Bioengineering

Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Véhicules de livraison à base de nanoparticules ont montré de grandes promesses pour les applications ciblage intracellulaire, fournissant un mécanisme de modifier spécifiquement la signalisation cellulaire et l'expression des gènes. Ces véhicules peuvent être chargés avec des médicaments, des protéines et des acides nucléiques destinés à influer sur les réponses cellulaires et obtenir un effet souhaité dans les tissus cibles. De nombreux types de nanocarriers ont été explorées pour un bénéfice thérapeutique et de diagnostic, y compris les lipides, les polymères, le silicium, et les matières magnétiques. Ces systèmes sont attrayants en raison de leur potentiel pour la livraison localisée de médicaments, augmentation de la concentration thérapeutique dans les tissus cibles, et la réduction de la toxicité systémique.

Nanoparticules lipidiques solides (SLN) en sont un exemple bien étudié d'un système de livraison de nanoparticules qui a émergé comme un véhicule de livraison de médicament prometteur au cours des dernières années. SLN peuvent être facilement formulés pour de multiples applications, y compris la bio-détection ^1, cosmétiques ^2, et tlivraison herapeutic ^3-7. Leur utilité réside dans le fait qu'ils sont constitués exclusivement d'résorbables, des lipides non toxiques, ce qui entraîne une meilleure biocompatibilité. Au cours de la synthèse, les médicaments lipophiles peuvent être incorporées dans des véhicules SLN, ce qui augmente la solubilité du médicament et de l'aptitude à l'administration parentérale. SLN véhicules contribuent également à stabiliser thérapeutiques encapsulés, la réduction de leur dégradation et de dégagement, et de maximiser l'action thérapeutique. Ces véhicules sont particulièrement bien adaptés pour longue durée d'action, à libération contrôlée de préparations en raison de leur stabilité à ^3,4,8,9 de la température du corps. Fait important, l'encapsulation de médicaments dans des nanoparticules lipidiques modifie les profils pharmacocinétiques intrinsèques des molécules de médicament. Ceci permet d'obtenir un avantage potentiel en permettant la libération contrôlée de médicaments ayant un indice thérapeutique étroit. Le taux de la thérapeutique de la SLN incorporée libération peut être réglé en fonction du taux de dégradation des lipides ou de la vitesse de diffusion de la drogue dans lematrice lipidique.

SLN sont souvent conçus pour accumuler dans les tissus cibles spécifiques. Par exemple, leur taille (typiquement supérieure à 10 nm) potentialise la rétention dans la circulation, où le système vasculaire qui fuit de tissu tumoral facilite le dépôt. En outre, la voie d'administration de particules a été montré pour modifier la biodistribution avec le potentiel de cibler des structures physiologiques spécifiques tels que les ganglions lymphatiques ^10,11. Après dépôt dans les tissus cibles, la réalisation des interactions cellulaires appropriées et internalisation éventuelle des nanoparticules est difficile en raison de la capacité de la membrane cellulaire pour commander sélectivement le flux d'ions et de molécules dans et hors de la cellule ^12. Afin de faciliter l'absorption cellulaire, il est possible de modifier nanocarriers avec des ligands spécifiques, y compris des peptides, des petites molécules et des anticorps monoclonaux, ^13,14. Plusieurs mécanismes, y compris à la fois la pénétration passive et le transport actif de nanoparticulesà travers la membrane cellulaire ont été précédemment décrite ^3,12,15. En général, il a été démontré que les interactions cellule-nanoparticules sont influencées par les propriétés physico-chimiques des nanoparticules, y compris la taille, la forme, la charge de surface et de chimie de surface, en plus des paramètres spécifiques de cellules telles que le type de cellule ou cellule phase du cycle ^12.

Une enquête précédente a démontré la synthèse de sous-SLN 10 nm pour les topiques ^{16 et} biomarqueurs applications de détection ¹ selon la méthode ¹⁷ température d'inversion de phase (PIT). Ceci est un procédé de synthèse doux ² où la composition reste constante tandis que la température est progressivement modifiée. Sous agitation continue de la solution chauffée, lors de son refroidissement à RT résultats dans une nanoémulsion. Ce procédé conduit à la synthèse de la SLN de plus petite taille de particule de ¹ que précédemment rapporté en utilisant divers procédés pour la synthèse de lipides nanoparticles ^17-22. L'échelle de taille résultante, inférieure à 20 nm, fournit un avantage pour les applications de ciblage intracellulaire due à l'augmentation de la surface et le potentiel d'interactions cellulaires améliorées.

Un schéma de SLN, conçu pour fournir un colorant fluorescent ou thérapeutique, est représenté sur la Figure 1. Les SLN sont constitués d'un intérieur (par exemple alcane linéaire) qui permet l'incorporation de composés lipophiles (par exemple, des colorants ou des agents thérapeutiques) et un extérieur de tensioactif lipidique (tensioactif non ionique, par exemple, linéaire) entourée par l'eau. Dans cette étude, SLN ont été chargées avec un colorant fluorescent et utilisées comme modèle pour étudier les interactions de particules cellulaires. Fibroblastes dermiques humains primaires et les cellules dendritiques de souris ont été exposées à colorant chargé SLN au fil du temps afin de caractériser les interactions par rapport à la toxicité et l'absorption de particules. Un dosage 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-de diphenylphenyltetrazolium (MTT) est utilized afin d'établir les niveaux de dosage appropriées. La microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux, deux méthodes employées pour étudier l'absorption de particules in vitro.

Figure 1. Schéma de la SLN montrant les principaux constituants. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Traitement des SLN

Synthèse de SLN
Remarque: Utilisez la méthode PIT ^1,17,20 pour préparer les sous-SLN ¹ 20 nm.
1. Utiliser une technique aseptique, bioréactifs ou culture cellulaire réactifs de qualité, et les matériaux stériles (ie, pipettes, spatules, flacons, etc.).
2. Utilisez une armoire de biosécurité pour la synthèse de SLN (Figure 2).
3. Moissonneuse 0,6 mg de colorant fluorescent (rouge Nil (NIR), la concentration NiR est d'environ 0,3 mg / ml) et 0,10 g de heneicosane (lipides, 5% poids / poids concentration des lipides) dans un flacon (15 ml), co-fusion à 90 ° C, et remuer.
4. Ajouter 0,11 g de polyoxyéthylène (10) oléyl éther (tensioactif, 5,5% poids / poids tensioactif concentration). Co-fondre le mélange obtenu à 90 ° C et remuer.
5. Ajouter 1,79 g d'eau stérile pour le mélange, la chaleur à 90 ° C, et remuer jusqu'à une nanoémulsion transparente est formé.
  Remarque: Sous agitation continue et refroidissement contrôlé, SLNs sont créés. Ces conditions provoquent une inversion de l'émulsion eau-dans-huile à une émulsion huile-dans-eau. Les molécules lipophiles telles que la partition NiR aux gouttelettes lipidiques.
6. Préparer une nanoémulsion en parallèle sans addition du colorant fluorescent, afin de servir comme un échantillon de contrôle. Mélanger 0,10 g de heneicosane et 0,11 g de polyoxyéthylène (10) oléyléther dans un flacon (15 ml) co-fusion à 90 ° C, et remuer.
  1. Ajouter 1,79 g d'eau stérile pour le mélange, la chaleur à 90 ° C, et remuer jusqu'à une nanoémulsion transparente est formé.
7. Stériliser plus, chaque nanoémulsion l'aide d'un filtre de 0,2 um stérile.
Figure 2. Schéma de synthèse de SLN. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Taille des particules et Polydispersity
1. Utilisez diffusion de lumière dynamique (DLS) pour mesurer la taille des particules et la polydispersité des SLN ¹ en utilisant une cuvette de verre et un instrument conçu pour mesurer la taille des particules.
2. Avant les mesures des échantillons, mesurer les tailles de particules de deux normes connues suivant le protocole du fabricant pour la préparation des normes et de la mesure.
3. Remplir la cuve en verre avec 1,5 ml de la solution étalon et de mesurer la solution standard en utilisant les mêmes conditions de mesure que les échantillons.
  Remarque: l'étape précédente a été répétée pour chaque norme.
4. Mesurer les échantillons tel que préparé. Pour chacun, utiliser les paramètres expérimentaux suivants: un temps de fonctionnement de 100 s, indice de réfraction de l'eau (1.33), la viscosité de l'eau à 20 ° C (1.002 mPa.s).
  Remarque: Cette technique utilise une fréquence décalée lumière pour mesurer la taille des nanoparticules.
5. Signaler le diamètre de particule moyen et la polydispersité de partidistribution de taille de cle.
Point de fusion et la chaleur latente de fusion
1. Utiliser un calorimètre à balayage différentiel (DSC) équipé d'un auto-échantillonneur et la source de refroidissement à l'azote liquide à étudier le comportement thermique de ¹ SLN.
2. Introduire à la pipette les SLN comme préparés dans une casserole en aluminium de 40 pi avec une masse d'environ 25 mg et fermer hermétiquement la casserole à l'aide d'une presse à sertir universelle pour minimiser la perte d'humidité lors de l'analyse de DSC.
3. Mesurer chaque nanoémulsion de 5 à 80 ° C.
4. Déclarez le point de fusion et la chaleur latente de fusion de la parcelle de DSC, où la vallée représente le point de fusion et de l'intégrale de l'aire sous la courbe dans la parcelle de DSC divisée par la quantité de matière représente la chaleur latente de fusion.

2. SLN Interaction avec fibroblastes et les cellules dendritiques

Culture de fibroblastes humains primaires
1. Culture fi humaine primairefibroblastes selon les instructions du fabricant en milieu liquide pour la culture de fibroblastes dermiques humains (moyenne 106), complétés avec le kit supplément faible croissance de sérum (LSGS). Maintenir les cellules dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C, 5% CO ₂ et de sous-culture après avoir atteint 80% de confluence.
2. Pour les deux MTT et l'analyse de l'imagerie, les cellules de semences dans une plaque à 96 puits, à une densité de 2 x 10 ⁴ cellules par puits, et ramener à 37 ° CO / N avant l'exposition SLN.
3. Au temps zéro, diluer SLN dans un milieu complet comme indiqué (Figure 4), par rapport à la concentration de lipides, et ajouter 10 ul par puits à chaque répliquer bien dans la plaque de 96 puits.
4. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5% CO _2, au cours de la période d'incubation.
MTT Essai de toxicité
1. Après 24 h d'incubation avec SLN, déterminer la viabilité cellulaire en utilisant le test MTT, selon le protocole du fabricant. </ li>
2. Laver les cellules une fois et ajouter du milieu frais à chaque puits (100 pl / puits). Tuer puits témoins par incubation dans une solution de methanol à 70% pendant 10 min avant de le remplacer par du milieu frais.
3. Ajouter le réactif MTT (10 pi par puits) à chaque puits de la microplaque et incuber O / N à 37 ° C.
4. Après O / N incubation, solubiliser cristaux de formazin intracellulaires avec la solution de détergent fourni (100 pi par puits) selon le protocole du fabricant.
5. Après 3 h d'incubation à TA, obtenir des valeurs d'absorbance à une longueur d'onde de mesure de 570 nm en utilisant un lecteur de microplaque.
  Réactif MTT utilisée doit être inférieure à 1% (p / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, le bromure de 5-diphényl-tétrazolium: Remarque.
Microscopie à fluorescence
1. A des moments spécifiques suivants dosage des fibroblastes avec la SLN, laver les fibroblastes deux fois avec un tampon phosphate salin stérile (PBS), et fixer pendant 10 min avec 70% de méthanol froid.
2. Après 10 min, Remplacer le méthanol avec du PBS et de capturer des images à l'aide d'un microscope inversé, en utilisant un passe-bande (BP) 690/50 nm de jeu de filtres.
Culture de cellules dendritiques de moelle osseuse de souris
1. Induire osseuse de souris des cellules dendritiques dérivées de moelle (BMDC) tels que décrits précédemment ^23,24. Brièvement, suspensions plaque monocellulaires de C57BL / 10 moelle osseuse à 100 mm boîtes de Petri à 2 x 10 ⁶ / plaque avec murin facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages recombinant (GM-CSF, 300 U / ml) et murine IL-4 recombinante (cellules B facteur de stimulation, 200 U / ml). Changer de support tous les 3 jours.
2. Au jour 7, ajouter SLN NIR chargés aux plats à une concentration finale de 0,5 et 5,0 ug / ml de lipide et de maintenir les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur pendant toute la durée de l'exposition désiré.
3. Recueillir des cellules de la vaisselle en aspirant tous les médias de la plaque, en la recueillant dans un tube de 50 ml, suivi par un lavage soigneux de la plaque (pour déloger annonce lâcheHerent cellules) avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 4 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Recueillir la suspension cellulaire obtenue dans le même tube de 50 ml.
Évaluation de la SLN Incorporation par cytométrie en flux
1. Déterminer la concentration de la suspension cellulaire obtenue au point 2.4.3 et distribuer 3x10 ⁵ cellules dans un 12 mm x 75 mm à fond rond FACS tube.
2. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS, puis centrifuger les tubes pendant 5 min à 400 x g, à une température de 4 ° C.
3. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot avec 100 ul d'EDTA / 0,1% d'albumine de sérum bovin PBS / 2 (BSA) (tampon de coloration) contenant des anticorps anti-CD11c monoclonal FITC (0,25 ug / ml final). Incuber pendant 30 min sur de la glace dans l'obscurité.
4. Laver les cellules avec 1 ml de PBS, puis centrifuger les tubes pendant 5 min à 400 x g, à une température de 4 ° C.
5. Jeter le surnageant et remettre chaqueun culot avec 400 ul de tampon de coloration. Les cellules sont maintenant prêts pour l'acquisition des échantillons avec un cytomètre de flux (peut-être équipé avec des lasers bleus et rouges).
6. Utilisation de la cytométrie de flux logiciel d'analyse, d'évaluer le niveau d'incorporation de SLN par DC par gating sur la population de CD11c + cellules (FITC positif) et en comparant l'intensité de la SLN-associés fluorescence (mesurée dans les canaux PerCP-Cy5.5 ou APC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La méthode de PIT a été utilisé pour synthétiser les SLN et la température d'inversion de phase a été déterminée en utilisant un bain d'eau. Les échantillons ont été chauffés lentement et doucement agitée jusqu'à ce que la solution est apparue clairement. La température d'inversion de phase pour les SLN faites en utilisant des lipides heneicosane est de 45 ° C. Le tableau 1 résume la taille des particules, polydispersité, point de fusion et la chaleur latente de la fonte pour les SLN. Les SLN synthétisés en utilisant les conditions de traitement décrites ci-dessus ont donné lieu à SLN SLN de commande et NIR chargées avec un diamètre moyen de 18,59 et 16,87 nm et des particules avec une polydispersité de 5,83 et 4,47, respectivement (figure 3). La stabilité de la dispersion SLN a été surveillée par la mesure de la taille des particules de plus de 6 jours à deux températures de stockage différentes (4 et 23 ° C). La taille des particules n'a pas changé au cours de 6 jours (données non présentées).

Le comportement thermique des SLN a été InvestigATED utilisant calorimétrie différentielle à balayage. Les SLN synthétisés ont un point de 38,0 (± 0,4) et 36,8 (± 0,2) fusion ° C pour les SLN de contrôle et SLN NiR-chargés, respectivement. En revanche, le point de fusion de la masse lipidique est 40,0 ° C, ce qui indique la suppression de la pointe de la SLN par rapport au lipide en vrac de fusion. Comme prévu, le confinement de petites dimensions et haute rapport surface-volume abaisser le point de fusion nanoparticule ^1. En outre, la chaleur latente de fusion pour les SLN de contrôle et SLN NiR-chargés est de 5,1 (± 0,2) et 4,0 (± 0,1) J / g, respectivement. Ces résultats indiquent que le taux de cristallinité des SLN est affectée par la charge utile, où les SLN NIR chargés ont montré un taux de cristallinité inférieur en comparaison avec les témoins SLN.

Figure 3. Répartition granulométrique denanoémulsions typiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Échantillon	Taille des particules (nm)	Polydispersité	Point de fusion (° C)	Chaleur latente de fusion (J / g)
SLN (Control)	18.59	5.83	38,0 ± 0,4	5,1 ± 0,2
Nir-SLN	16,87	4.47	36,8 ± 0,2	4,0 ± 0,1

Tableau 1. Résumé des propriétés physiques et le comportement thermique des SLN de contrôle et SLN NiR-chargés, y compris la taille des particules, polydispersité, point de fusion et la chaleur latente de fusion.

Afin d'explorer les interactions de particules et de modèles cellulaires, les limites de dose de la SLN comme étant directement appliqué à des cellules primaires en culture, ont d'abord été établis. En utilisant un dosage MTT, l'effet dose-réponse sur le métabolisme cellulaire a été mesurée, où la concentration en particules de plus en plus a entraîné une diminution de la viabilité cellulaire (par rapport aux cellules témoins non traitées). Il n'y avait pas de différence observée de toxicité entre les cellules exposées à la SLN seule versus SLN NiR chargé à ces doses pré-déterminés. En parallèle, les cellules sont examinées visuellement pour l'adhésion à la culture de tissus en polystyrène et des images ont été prises pour démontrer à la fois la morphologie cellulaire et représentant l'absorption de particules fluorescentes dans le temps (figure 5). Utilisation d'une dose égale à 5 ug / ml de lipide (cellulaire d'environ 80% viabilité) l'absorption des particules a été observé par post-exposition de deux heures.

ys ">

Figure 4. Viabilité des fibroblastes primaires dermiques humains après 24 h d'incubation avec des nanoparticules. La viabilité a été mesurée en utilisant un test MTT, et les données représentent cellules viables pour cent par rapport aux témoins non traités. Les concentrations représentent poids / volume lipidique. Les données reflètent au moins trois expériences indépendantes, effectuées en triple. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Les fibroblastes dermiques humains primaires après (A) et 2 (B) 24 heures d'incubation avec les nanoparticules chargées NIR. Concentration des nanoparticules est égale à 5 ug / ml de lipide.Les images sont représentatives d'au moins trois expériences indépendantes, effectuées en double. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Basé sur les résultats des études de limitation de dose, la corrélation entre la dose de SLN et le niveau d'incorporation dans murin BMDC a été étudiée. Ces cellules sont largement considérés comme les meilleurs dans le modèle in vitro de plusieurs sous-ensembles existants DC in vivo et permettent base des enquêtes de niveau de recherche des deux effets cellulaires et moléculaires de manipulations destinées. BMDC ont été laissées non traitées ou exposée O / N à 0,5 ou 5,0 ug / lipide ml des SLN NiR-chargés (similaire à fibroblaste humain, l'utilisation de 50 ug / lipide ml a donné lieu à des cellules viables inférieure à 10%) et le niveau de nanoparticule incorporation déterminée en mesurant l'intensité de fluorescence dans BMDCs NiR par cytométrie de flux. Un Corre directelation entre la concentration de SLN utilisés et la quantité de fluorescence évalués BMDCs a été observée (figure 6A). Une analyse de la cinétique des NiR chargé SLN incorporation révélé une absorption très rapide par BMDC. Le signal fluorescent SLN était déjà évident après 1 heure d'exposition, tout en atteignant un plateau à environ 5h de l'exposition (figure 6B).

Figure 6. SLN incorporation par les cellules dendritiques en corrélation avec la concentration de l'exposition. (A) os murin des cellules dendritiques dérivées de la moelle (BMDC) ont été exposés O / N pour NiR-SLN, à la concentration de lipides indiqué, et le taux d'incorporation évalué par cytométrie de flux. Superpositions de l'histogramme sont tous déclenchés sur le CD11c + population. (B) cinétique de l'incorporation par BMDC SLN. Les cellules ont été exposées à NiR-SLN (5ug / ml) pendant le temps indiqué et le niveau de fluorescence (sur CD11c fermée + cellules) a été évaluée par cytométrie de flux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans cette étude, la synthèse de la SLN et de leur applicabilité pour les applications ciblage intracellulaire ont été explorées. Ces nanoparticules biocompatibles ont montré des résultats prometteurs en tant que véhicules de livraison pour de multiples applications, y compris l'administration de médicaments, le silençage génique, et technologies vaccinales ^25-30. Ultra-petits SLN ont été synthétisés en utilisant un processus facile, et leurs interactions avec les cellules de la peau et des cellules immunitaires primaires primaires ont été explorées. SLN ont été conçus pour inclure encapsulation d'un colorant fluorescent (NIR), qui a servi de modèle thérapeutique cargaison.

La méthode de PIT a été utilisé pour synthétiser SLN et les propriétés résultant de particules (taille des particules, polydispersité, point de fusion, et de la chaleur latente de fusion) ont été évaluées en utilisant la diffusion dynamique de la lumière et de calorimétrie différentielle à balayage. La taille des particules et de polydispersité analyse ont révélé la synthèse de l'ultra-petites SLN avec une polydispersité étroite, idéal pour cible intracellulaireapplications ING. Comme indiqué précédemment, la taille des particules peut jouer un rôle important sur les interactions cellulaires ^12. La taille des nanoparticules a été montré pour avoir un effet dramatique, influençant l'efficacité d'absorption, choix de la voie d'internalisation, la localisation intracellulaire et la cytotoxicité ^12. Certaines des tendances générales en matière d'interactions cellule-nanoparticules documentés dans la littérature comprennent: taille critique peut varier selon le type de cellule et les propriétés de surface des nanoparticules, et de petites nanoparticules ont une probabilité plus élevée d'être internalisés par passive jusqu'à-prendre que les grands ¹² . L'analyse thermique des particules dans cette étude a révélé un taux de cristallinité (par exemple, de la chaleur latente de fusion) entre les SLN de contrôle et celles chargées de NiR colorant différent. La cristallinité des SLN a diminué en raison de l'addition du colorant fluorescent, qui agit comme une impureté. Il a été démontré la cristallinité du système d'administration thérapeutique à be un facteur important qui affecte la livraison et la dose ^31. Une diminution de la cristallinité du véhicule SLN peut influencer les paramètres tels que la capacité de chargement thérapeutique et de la cinétique de libération de médicament ^31. La méthode de PIT est une technique de synthèse plus douce en comparaison avec d'autres méthodes, avec la limitation que seuls les médicaments lipophiles peuvent être incorporés dans les particules. Malgré cette limitation, GLS synthétisés en utilisant cette méthode sont hautement biocompatible, ce qui rend la plate-forme de livraison, puis adapté à de nombreuses applications dans la recherche biomédicale.

Les effets de l'interaction SLN dermique sur la viabilité de fibroblastes humains ont été analysés en utilisant un test MTT. Une diminution dose-dépendante de la viabilité n'a été observée avec l'augmentation des concentrations de SLN. Au cours de la synthèse SLN, les particules lipidiques sont stabilisées avec une couche de tensioactif. Comme la taille des particules diminue, surface augmente, de même que le potentiel d'interactions de surface cellulaire et l'exposition cellulaire to la couche d'agent tensio-actif, ce qui risque d'endommager les membranes cellulaires. Ces expériences ont permis la détermination de la concentration de dosage au cours de laquelle l'absorption cellulaire de particules a pu être observée, tout en évitant une diminution significative de la viabilité des cellules en raison de la perturbation de la membrane. Analyse MTT est une technique quantitative qui peut être largement appliquée à la compréhension de la santé cellulaire. En parallèle, les cellules ont été examinées par microscopie à fluorescence afin de visualiser la fluorescence du colorant fluorescent de cargaison, NIR. En utilisant cette technique, l'absorption des particules a été observée après seulement deux heures d'incubation avec des fibroblastes humains. La microscopie à fluorescence fournit des informations qualitatives liées à la morphologie cellulaire et les caractéristiques. Des précautions doivent être prises pour éviter les excès de coloration de fond et l'imagerie d'objets. En outre, en tant que modèles de souris sont généralement le premier choix pour en profondeur cellulaire et moléculaire investigations, nous avons analysé l'interaction entre les cellules murines et SLN. En particulier, un grandintérêt réside dans l'utilisation de nanoparticules pour la libération sélective et contrôlée de médicaments qui modifient le comportement du système immunitaire. Par conséquent, la cytométrie en flux a été utilisée pour mesurer l'absorption de particules par les cellules dendritiques de la souris. Ces données confirment que les cellules phagocytaires comme les cellules dendritiques peuvent tolérer une gamme similaire de la concentration des SLN (avec une viabilité réduite observée à 50 pg / lipide ml comme avec des fibroblastes dermiques humains) et le taux d'incorporation est directement corrélée avec la concentration de l'exposition SLN. En outre, DC a révélé une incorporation très rapide de SLN, ce qui suggère que cette population pourrait représenter une cible valable via la délivrance de médicaments SLN médiation.

Cette étude comprend la description d'une méthode pour la synthèse de l'ultra-petites populations de nanoparticules biocompatibles, ainsi que plusieurs méthodes in vitro permettant d'évaluer leurs interactions cellulaires. Dans les études futures, les essais supplémentairespeut être utilisée pour caractériser les interactions de particules cellulaires et finalement guider le développement réussi de nanotransporteurs thérapeutiques. Celles-ci pourraient inclure des études de cinétique de libération de médicament, l'analyse du tropisme cellulaire, la mesure des niveaux de cytokines pro-inflammatoires, et l'analyse des changements transcriptomiques cellulaires au fil du temps.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).