם הריכוז של חשיפת בלוטת זקיף. יתר על כן, DC חשף התאגדות מהירה מאוד של SLNs, המצביע על כך אוכלוסייה זו עשויה לייצג יעד בעל ערך באמצעות משלוח סמים בתיווך בלוטת זקיף.

מחקר זה כולל תיאור של שיטה לסינתזה של אוכלוסיות קטנות במיוחד של חלקיקים ביולוגית, כמו גם כמה במבחנה שיטות שבאמצעותו להעריך האינטראקציות הסלולריות שלהם. במחקרים עתידיים, מבחני נוספיםיכול להיות מועסק כדי להמשיך ולאפיין אינטראקציות חלקיקי התאים וסופו של דבר להנחות את הפיתוח המוצלח של nanocarriers הטיפולי. אלה יכולים לכלול לימודים של קינטיקה שחרור תרופה, ניתוח של כמיהות סלולריות, מדידה של רמות ציטוקינים פרו-דלקתיים, וניתוח של שינויי transcriptomic סלולריים לאורך זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).