Bioengineering

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Nanopartikel-basierten Lieferfahrzeuge haben ein großes Versprechen für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen gezeigt, die Bereitstellung eines Mechanismus, um gezielt zu verändern zellulären Signaltransduktion und Genexpression. Diese Fahrzeuge können mit Medikamenten, Proteinen und Nukleinsäuren, einen Aufprall zellulären Reaktionen und erreichen eine gewünschte Wirkung auf Zielgewebe beladen werden. Viele Arten von Nano zu therapeutischen und diagnostischen Nutzen, einschließlich Lipide, Polymere, Silizium und magnetischen Materialien untersucht worden. Diese Systeme sind attraktiv aufgrund ihres Potentials zur lokalisierten Arzneimittelabgabe, erhöhten therapeutischen Konzentration im Zielgewebe, und eine Verringerung der systemischen Toxizität.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) sind ein gut untersuchtes Beispiel einer Nanopartikel-Abgabesystem, das als vielversprechende Arzneimittelabgabevehikel in den letzten Jahren abzeichnet. SLNs kann leicht für mehrere Anwendungen einschließlich Bio-Sensing ^1, Kosmetika ^{2 und} t formulierenherapeutic Lieferung ^3-7. Ihr Nutzen ergibt sich aus der Tatsache, dass sie vollständig aus resorbierbaren, ungiftig Lipiden, was zu einer verbesserten Biokompatibilität. Während der Synthese können lipophile Medikamente in SLN Fahrzeuge aufgenommen werden, wodurch Arzneimittellöslichkeit und Eignung Erhöhung für die parenterale Verabreichung. SLN Fahrzeugen auch dazu beitragen, eingekapselt Therapeutika zu stabilisieren, wodurch deren Abbau und Freiraum, und die Maximierung der therapeutischen Wirkung. Diese Fahrzeuge sind vor allem für Langzeitwirkung, kontrollierte Trennöle gut geeignet aufgrund ihrer Stabilität bei Körpertemperatur ^3,4,8,9. Wichtiger ist, Verkapselung von Wirkstoffen in Lipidnanopartikel ändert die intrinsische die pharmakokinetischen Profile der Arzneimittelmoleküle. Dies bietet einen Vorteil, indem sie die kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen mit einem engen therapeutischen Index. Die Freisetzungsrate des SLN-einge Therapeutika kann abgestimmt basieren auf der Lipidabbaurate oder das Medikament Diffusionsgeschwindigkeit in dieLipidmatrix.

SLNs werden oft entwickelt, um in spezifischen Zielgeweben ansammeln. Beispielsweise ihre Größe (typischerweise größer als 10 nm) potenziert Retention im Blutkreislauf, wobei der Leaky-Vaskulatur Tumorgewebe erleichtert Abscheidung. Darüber hinaus hat der Weg der Verabreichung Partikel wurde gezeigt, daß die biologische Verteilung, die das Potenzial zu verändern, wie Lymphknoten ^10,11 um spezifische physiologische Zielstrukturen. Bei der Abscheidung in Zielgeweben zu erzielen geeigneten zellulären Wechselwirkungen und eventuelle Internalisierung von Nanopartikeln ist schwierig aufgrund der Fähigkeit der Zellmembranen, um den Fluss von Ionen und Molekülen in die und aus der Zelle ¹² selektiv zu steuern. Um die zelluläre Aufnahme zu erleichtern, ist es möglich, Nano mit spezifischen Liganden einschließlich Peptiden, kleine Moleküle, als auch monoklonale Antikörper ^13,14 modifizieren. Verschiedene Mechanismen, die sowohl passive Penetration und aktiven Transport von Nanopartikelnüber die Zellmembran sind zuvor beschrieben worden ^3,12,15. Im allgemeinen hat es sich gezeigt, daß zell Nanopartikel Wechselwirkungen werden durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Nanopartikel einschließlich der Größe, Form, Oberflächenladung und Oberflächenchemie beeinflusst neben zellspezifischen Parameter wie Zelltyp oder ^{Zellzyklus-Phase} 12.

Eine frühere Untersuchung zeigte die Synthese von Sub-10 nm SLNs zur topischen ¹⁶ und Biomarker-Erkennungsanwendungen ¹ unter Verwendung der Phaseninversionstemperatur (PIT) Verfahren ^17. Dies ist eine schonende ^{Syntheseverfahren,} wobei 2 die Zusammensetzung konstant bleibt, während die Temperatur allmählich verändert wird. Kontinuierliches Rühren der erhitzten Lösung beim Abkühlen auf Raumtemperatur führt zu einer Nanoemulsion. Dieses Verfahren resultiert in der Synthese von SLNs mit kleinerer Teilchengrße ¹ als die zuvor unter Verwendung verschiedener Verfahren für die Synthese von Lipid nan gemeldetoparticles ^17-22. Die resultierende Größenskala von weniger als 20 nm beträgt, stellt einen Vorteil für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen aufgrund der erhöhten Oberfläche und dem Potential für erhöhte zelluläre Interaktionen.

Eine schematische Darstellung SLNs designt einen fluoreszierenden Farbstoff oder therapeutischen liefern, ist in Abbildung 1 dargestellt. Die SLN bestehen aus einer Lipid Innenraum (zB lineares Alkan), die die Einarbeitung von lipophilen Verbindungen (beispielsweise Farbstoffe oder Therapeutika) und einem Tensid Außen (zB lineares nichtionisches Tensid) von Wasser umgeben ist. In dieser Studie wurden SLNs mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen, und als ein Modell verwendet, um Partikel-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Primäre humane dermale Fibroblasten und Maus dendritischen Zellen wurden farbstoffbeladenen SLN über die Zeit ausgesetzt, um Wechselwirkungen im Hinblick auf Toxizität und Partikelaufnahme charakterisieren. A 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) -Assay wurde utilium geeignete Dosierung Ebenen zu etablieren zed. Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie zwei eingesetzt werden, um Partikelaufnahme in vitro zu untersuchen Methoden.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des SLN, die die Hauptbestandteile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protocol

1. Die Verarbeitung von SLNs

Synthese von SLNs
Hinweis: Mit der PIT-Methode ^1,17,20, um die Unter 20 nm SLNs ¹ vorzubereiten.
1. Verwenden Sie aseptisch, Bioreagenzien oder Zellkultur-Reagenzien und sterilen Materialien (dh, Pipetten, Spatel, Fläschchen, etc.).
2. Verwenden Sie ein Biosicherheitswerkbank für die Synthese von SLN (Abbildung 2).
3. Kombinieren 0,6 mg Fluoreszenzfarbstoff (Nile Red (NIR) ist NiR Konzentration etwa 0,3 mg / ml) und 0,10 g Heneicosan (Lipid, 5 w / w% Lipid-Konzentration) in einem Glasfläschchen (15 ml), Co-Schmelze mit 90 ° C und umrühren.
4. Hinzufügen 0,11 g Polyoxyethylen (10) oleylether (Tensid, 5,5 Gewicht / Gewicht% Tensidkonzentration). Co-Schmelzen der resultierenden Mischung bei 90 ° C und rühren.
5. Hinzufügen 1,79 g steriles Wasser zu der Mischung, Erhitzen auf 90ºC und Rühren, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet.
  Hinweis: Unter fortgesetztem Rühren und kontrollierte Kühlung, SLNs erzeugt. Diese Bedingungen verursachen eine Inversion der Wasser-in-Öl-Emulsion zu einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Lipophile Moleküle wie NiR Partition auf die Lipidtröpfchen.
6. Bereiten Sie eine Nanoemulsion parallel ohne Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs, um als Kontrollprobe zu dienen. Kombinieren 0,10 g Heneicosan und 0,11 g Polyoxyethylen (10) oleylether in ein Fläschchen (15 ml) Co-Schmelze bei 90 ° C und umrühren.
  1. Hinzufügen 1,79 g steriles Wasser zu der Mischung, Erhitzen auf 90ºC und Rühren, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet.
7. Weitere Sterilisierung jedes Nanoemulsion mit einer sterilen 0,2 um Filter.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Synthese von SLN. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Teilchengröße und Polydispersity
1. Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung (DLS), um die Teilchengröße und Polydispersität der SLN ^{1 unter Verwendung einer} Glasküvette und ein Gerät zur Partikelgröße zu messen messen.
2. Vor den Messungen der Proben zu messen, die Teilchengrößen der beiden bekannten Normen nach Herstellerprotokoll für die Standards Vorbereitung und Messung.
3. Füllen Sie das Glas Küvetten mit 1,5 ml Standardlösung und messen Sie die Standardlösung mit den gleichen Messbedingungen wie die Proben.
  Hinweis: Vorheriger Schritt wurde für jeden Standard wiederholt.
4. Messen Sie die Proben vorbereitet. Für jeden, die folgenden Versuchsparameter: eine Laufzeit von 100 sec, Brechungsindex von Wasser (1,33), die Viskosität von Wasser bei 20 ° C (1.002 mPa · s).
  Anmerkung: Diese Technik verwendet frequenzverschobenen Lichts, um die Größe der Nanopartikel zu messen.
5. Berichten über den mittleren Teilchendurchmesser und Polydispersität particle Größenverteilung.
Schmelzpunkt und latente Schmelzwärme
1. Verwenden eines Differential-Scanning-Kalorimeter (DSC) mit einem Auto-Sampler und Flüssigstickstoffkühlquelle ausgestattet, um das thermische Verhalten von SLNs ¹ zu untersuchen.
2. Pipettieren Sie den bei der Herstellung SLNs in einen 40 ul Aluminiumschale mit einer Masse von etwa 25 mg und hermetisch abzudichten die Pfanne mit einer Universal crimper drücken, um den Feuchtigkeitsverlust während der DSC-Scan zu minimieren.
3. Messen jedes Nanoemulsion 5 bis 80 ° C.
4. Bericht der Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme aus dem DSC-Diagramm, wo das Tal stellt den Schmelzpunkt und das Integral der Fläche unter der Kurve in der DSC-Diagramm, geteilt durch die Menge des Materials stellt die latente Schmelzwärme.

2. SLNs Wechselwirkungen mit Fibroblasten und dendritischen Zellen

Kultur von primären humanen Fibroblasten
1. Kultur primären humanen fiFibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers in einem flüssigen Medium für die Kultur von humanen dermalen Fibroblasten (Medium 106) mit der niedrigen Serum-Wachstumsergänzung (LSGS) -Kit ergänzt. Aufrechtzuerhalten Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C, 5% CO _{2 und} Subkultur bei Erreichen 80% Konfluenz.
2. Für beide MTT und Bildanalyse, Samenzellen in einem 96-Well-Platte, bei einer Dichte von 2 ^× 10 4 Zellen pro Vertiefung, und lassen Sie sie bei 37 ° CO / N vor der SLN Belichtung ausgleichen lassen.
3. Zum Zeitpunkt Null, verdünnter SLNs in Komplettmedium ab (Abbildung 4), in Bezug auf Lipidkonzentration und Zugabe von 10 ul pro Vertiefung an jedem Replikat auch in der 96-Well-Platte.
4. Aufrechtzuerhalten Zellen bei 37 ° C, 5% CO _{2 während der} Inkubationszeit.
MTT Toxizitätstest
1. Nach 24 h Inkubation mit SLNs bestimmen zelluläre Lebensfähigkeit unter Verwendung des MTT-Assay nach dem Protokoll des Herstellers. </ li>
2. Waschen Sie die Zellen einmal und fügen Sie frisches Medium in jede Vertiefung (100 ul / Vertiefung). Getötet Kontrolle Wells durch Inkubation in einer 70% igen Methanol-Lösung für 10 min vor dem Ersetzen mit frischem Medium.
3. Hinzufügen MTT-Reagens (10 ul pro Vertiefung) zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte und Inkubieren O / N bei 37 ° C.
4. Nach O / N Inkubation solubilisieren intrazellulärem Formazin Kristalle mit dem vorgesehenen Detergenslösung (100 ul pro Vertiefung) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
5. Nach 3 h Inkubation bei RT erhalten Absorptionswerte bei einer Meßwellenlänge von 570 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät.
  Anmerkung: MTT-Reagenz verwendet wird, sollte weniger als 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid.
Fluoreszenzmikroskopie
1. Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Dosierung von Fibroblasten mit SLN, wäscht die Fibroblasten zweimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und fixieren 10 min mit kaltem 70% igem Methanol.
2. Nach 10 min, Ersetzen Sie das Methanol mit PBS und die Aufnahmen mit einem inversen Mikroskop, mit einem Bandpass (BP) 690/50-nm-Filter-Set.
Kultur von Knochenmark der Maus Dendritic Cells
1. Induzieren Maus-Knochenmark gewonnene dendritische Zellen (BMDC) wie zuvor beschrieben ^23,24. Kurz gesagt, Platte Einzelzellsuspensionen von C57BL / 10 Knochenmark in 100 mm Petrischalen bei ² × 10 6 / Platte mit rekombinantem murinen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF, 300 U / ml) und rekombinantem murinem IL-4 (B-Zell-stimulierender Faktor, 200 U / ml). Ändern Medien alle 3 Tage.
2. Am 7. Tag hinzuzufügen NiR belastet SLN auf die Schalen in einer Endkonzentration von 0,5 und 5,0 ug / ml Lipid und Aufrechterhaltung der Zellen in einem 37 ° C, 5% CO _{2 -Inkubator} für die gewünschte Dauer der Exposition.
3. Sammeln Zellen von den Schalen durch Ansaugen alle Medien in der Platte gesammelt wird in ein 50 ml Röhrchen, gefolgt von gründlichem Waschen der Platte (lose ad verdrängenrente Zellen) mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 4 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in der gleichen 50-ml-Tube.
Beurteilung der SLNs Incorporation über Durchflusszytometrie
1. Bestimmen Sie die Konzentration des in Punkt 2.4.3 erhaltene Zellsuspension und vertreiben 3x10 ⁵ Zellen in eine 12 mm x 75 mm Rund FACS-Röhrchen.
2. Die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml PBS und anschließendem Zentrifugieren der Röhrchen für 5 min bei 400 · g, bei einer Temperatur von 4 ° C.
3. Der Überstand verworfen und das Pellet mit 100 ul PBS / 2 mM EDTA / 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) (Färbepuffer) mit anti-CD11c-FITC monoklonalen Antikörper (0,25 ug / ml final). Inkubieren für 30 min auf Eis im Dunkeln.
4. Die Zellen werden mit 1 ml PBS und dann zentrifugieren Röhrchen 5 min bei 400 · g, bei einer Temperatur von 4 ° C.
5. Überstand verwerfen und resuspendieren jedesPellet mit 400 & mgr; l Färbepuffer. Die Zellen sind nun bereit für die Übernahme der Proben mit einem Durchflusszytometer (möglicherweise mit blauen und roten Lasern ausgestattet ist).
6. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie-Analyse-Software, zu bewerten den Grad der Einbeziehung der SLN von DC durch Gating auf die Bevölkerung von CD11c + Zellen (FITC positiv) und Vergleichen der Intensität der SLN-assoziierte Fluoreszenz (in der PerCP-Cy5.5 oder APC-Kanälen gemessen).

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Representative Results

Die PIT-Verfahren wurde verwendet, um die SLN zu synthetisieren und die Phaseninversionstemperatur wurde bestimmt unter Verwendung eines Wasserbades. Die Proben wurden langsam erwärmt und vorsichtig gerührt, bis die Lösung klar erschien. Der Phaseninversionstemperatur für die SLNs unter Verwendung Heneicosan Lipid 45 ° C. Tabelle 1 faßt die Teilchengröße, Polydispersität, Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme für den SLN. Die synthetisierten Verwendung der oben beschriebenen Verarbeitungsbedingungen SLNs ergab Steuer SLNs und NIR belastet SLN mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 18,59 und 16,87 nm bei einer Polydispersität von 5,83 und 4,47, bzw. (3). Die Stabilität der SLN-Dispersion wurde durch die Messung der Partikelgröße über 6 Tage an zwei verschiedenen Lagertemperaturen (4 und 23 ° C) verfolgt. Die Partikelgröße nicht mehr als 6 Tage ändern (Daten nicht gezeigt).

Das thermische Verhalten der SLNs wurde BeobachtungsATED unter Verwendung der Differentialscanningkalorimetrie. Die synthetisierten SLNs haben einen Schmelzpunkt von 38,0 (± 0,4) und 36,8 (± 0,2) ° C für die Kontroll SLNs und NIR belastet SLN auf. Im Gegensatz dazu ist der Schmelzpunkt für die Masse Lipid 40,0ºC, was die Unterdrückung der Schmelzpunkt des SLNs relativ zum Schütt Lipids. Erwartungsgemäß ist die Beschränkung auf geringe Abmessungen und hohe Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis drücken das Nanoteilchen Schmelzpunkt ^1. Darüber hinaus ist die latente Schmelzwärme für die Steuer SLNs und NIR belastet SLN 5,1 (± 0,2) und 4,0 (± 0,1) J / g. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Grad der Kristallinität der SLN durch die Nutzlast in dem NIR belastet SLN zeigte eine niedrigere Kristallinität im Vergleich mit den Kontroll SLNs betroffen.

Figur 3
Abbildung 3. Die Partikelgrößenverteilungtypischen Nanoemulsionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Sample	Partikelgröße (nm)	Polydispersität	Schmelzpunkt (° C)	Latente Schmelzwärme (J / g)
SLN (Control)	18.59	5.83	38,0 ± 0,4	5,1 ± 0,2
NIR SLNs	16,87	4.47	36,8 ± 0,2	4,0 ± 0,1

Tabelle 1. Zusammenfassung der physikalischen Eigenschaften und thermischen Verhaltens der Steuer SLNs und NIR belastet SLN Partikelgröße, der Polydispersität, Schmelzpunkt und die latente Wärme der Schmelzen.

Um die Wechselwirkung von Teilchen und Zellmodellen zu erforschen, die Dosisbeschränkungen des SLN als direkt an primäre Zellen in Kultur angewendet wird, wurden zuerst hergestellt. Verwendung eines MTT-Assay wurde die Dosis-Wirkungs-Effekt auf den Zellstoffwechsel gemessen, wenn eine steigende Partikelkonzentration zu einer Abnahme in der Zelllebensfähigkeit (gegenüber der unbehandelten Kontrollzellen). Es wurde kein Unterschied in der Toxizität zwischen den Zellen zu SLN alleine gegen NiR belasteten SLN bei diesen vorgegebenen Dosen ausgesetzt. Parallel wurden die Zellen visuell auf die Einhaltung des Gewebekulturpolystyrol sucht und es wurden Bilder aufgenommen, um sowohl repräsentativ zelluläre Morphologie und die Aufnahme von fluoreszierenden Teilchen im Laufe der Zeit (Abbildung 5) zu demonstrieren. Verwendung einer Dosis in Höhe von 5 ug / ml Lipid (ca. 80% zelluläre Lebensfähigkeit) Partikelaufnahme wurde durch 2 h nach der Exposition beobachtet.

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Abbildung 4. Die Lebensfähigkeit von primären humanen dermalen Fibroblasten nach 24 Stunden Inkubation mit Nanopartikeln. Die Lebensfähigkeit wurde unter Verwendung eines MTT-Test gemessen und Daten stellen Prozent lebensfähigen Zellen in Bezug auf unbehandelten Kontrollen. Konzentrationen darstellen Gewicht / Volumen Lipid. Daten beziehen sich auf mindestens drei unabhängigen Experimenten, dreifach durchgeführt. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Primäre humane dermale Fibroblasten nach (A) 2 und (B) 24-stündiger Inkubation mit NIR-beladenen Nanopartikel. Nanopartikel-Konzentration gleich 5 ug / ml Lipid.Bilder, die für mindestens drei unabhängigen Experimenten, zweifach durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Basierend auf den Ergebnissen der Dosisbegrenzung Studien wurde die Korrelation zwischen der Dosis von SLNs und Grad des Einbaus in murine BMDC sucht. Diese Zellen sind weit der beste in vitro-Modell von mehreren in vivo vorhandenen DC Untergruppen betrachtet und damit für die Grundlagenforschung Ebene Untersuchungen beider zellulären und molekularen Effekte beabsichtigten Manipulationen. BMDC wurden unbehandelt gelassen oder exponierten O / N entweder 0,5 oder 5,0 ug / ml Lipid der NIR belastet SLN (ähnlich humanen Fibroblasten, die Verwendung von 50 ug / ml Lipid zu weniger als 10% lebensfähige Zellen) und die Höhe der Nanopartikel-Einbau durch Messen der Intensität der Fluoreszenz in NiR BMDCs mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Eine direkte correnung zwischen der Konzentration von SLNs verwendet und die Menge der Fluoreszenz in BMDCs beurteilt wurde beobachtet (6A). Eine Analyse der Kinetik der NiR belastet SLN Einbau ergab sich eine sehr schnelle Aufnahme von BMDC. Die SLN Fluoreszenzsignal war schon nach 1 Stunde der Exposition hervorgeht, während ein Plateau bei etwa 5h der Exposition (6B).

Figur 6
Abbildung 6 SLN-Einbau durch dendritische Zellen korreliert mit der Konzentration der Exposition. (A) Maus-Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDC) wurden belichtet O / N bis NIR-SLNs am Lipidkonzentration angegeben, und der Grad des Einbaus beurteilt mittels Durchflusszytometrie. Histogramm-Overlays sind alle auf der CD11c + Bevölkerung gated. (B) Kinetik der SLN-Einbau durch BMDC. Die Zellen wurden bis zum NIR-SLN (ausgesetzt 5ug / ml) für die angegebene Zeit und der Höhe der Fluoreszenz (auf gated CD11c + Zellen) wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In dieser Studie wurden die Synthese SLNs und ihre Anwendbarkeit für eine intrazelluläre Targeting-Anwendungen erforscht. Diese biokompatible Nanopartikel versprechen als Lieferfahrzeuge für mehrere Anwendungen einschließlich der Arzneimittelabgabe, Gen-Silencing, und Impfstoff-Technologien ^25-30 gezeigt. Ultrakleine SLNs wurden unter Verwendung eines einfachen Prozesses hergestellt, und ihre Wechselwirkungen mit primären Hautzellen und primären Immunzellen wurden untersucht. SLNs wurden zur Verkapselung von einem fluoreszierenden Farbstoff (NIR), die als Modell diente therapeutische Ladung enthalten.

Die PIT-Verfahren wurde eingesetzt, um SLN und die daraus resultierenden Partikeleigenschaften (Teilchengröße, Polydispersität, Schmelzpunkt und Umwandlungswärme beim Schmelzen) wurden unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuung und Differentialscanningkalorimetrie ausgewertet synthetisieren. Teilchengröße und Polydispersität Analyse zeigte die Synthese von ultra-kleinen SLNs mit enger Polydispersität, ideal für die intrazelluläre Zieling Anwendungen. Wie bereits berichtet, kann Partikelgröße eine wichtige Rolle auf zellulärer Interaktionen ¹² zu spielen. Die Größe der Nanopartikel wurde gezeigt, dass eine dramatische Wirkung haben, beeinflussen Zellaufnahme Internalisierung Pfadselektion, die intrazelluläre Lokalisierung und Zytotoxizität ^12. Einige der allgemeinen Trends in Bezug auf Zell-Nanopartikel-Wechselwirkungen in der Literatur dokumentiert sind: kritische Größe mit Zelltyp und Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel variieren und kleine Nanopartikel haben eine höhere Wahrscheinlichkeit von internalisiert werden passive up-nehmen als große ¹² . Thermoanalyse der Teilchen in dieser Untersuchung ergab ein anderes Maß an Kristallinität (dh latente Schmelzwärme) zwischen den Steuer SLN und die mit NIR-Farbstoff beladen. Die Kristallinität der SLNs verringert wird, um die Zugabe des fluoreszierenden Farbstoffs, der als eine Verunreinigung wirkt, zurückzuführen. Die Kristallinität der therapeutischen Abgabesystem wurde gezeigt, dass bE ein wichtiger Faktor, der die Lieferung betrifft und Dosis ^31. Eine Abnahme der Kristallinität der SLN Fahrzeug kann Parameter wie therapeutische Belastbarkeit und Wirkstofffreisetzungskinetiken ³¹ beeinflussen. Die PIT-Verfahren ist ein schonender Synthesetechnik im Vergleich mit anderen Verfahren, mit der Einschränkung, daß nur lipophile Medikamente können in die Teilchen eingearbeitet werden. Trotz dieser Einschränkung sind SLNs synthetisiert mit dieser Methode eine hohe Biokompatibilität, wodurch dann geeigneten Plattform für viele Anwendungen in der biomedizinischen Forschung.

Die Auswirkungen der SLN Interaktion auf humanen dermalen Fibroblasten Lebensfähigkeit wurden unter Verwendung eines MTT-Test analysiert. Eine dosisabhängige Abnahme der Lebensfähigkeit wurde mit steigenden Konzentrationen von SLN beobachtet. Während SLN Synthese werden die Lipid-Teilchen mit einem oberflächenaktiven Schicht stabilisiert. Als die Partikelgröße abnimmt, Oberfläche zunimmt, ebenso wie das Potential für die Zelloberflächenwechselwirkungen und zellulären Exposition to die Surfactant-Schicht, die die Zellmembranen angreifen. Diese Versuche ermöglichten die Bestimmung des Dosierungskonzentration, bei der zellulären Aufnahme von Partikel könnten unter Vermeidung einer signifikanten Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen durch Membranzerstörung beobachtet werden. MTT-Analyse ist ein quantitatives Verfahren, das weitgehend für das Verständnis der Zellgesundheit eingesetzt werden kann. Parallel dazu wurden Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, um die Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoff-Ladung, NIR Visualisierung untersucht. Unter Verwendung dieser Technik wurde Partikelaufnahme nach 2 h Inkubation mit menschlichen Fibroblasten beobachtet. Fluoreszenzmikroskopie liefert qualitative Informationen, um zelluläre Morphologie und Eigenschaften zusammen. Es muss darauf geachtet werden, um übermäßige Hintergrundfärbung und Imaging von Artefakten zu vermeiden. Darüber hinaus sind, wie Maus-Modellen allgemein die erste Wahl in der Tiefe zelluläre und molekulare Untersuchungen untersuchten wir die Wechselwirkung zwischen SLNs und Mäusezellen. Insbesondere eine großeInteresse besteht in der Verwendung von Nanopartikeln für die selektive und kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen, die das Verhalten des Immunsystems ändern würde. Folglich Durchflusszytometrie wurde eingesetzt, um die Aufnahme von Teilchen, die durch Maus-dendritischen Zellen zu messen. Diese Daten bestätigten, dass Fresszellen wie dendritische Zellen können eine ähnliche Reihe von SLNs Konzentration tolerieren (mit eingeschränkter Überlebensfähigkeit bei 50 ug / ml Lipid als mit menschlichen dermalen Fibroblasten beobachtet) und dem Grad des Einbaus direkt mit der Konzentration der SLN Exposition korreliert. Darüber hinaus zeigte DC eine sehr schnelle Aufnahme von SLN, was darauf hindeutet, dass diese Bevölkerung könnte ein wertvolles Ziel über SLN-vermittelte Arzneimittelabgabe zu vertreten.

Diese Studie schließt die Beschreibung eines Verfahrens für die Synthese von ultrakleinen Populationen biokompatibler Nanopartikel, sowie mehrere in vitro-Verfahren, mit denen ihre zelluläre Interaktionen zu beurteilen. In zukünftigen Studien, zusätzliche Testseingesetzt werden, um weiteren Charakterisierung der Partikel-Zell-Wechselwirkungen und schließlich führen die erfolgreiche Entwicklung von therapeutischen Nano. Diese könnten Untersuchungen der Wirkstofffreisetzungskinetiken, Analyse von zellulären Tropismus Messung der pro-inflammatorischen Zytokins Ebenen und Analyse von zellulären transkriptomischen Veränderungen über die Zeit umfassen.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

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References

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