Bioengineering

ठोस लिपिड नैनोकणों (SLNs) Intracellular लक्ष्य निर्धारण के लिए एप्लीकेशन

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Nanoparticle आधारित वितरण वाहनों विशेष सेलुलर संकेत और जीन अभिव्यक्ति को बदलने के लिए एक तंत्र प्रदान करने, इंट्रासेल्युलर को लक्षित अनुप्रयोगों के लिए महान वादा दिखाया है। इन वाहनों को दवाओं, प्रोटीन, और सेलुलर प्रतिक्रियाओं के प्रभाव और लक्ष्य ऊतकों में एक वांछित प्रभाव को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया न्यूक्लिक एसिड के साथ लोड किया जा सकता है। Nanocarriers से कई प्रकार के लिपिड, पॉलिमर, सिलिकॉन, और चुंबकीय सामग्री सहित चिकित्सीय और नैदानिक लाभ के लिए पता लगाया गया है। इन पद्धतियों के कारण चिकित्सीय लक्ष्य ऊतकों में एकाग्रता, और प्रणालीगत विषाक्तता की कमी वृद्धि हुई स्थानीयकृत दवा वितरण के लिए अपनी क्षमता, के लिए आकर्षक हैं।

ठोस लिपिड नैनोकणों (SLNs) हाल के वर्षों में एक होनहार दवा वितरण वाहन के रूप में उभरा है कि एक nanoparticle वितरण प्रणाली की एक अच्छी तरह से अध्ययन उदाहरण हैं। SLNs आसानी से जैव संवेदन ^1, सौंदर्य प्रसाधन ^2, और टी सहित कई अनुप्रयोगों के लिए तैयार किया जा सकताherapeutic वितरण ^3-7। उनकी उपयोगिता वे बढ़ाया biocompatibility, जिसके परिणामस्वरूप resorbable nontoxic, लिपिड की पूरी तरह से शामिल कर रहे हैं कि इस तथ्य से उपजा है। संश्लेषण के दौरान, lipophilic दवाओं जिससे parenteral प्रशासन के लिए दवा घुलनशीलता और उपयुक्तता बढ़ रही है, SLN वाहनों में शामिल किया जा सकता है। SLN वाहनों को भी उनके गिरावट और निकासी को कम करने, और उपचारात्मक कार्रवाई को अधिकतम समझाया चिकित्सा विज्ञान को स्थिर करने में मदद करते हैं। इन वाहनों की वजह से शरीर का तापमान ^3,4,8,9 पर उनकी स्थिरता के लिए विशेष रूप से लंबे समय तक अभिनय, नियंत्रित रिहाई की तैयारी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। महत्वपूर्ण बात है, लिपिड नैनोकणों में दवाओं के encapsulation दवा अणुओं की आंतरिक फ़ार्माकोकायनेटिक प्रोफाइल बदल। यह एक संकीर्ण चिकित्सीय सूचकांक के साथ दवाओं की नियंत्रित रिहाई की अनुमति देकर एक संभावित लाभ प्रदान करता है। SLN-निगमित चिकित्सा विज्ञान की रिहाई की दर देखते लिपिड गिरावट की दर या में नशीली दवाओं के प्रसार दर के आधार पर की जा सकती हैलिपिड मैट्रिक्स।

SLNs अक्सर विशिष्ट लक्ष्य ऊतकों में जमा करने के लिए इंजीनियर हैं। उदाहरण के लिए, उनके आकार (आमतौर पर अधिक से अधिक 10 एनएम) ट्यूमर के ऊतक के टपकाया वाहिका बयान की सुविधा जहां परिसंचरण में प्रतिधारण potentiates। इसके अलावा, कण प्रशासन के मार्ग में इस तरह के लिम्फ नोड्स ^10,11 के रूप में विशिष्ट शारीरिक संरचनाओं को निशाना बनाने की क्षमता के साथ biodistribution को बदलने के लिए दिखाया गया है। लक्ष्य ऊतकों में बयान, उचित सेलुलर बातचीत को प्राप्त करने और नैनोकणों के अंतिम internalization पर कारण चुनिंदा में और सेल ¹² में से आयनों और अणुओं के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए कोशिका झिल्ली की क्षमता को चुनौती दे रहा है। सेलुलर तेज की सुविधा के लिए, यह पेप्टाइड्स, छोटे अणुओं, और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी ^13,14 सहित विशिष्ट ligands के साथ nanocarriers को संशोधित करने के लिए संभव है। निष्क्रिय पैठ और नैनोकणों के सक्रिय परिवहन सहित दोनों कई तंत्रकोशिका झिल्ली भर पहले से ^3,12,15 वर्णित किया गया है। सामान्य में, यह सेल-nanoparticle बातचीत इस तरह के सेल प्रकार या सेल चक्र चरण ¹² के रूप में सेल-विशिष्ट मानदंडों के अलावा, आकार, आकृति, सतह के प्रभारी और सतह के रसायन शास्त्र सहित नैनोकणों के भौतिक गुणों से प्रभावित हैं कि प्रदर्शन किया गया है।

पिछले एक जांच चरण उलटा तापमान (गड्ढे) विधि ¹⁷ का उपयोग कर ¹⁶ सामयिक और बायोमार्कर आवेदनों का पता लगाने के लिए ¹ उप-10 एनएम SLNs के संश्लेषण का प्रदर्शन किया। इस तापमान धीरे-धीरे बदल रहा है, जबकि रचना निरंतर बनी हुई है, जहां ² एक सज्जन संश्लेषण विधि है। गरम कर समाधान का निरंतर क्रियाशीलता, के रूप में यह एक nanoemulsion में आरटी परिणाम के लिए ठंडा। उस से भी छोटे कण आकार ¹ के साथ SLNs के संश्लेषण में इस प्रक्रिया के परिणाम पहले से लिपिड नेन के संश्लेषण के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग कर सूचना दीoparticles ^17-22। जिसके परिणामस्वरूप आकार पैमाने पर, कम से कम 20 एनएम, वृद्धि की वजह से सतह क्षेत्र और बढ़ाया सेलुलर बातचीत के लिए क्षमता के लिए इंट्रासेल्युलर लक्ष्यीकरण अनुप्रयोगों के लिए एक लाभ प्रदान करता है।

एक फ्लोरोसेंट रंजक या चिकित्सीय देने के लिए बनाया SLNs का एक योजनाबद्ध, चित्र 1 में दिखाया गया है। SLNs एक लिपिड आंतरिक (जैसे, रैखिक एल्केन) lipophilic यौगिकों (जैसे, रंग या चिकित्सा विज्ञान) के समावेश के लिए अनुमति देता है और एक surfactant बाहरी से मिलकर बनता है पानी से घिरा हुआ है (जैसे, रैखिक nonionic पृष्ठसक्रियकारक)। इस अध्ययन में, SLNs एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ भरी हुई थी और कण-सेल बातचीत की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया। प्राथमिक मानव त्वचीय fibroblasts और माउस वृक्ष के समान कोशिकाओं विषाक्तता और कण तेज करने के लिए सम्मान के साथ बातचीत को चिह्नित करने के क्रम में समय के साथ SLN से भरी हुई डाई करने के लिए अवगत कराया गया। एक 3 (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenylphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) परख utili थाउचित खुराक के स्तर को स्थापित करने के क्रम में जेड। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry इन विट्रो में कण तेज की जांच करने के लिए कार्यरत दो तरीकों थे।

चित्र 1
प्रमुख घटक दिखा SLN की चित्रा 1. योजनाबद्ध। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

SLNs 1. प्रसंस्करण

SLNs के संश्लेषण
नोट: उप-20 एनएम SLNs ¹ तैयार करने के लिए गड्ढे विधि ^1,17,20 का प्रयोग करें।
1. सड़न रोकनेवाला तकनीक, bioreagents या सेल संस्कृति ग्रेड अभिकर्मकों, और बाँझ सामग्री (यानी, पिपेट, spatulas, शीशियों, आदि) का उपयोग करें।
2. SLNs के संश्लेषण (चित्रा 2) के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट का प्रयोग करें।
3. फ्लोरोसेंट रंजक के 0.6 मिलीग्राम मिश्रण है और एक शीशी (15 एमएल) में Heneicosane (लिपिड, 5 भार / भार% लिपिड एकाग्रता) की 0.10 ग्राम, सह पिघल (नील लाल (निर), निर एकाग्रता लगभग 0.3 मिलीग्राम / एमएल है) 90 डिग्री सेल्सियस, और हलचल।
4. 0.11 छ polyoxyethylene (10) oleyl ईथर (Surfactant, 5.5 भार / भार% पृष्ठसक्रियकारक एकाग्रता) जोड़ें। 90 डिग्री सेल्सियस और हलचल में जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण सह पिघला।
5. 90 डिग्री सेल्सियस के मिश्रण, गर्मी बाँझ पानी की 1.79 ग्राम जोड़ें, और एक पारदर्शी nanoemulsion बनाई है जब तक हलचल।
  नोट: जारी रखा सरगर्मी और नियंत्रित ठंडा, एसएल तहतएनएस बनाई गई हैं। इन शर्तों में एक तेल-इन-पानी पायस करने के लिए पानी में तेल पायस का एक उलटा कारण। ऐसे लिपिड बूंदों को निर विभाजन के रूप में lipophilic अणुओं।
6. एक नियंत्रण नमूना के रूप में सेवा करने के क्रम में, फ्लोरोसेंट रंजक जोड़ने के बिना समानांतर में एक nanoemulsion तैयार करें। 90 डिग्री सेल्सियस, और हलचल में एक शीशी (15 एमएल) के सह-पिघल में Heneicosane की 0.10 ग्राम और 0.11 ग्राम polyoxyethylene (10) oleyl ईथर का मिश्रण।
  1. 90 डिग्री सेल्सियस के मिश्रण, गर्मी बाँझ पानी की 1.79 ग्राम जोड़ें, और एक पारदर्शी nanoemulsion बनाई है जब तक हलचल।
7. इसके अलावा एक बाँझ 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर प्रत्येक nanoemulsion बाँझ।
चित्रा SLNs के संश्लेषण के 2. योजनाबद्ध। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
कण आकार और पोलydispersity
1. कण आकार और polydispersity एक गिलास क्युवेट का उपयोग कर SLNs ¹ की और कण आकार को मापने के लिए बनाया गया एक साधन मापने के लिए गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) का प्रयोग करें।
2. नमूने का माप करने से पहले, मानकों की तैयारी और माप के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद दो ज्ञात मानकों के कण आकार को मापने।
3. मानक समाधान के 1.5 मिलीलीटर के साथ कांच क्युवेट भरें और नमूने के रूप में एक ही माप की स्थिति का उपयोग कर मानक समाधान के उपाय।
  नोट: पिछले चरण प्रत्येक मानक के लिए दोहराया गया था।
4. तैयार के रूप में नमूने के उपाय। प्रत्येक के लिए, निम्न प्रयोगात्मक मापदंडों का उपयोग करें: 100 सेकंड, पानी का अपवर्तनांक (1.33), पानी की चिपचिपाहट के एक रन के समय 20 डिग्री सेल्सियस (1.002 एमपीए · सेकंड) पर।
  नोट: इस तकनीक आवृत्ति नैनोकणों के आकार को मापने के लिए प्रकाश स्थानांतरित कर दिया उपयोग करता है।
5. गड्ड की औसत कण व्यास और polydispersity रिपोर्टCLE आकार के वितरण।
गलनांक और पिघलने की अव्यक्त गर्मी
1. SLNs ¹ की तापीय व्यवहार की जांच करने के लिए एक ऑटो पारखी और तरल नाइट्रोजन ठंडा स्रोत से लैस एक अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर (डीएससी) का प्रयोग करें।
2. लगभग 25 मिलीग्राम की एक जन के साथ एक 40 μl एल्यूमीनियम पैन में के रूप में तैयार SLNs पिपेट और भली भांति बंद करके डीएससी स्कैन के दौरान नमी नुकसान को कम करने के लिए एक सार्वभौमिक crimper प्रेस का उपयोग पैन सील।
3. 5 से 80 डिग्री सेल्सियस से प्रत्येक nanoemulsion उपाय।
4. गलनांक और घाटी गलनांक और सामग्री की मात्रा के आधार पर विभाजित डीएससी साजिश में वक्र के तहत क्षेत्र का अभिन्न का प्रतिनिधित्व करता है, जहां डीएससी साजिश से पिघलने की अव्यक्त गर्मी पिघलने की अव्यक्त गर्मी का प्रतिनिधित्व करता है रिपोर्ट।

Fibroblasts और वृक्ष के समान कोशिकाओं के साथ 2. SLNs इंटरेक्शन

प्राथमिक मानव fibroblasts की संस्कृति
1. संस्कृति प्राथमिक मानव फाईbroblasts कम सीरम विकास पूरक (LSGS) किट के साथ पूरक (106 मध्यम) मानव त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट, की संस्कृति के लिए तरल माध्यम में निर्माता के निर्देशों के अनुसार। 80% संगम पर पहुंचने पर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ ₂ और उपसंस्कृति पर एक humidified वातावरण में कोशिकाओं को बनाए रखें।
2. MTT और इमेजिंग अच्छी तरह से प्रति 2 एक्स 10 ⁴ कोशिकाओं के घनत्व पर विश्लेषण, एक 96 अच्छी तरह से थाली में बीज कोशिकाओं, और 37 डिग्री सीओ / एन से पहले SLN जोखिम को कम से संतुलित करने की अनुमति देने के लिए दोनों के लिए।
3. लिपिड एकाग्रता के लिए सम्मान के साथ, चित्रा (4) संकेत है, और प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से प्रति 10 μl जोड़ने के रूप में समय शून्य पर, पूरा मध्यम में SLNs पतला 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से पेश करता है।
4. ऊष्मायन अवधि के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ ₂ में कोशिकाओं को बनाए रखें।
MTT विषाक्तता परख
1. SLNs साथ ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, MTT परख का उपयोग कर सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण। </ Li>
2. एक बार कोशिकाओं को धो लें और प्रत्येक अच्छी तरह से (100 μl / अच्छी तरह से) के लिए ताजा मध्यम जोड़ने। ताजा माध्यम के साथ जगह से पहले 10 मिनट के लिए एक 70% मेथनॉल समाधान में incubating द्वारा नियंत्रण कुओं को मार डालो।
3. Microplate के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए MTT अभिकर्मक (अच्छी तरह से प्रति 10 μl) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
4. हे / एन ऊष्मायन के बाद, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदान डिटर्जेंट समाधान के साथ इंट्रासेल्युलर formazin क्रिस्टल (अच्छी तरह से प्रति 100 μl) solubilize।
5. आरटी पर ऊष्मायन के 3 घंटे के बाद, एक microplate रीडर का उपयोग कर 570 एनएम की एक माप तरंग दैर्ध्य में absorbance के मूल्यों प्राप्त करते हैं।
  नोट: 3- (4,5-dimethylthiazolyl -2) -2, 5-diphenyl-tetrazolium ब्रोमाइड (v / डब्ल्यू) 1% से कम होना चाहिए इस्तेमाल किया MTT अभिकर्मक।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
1. SLN साथ fibroblasts की खुराक निम्नलिखित विशिष्ट समय बिंदुओं पर, बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार fibroblasts धोने और ठंड में 70% मेथनॉल के साथ 10 मिनट के लिए तय कर लो।
2. 10 मिनट के बादएक बैंड पास (बीपी) 690/50 एनएम फिल्टर सेट का उपयोग कर, एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग पीबीएस और कब्जा छवियों के साथ मेथनॉल जगह।
माउस अस्थि मज्जा वृक्ष के समान कोशिकाओं की संस्कृति
1. प्रेरित माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (BMDC) के रूप में पहले से ^23,24 का वर्णन किया। संक्षेप में, पुनः संयोजक murine granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ, 300 यू / एमएल) और पुनः संयोजक murine आईएल -4 के साथ 2 एक्स 10 ⁶ / प्लेट पर 100 मिमी पेट्री डिश में C57BL / 10 अस्थि मज्जा की थाली एकल कक्ष निलंबन (बी सेल कारक, 200 यू / एमएल उत्तेजक)। हर 3 दिन मीडिया बदलें।
2. 7 दिन, एक 37 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं 0.5 और 5.0 माइक्रोग्राम / एमएल लिपिड की एक अंतिम एकाग्रता में व्यंजन को निर-लोडेड SLNs जोड़ सकते हैं और बनाए रखने के लिए, जोखिम के वांछित लंबाई के लिए 5% सीओ ₂ इनक्यूबेटर।
3. थाली की पूरी तरह से धोने के द्वारा पीछा किया, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में यह संग्रह, थाली में सभी मीडिया aspirating द्वारा व्यंजन से कोशिकाओं को इकट्ठा (शिथिल विज्ञापन को बेदखल करने के लिए4 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर (पीबीएस) के साथ Herent कोशिकाओं)। वही 50 मिलीलीटर ट्यूब में प्राप्त सेल निलंबन लीजिए।
फ्लो के माध्यम से SLNs निगमन का आकलन
1. बिंदु 2.4.3 में प्राप्त सेल निलंबन की एकाग्रता का निर्धारण और एक 12 मिमी x 75 मिमी दौर नीचे FACS ट्यूब में 3x10 ⁵ कोशिकाओं वितरित।
2. पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ने और फिर 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर, 400 XG पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों centrifuging द्वारा कोशिकाओं को धो लें।
3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और विरोधी CD11c-FITC मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (0.25 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम) युक्त पीबीएस / 2 मिमी EDTA / 0.1% गोजातीय सीरम albumin के 100 μl (बीएसए) (धुंधला बफर) के साथ गोली resuspend। अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
4. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर, 400 XG पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और प्रत्येक resuspendधुंधला बफर के 400 μl के साथ गोली। कोशिकाओं को अब एक प्रवाह कोशिकामापी (संभवतः नीले और लाल लेसरों से लैस) के साथ नमूने के अधिग्रहण के लिए तैयार हैं।
6. विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry का उपयोग, CD11c + कोशिकाओं (FITC सकारात्मक) की आबादी पर gating और (PerCP-Cy5.5 या एपीसी चैनलों में मापा) SLNs जुड़े प्रतिदीप्ति की तीव्रता की तुलना द्वारा डीसी द्वारा SLNs के समावेश के स्तर का आकलन।

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Representative Results

गड्ढे विधि SLNs के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था और चरण उलटा तापमान एक नहाने के पानी का उपयोग निर्धारित किया गया था। नमूने धीरे-धीरे गर्म है और समाधान स्पष्ट दिखाई दिया जब तक धीरे उत्तेजित थे। heneicosane लिपिड का उपयोग किया SLNs के लिए चरण उलटा तापमान 45 डिग्री सेल्सियस। तालिका 1 कण आकार, polydispersity, गलनांक और SLNs के लिए पिघलने की अव्यक्त गर्मी का सार। ऊपर वर्णित प्रसंस्करण की स्थिति का उपयोग कर संश्लेषित SLNs 18.59 और 16.87 एनएम के एक औसत कण व्यास के साथ और 5.83 और 4.47 की एक polydispersity क्रमशः (चित्रा 3) के साथ नियंत्रण SLNs और निर-लोडेड SLNs में हुई। SLNs फैलाव की स्थिरता को दो अलग-अलग भंडारण तापमान (4 और 23 डिग्री सेल्सियस) पर 6 दिनों में कण आकार के माप से नजर रखी थी। कण आकार 6 दिनों में परिवर्तन नहीं किया (डेटा) नहीं दिखाया।

SLNs की तापीय व्यवहार investig थाअंतर स्कैनिंग उष्मामिति का उपयोग कर पैदा। संश्लेषित SLNs क्रमश: नियंत्रण SLNs और निर-लोडेड SLNs के लिए डिग्री सेल्सियस 38.0 (0.4 ±) और (0.2 ±) 36.8 के एक पिघल बिंदु है। इसके विपरीत, थोक लिपिड के लिए गलनांक थोक लिपिड को SLNs रिश्तेदार के पिघलने बिंदु के दमन का संकेत है, 40.0 डिग्री सेल्सियस है। जैसी कि उम्मीद थी, छोटे आयामों और उच्च सतह क्षेत्र करने वाली मात्रा के अनुपात में कारावास nanoparticle गलनांक ¹ दबाना। इसके अलावा, नियंत्रण SLNs और निर-लोडेड SLNs के लिए पिघलने की अव्यक्त गर्मी क्रमशः (0.1 ±) (0.2 ±) 5.1, और 4.0 जम्मू / छ, है। इन परिणामों के SLNs की स्फटिकता के स्तर निर-लोडेड SLNs नियंत्रण SLNs के साथ तुलना में एक कम स्फटिकता दिखाया जहां पेलोड से प्रभावित होता है कि संकेत मिलता है।

चित्र तीन
चित्रा 3. कण आकार के वितरणठेठ nanoemulsions। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना	कण आकार (एनएम)	Polydispersity	गलनांक (डिग्री सेल्सियस)	पिघलती की अव्यक्त गर्मी (जम्मू / छ)
SLNs (नियंत्रण)	18.59	5.83	38.0 ± 0.4	5.1 ± 0.2
निर-SLNs	16.87	4.47	36.8 ± 0.2	4.0 ± 0.1

भौतिक गुणों और कण आकार, polydispersity, गलनांक और की अव्यक्त गर्मी सहित नियंत्रण SLNs और निर-लोडेड SLNs की तापीय व्यवहार की तालिका 1. सारांश पिघलने।

कणों और सेलुलर मॉडल की बातचीत का पता लगाने के क्रम में, SLN की खुराक सीमाओं के रूप में सीधे संस्कृति में प्राथमिक कोशिकाओं को लागू किया है, पहले स्थापित किए गए थे। बढ़ रही है कण एकाग्रता (अनुपचारित नियंत्रण कक्षों के संबंध में) सेलुलर व्यवहार्यता में कमी के परिणामस्वरूप जहां एक MTT परख का उपयोग करना, सेलुलर चयापचय पर खुराक प्रतिक्रिया प्रभाव, मापा गया था। इन पूर्व निर्धारित मात्रा में निर-लोडेड SLN बनाम अकेले SLN के संपर्क में कोशिकाओं के बीच विषाक्तता में कोई मनाया अंतर नहीं था। समानांतर में, कोशिकाओं नेत्रहीन टिशू कल्चर पॉलीस्टीरिन के पालन के लिए जांच की गई और छवियों प्रतिनिधि सेलुलर आकृति विज्ञान और समय के साथ फ्लोरोसेंट कणों की तेज (चित्रा 5) दोनों को प्रदर्शित करने के लिए ले जाया गया। 5 माइक्रोग्राम / एमएल लिपिड के बराबर एक खुराक का उपयोग (लगभग 80% सेलुलर व्यवहार्यता) कण तेज 2 घंटे बाद जोखिम से मनाया गया।

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नैनोकणों के साथ 24 घंटा ऊष्मायन के बाद प्राथमिक मानव त्वचीय fibroblasts की चित्रा 4. व्यवहार्यता। व्यवहार्यता एक MTT परख का उपयोग करके मापा गया था, और डेटा अनुपचारित नियंत्रण के संबंध में प्रतिशत व्यवहार्य कोशिकाओं प्रतिनिधित्व करते हैं। सांद्रता वजन / मात्रा लिपिड प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा तीन प्रतियों में प्रदर्शन में कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों को दर्शाते हैं। त्रुटि सलाखों मतलब की मानक त्रुटि संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा (ए) 2 और (बी) निर-लोडेड नैनोकणों के साथ 24 घंटा ऊष्मायन। Nanoparticle एकाग्रता 5 माइक्रोग्राम / एमएल लिपिड के बराबर है के बाद 5. प्राथमिक मानव त्वचीय fibroblasts।छवियाँ दो प्रतियों में प्रदर्शन में कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

खुराक सीमा के अध्ययन के परिणामों के आधार पर, SLNs की खुराक और murine BMDC में समावेश के स्तर के बीच संबंध की जांच की थी। इन कोशिकाओं को व्यापक रूप से विवो में मौजूदा एकाधिक डीसी सबसेट के इन विट्रो मॉडल में सबसे अच्छा माना जाता है और इरादा जोड़तोड़ की दोनों सेलुलर और आणविक प्रभाव के बुनियादी अनुसंधान के स्तर की जांच के लिए अनुमति देते हैं। BMDC अनुपचारित छोड़ दिया है या अवगत कराया गया हे / एन या तो 0.5 या 5.0 माइक्रोग्राम / एमएल निर-लोडेड SLNs के लिपिड (इसी प्रकार मानव fibroblast करने के लिए, 50 ग्राम / एमएल लिपिड का उपयोग कम से कम 10% व्यवहार्य कोशिकाओं में हुई) और के स्तर पर nanoparticle समावेश फ्लो के माध्यम से BMDCs में निर प्रतिदीप्ति की तीव्रता को मापने के द्वारा निर्धारित की। एक सीधा Correइस्तेमाल किया SLNs की एकाग्रता और मनाया गया BMDCs में मूल्यांकन प्रतिदीप्ति की राशि (चित्रा 6A) के बीच आबादी। निर-लोडेड SLNs समावेश की गतिज के विश्लेषण से BMDC द्वारा एक बहुत ही तेजी से तेज का पता चला। जोखिम के चारों ओर 5H (चित्रा 6B) पर plateauing जबकि SLN फ्लोरोसेंट संकेत, जोखिम के एक घंटे के बाद पहले से ही स्पष्ट हो गया था।

वृक्ष के समान कोशिकाओं द्वारा चित्रा 6 SLN समावेश जोखिम की एकाग्रता के साथ संबद्ध है। (ए) murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (BMDC) हे अवगत कराया गया / एन निर-SLNs करने के लिए, लिपिड की एकाग्रता में संकेत दिया है, और समावेश के स्तर का मूल्यांकन फ्लो के माध्यम से। हिस्टोग्राम ओवरले सब। CD11c + आबादी पर गेटेड BMDC द्वारा SLN समावेश (बी) काइनेटिक कर रहे हैं। प्रकोष्ठों 5 निर-SLNs (से अवगत कराया गयामाइक्रोग्राम / एमएल) के संकेत समय और gated CD11c + कोशिकाओं पर प्रतिदीप्ति का स्तर (के लिए) प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में, SLNs के संश्लेषण और intracellular को निशाना बनाने के लिए आवेदन पत्र उनकी प्रयोज्यता पता लगाया गया। ये biocompatible नैनोकणों दवा वितरण, जीन मुंह बंद करने, और टीका प्रौद्योगिकियों ^25-30 सहित कई अनुप्रयोगों के लिए वितरण वाहनों के रूप में वादा दिखाया है। अल्ट्रा छोटे SLNs एक सतही प्रक्रिया का उपयोग कर संश्लेषित किया गया है, और प्राथमिक त्वचा कोशिकाओं और प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत का पता लगाया गया था। SLNs एक मॉडल चिकित्सकीय माल के रूप में कार्य करता है जो एक फ्लोरोसेंट डाई (निर), के encapsulation शामिल करने के लिए डिजाइन किए गए थे।

गड्ढे विधि SLN और जिसके परिणामस्वरूप कण गुण (पिघलने के कण आकार, polydispersity, गलनांक, और अव्यक्त गर्मी) गतिशील प्रकाश बिखरने और अंतर स्कैनिंग उष्मामिति का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था के संश्लेषण के लिए नियुक्त किया गया था। इंट्रासेल्युलर लक्ष्य के लिए कण आकार और polydispersity विश्लेषण संकीर्ण polydispersity साथ अल्ट्रा छोटे SLNs के संश्लेषण का पता चला, आदर्शआईएनजी अनुप्रयोगों। जैसा कि पहले बताया, कण आकार सेलुलर बातचीत ¹² पर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। नैनोकणों के आकार तेज दक्षता, internalization मार्ग चयन, intracellular स्थानीयकरण, और cytotoxicity ¹² को प्रभावित करने, एक नाटकीय प्रभाव है दिखाया गया है। साहित्य में प्रलेखित सेल nanoparticle बातचीत करने के लिए सम्मान के साथ समग्र प्रवृत्तियों में से कुछ में शामिल हैं: महत्वपूर्ण आकार नैनोकणों सेल प्रकार और सतह के गुणों के साथ भिन्न हो सकते हैं, और छोटे नैनोकणों उच्च संभावना है से भली भाँति करने के लिए बड़े लोगों को ¹² से भी ऊपर ले निष्क्रिय । इस अध्ययन में कणों की थर्मल विश्लेषण नियंत्रण SLNs और निर डाई के साथ भरी हुई है उन लोगों के बीच स्फटिकता (पिघलने की यानी, अव्यक्त गर्मी) का एक अलग स्तर का पता चला। SLNs की स्फटिकता एक अशुद्धता के रूप में कार्य करता है जो फ्लोरोसेंट रंजक, के अलावा की वजह से कमी आई। चिकित्सकीय वितरण प्रणाली की स्फटिकता ख के लिए दिखाया गया हैवितरण को प्रभावित करता है कि एक महत्वपूर्ण कारक ई और ³¹ खुराक। SLN वाहन की स्फटिकता में कमी ऐसी चिकित्सकीय लदान क्षमता और दवा रिलीज कैनेटीक्स ³¹ के रूप में मानकों को प्रभावित कर सकते हैं। गड्ढे विधि केवल lipophilic दवाओं कणों में शामिल किया जा सकता है कि सीमा के साथ अन्य तरीकों के साथ तुलना में एक अधिक कोमल संश्लेषण तकनीक है। इस सीमा के बावजूद, इस विधि का उपयोग कर संश्लेषित SLNs जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में कई अनुप्रयोगों के लिए तो उपयुक्त वितरण मंच है, जिससे अत्यधिक biocompatible रहे हैं।

मानव त्वचीय fibroblast व्यवहार्यता पर SLN बातचीत का प्रभाव एक MTT परख का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। व्यवहार्यता में एक खुराक पर निर्भर कमी SLN की सांद्रता में वृद्धि के साथ मनाया गया। SLN संश्लेषण के दौरान, लिपिड कणों एक surfactant परत के साथ स्थिर हो रहे हैं। कण आकार कम हो जाती है के रूप में, सतह क्षेत्र बढ़ जाती है, कोशिका की सतह बातचीत और सेलुलर जोखिम टी के लिए संभावित रूप में करता हैकोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकता है जो पृष्ठसक्रियकारक परत, ओ। इन प्रयोगों के कारण झिल्ली विघटन करने के लिए सेल व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण कमी से परहेज करते हुए कणों के सेलुलर तेज मनाया जा सकता है, जिस पर खुराक एकाग्रता के निर्धारण की अनुमति दी। MTT विश्लेषण मोटे तौर पर सेलुलर स्वास्थ्य को समझने के लिए लागू किया जा सकता है कि एक मात्रात्मक तकनीक है। समानांतर में, कोशिकाओं माल फ्लोरोसेंट रंजक, निर के प्रतिदीप्ति कल्पना करने के क्रम में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जांच की गई। इस तकनीक का उपयोग, कण तेज मानव fibroblasts के साथ ऊष्मायन के केवल 2 घंटे के बाद मनाया गया। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेलुलर आकृति विज्ञान और विशेषताओं से संबंधित गुणात्मक जानकारी प्रदान करता है। देखभाल अत्यधिक पृष्ठभूमि धुंधला और कलाकृतियों के इमेजिंग से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। इसके अलावा, के रूप में माउस मॉडल आम तौर पर सेलुलर गहराई और आणविक जांच में, हम SLNs और murine कोशिकाओं के बीच बातचीत का विश्लेषण के लिए पहली पसंद हैं। विशेष रूप से, एक महानब्याज प्रतिरक्षा प्रणाली के व्यवहार को संशोधित होता है कि दवाओं के चुनिंदा और नियंत्रित रिहाई के लिए नैनोकणों के उपयोग में निहित है। नतीजतन, cytometry माउस वृक्ष के समान कोशिकाओं द्वारा कणों के तेज को मापने के लिए नियुक्त किया गया था प्रवाह। ये आंकड़े (कम व्यवहार्यता मानव त्वचीय fibroblasts के साथ के रूप में 50 माइक्रोग्राम / एमएल लिपिड पर मनाया के साथ) और समावेश के स्तर पर सीधे SLN जोखिम की एकाग्रता के साथ संबद्ध वृक्ष के समान कोशिकाओं की तरह phagocytic कोशिकाओं SLNs एकाग्रता की एक समान सीमा बर्दाश्त कर सकते हैं कि पुष्टि की। इसके अलावा, डीसी इस आबादी SLN की मध्यस्थता दवा वितरण के माध्यम से एक मूल्यवान लक्ष्य प्रतिनिधित्व हो सकता है, सुझाव है कि SLNs का एक बहुत ही तेजी से समावेश का पता चला।

इस अध्ययन biocompatible नैनोकणों अल्ट्रा छोटे आबादी के संश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन है, साथ ही उनके सेलुलर बातचीत का आकलन करने के लिए है जिसके द्वारा कई इन विट्रो तरीके शामिल हैं। भविष्य के अध्ययनों में, अतिरिक्त assaysआगे चिकित्सीय nanocarriers के सफल विकास के कण-सेल बातचीत विशेषताएँ और अंततः मार्गदर्शन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। ये दवा रिलीज कैनेटीक्स, सेलुलर tropism, समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन स्तर की माप, और समय के साथ सेलुलर transcriptomic परिवर्तन के विश्लेषण के विश्लेषण के अध्ययन में शामिल कर सकता है।

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

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