Bioengineering

Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Nanoparçacık tabanlı dağıtım araçları, özellikle hücresel sinyalizasyon ve gen ifadesini değiştirmek için bir mekanizma sağlayarak, hücre içi hedefleme uygulamalar için büyük umut göstermiştir. Bu araçlar, ilaç, proteinler, hem de hücresel yanıtları etkileyecek ve hedef dokularda arzu edilen bir etkiyi elde etmek için tasarlanmış bir nükleik asit ile yüklenebilir. Nanocarriers birçok tipi lipidler, polimerler, silisyum ve manyetik malzemeler de dahil olmak üzere terapötik ve diagnostik yararı için incelenmiştir. Bu sistemler bir terapötik hedef dokularda konsantrasyonu, ve sistemik toksisite azalmasına sebep lokalize ilaç dağıtımı için potansiyeli, için çekicidir.

Katı lipid nanoparçacıklarının (SLNs) son yıllarda umut verici bir ilaç verme vasıtası olarak ortaya çıkan bir nanopartikül verme sisteminin iyi çalışılmış örnektir. SLNs hali hazırda biyo-algılayıcı ^1, kozmetik ² ve t de dahil olmak üzere çok sayıda uygulama için formüle edilebilirherapeutic teslimat ^3-7. Onların yarar onlar gelişmiş biyouyumluluk sonuçlanan emilebilir, toksik olmayan lipitlerin tamamen oluşmaktadır gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Sentez sırasında, lipofilik ilaçlar böylece parenteral uygulama için ilacın çözünürlüğünü ve uygunluğu, artan SLN araç içine dahil edilebilir. SLN araçlar aynı zamanda bozulması ve açıklığını azaltarak ve terapötik etkisini maksimize kapsüllü terapötikler stabilize etmek için yardımcı olur. Bu araçlar sayesinde vücut sıcaklığı ^3,4,8,9 de stabiliteleri özellikle uzun etkili, kontrollü salım preparasyonlar için uygundur. Önemli olarak, lipid nanoparçacıklarının ilaç kapsülleme ilaç moleküllerin içsel farmakokinetik profiller değiştirir. Bu dar bir terapötik indeksi olan ilaçların kontrollü bir salınıma izin veren, bir potansiyel bir avantaj sağlar. SLN-dahil terapötik salım hızı ayarlanmış lipid bozunum hızı ya da ilaç yayılma hızına dayalı olabilirlipit matris.

SLNs genellikle belirli hedef dokularda birikir tasarlanmıştır. Örneğin, kendi boyutu (tipik olarak daha fazla 10 nm), tümör dokusunun sızdıran damar birikimi kolaylaştıran dolaşım içinde tutma güçlendirir. Buna ek olarak, partikül uygulama yolu gibi lenf düğümleri ^10,11 gibi özel fizyolojik yapılar hedef potansiyeli olan bir biyo dağılıma değiştirmek için gösterilmiştir. Hedef dokularda birikimi, uygun hücresel etkileşimi sağlamak ve nanopartiküllerin nihai bunun üzerine bağlı seçici hücre içine ve ¹² üzerinden iyon ve moleküllerin akışını kontrol etmek için hücre zarlarının yeteneği nedeniyle zordur. Hücresel alımı kolaylaştırmak için, peptidler, küçük moleküller, ve monoklonal antikorlar da dahil olmak üzere ^13,14 spesifik ligandlarla nanocarriers değiştirmek mümkündür. Pasif penetrasyon ve nanopartiküllerin aktif ulaşım de dahil olmak çeşitli mekanizmalarhücre zarı boyunca, daha önce ^3,12,15 tarif edilmiştir. Genel olarak, bu, hücre-nanopartikül etkileşimleri, hücre tipi veya hücre döngüsü faz ¹² olarak hücreye özel parametrelere ek olarak, boyut, şekil, yüzey yükü ve yüzey kimyası da dahil olmak üzere nanopartiküller fizikokimyasal özellikleri tarafından etkilendiği gösterilmiştir.

Bir önceki soruşturma aşaması inversiyon sıcaklığı (PIT) yöntemini kullanarak ^{17 16} topikal ve biyomarker algılama uygulamaları ¹ için alt 10 nm SLNs sentezini gösterdi. Bu sıcaklık yavaş yavaş değişir ise bileşimi aynı kalır ² hafif bir sentez yöntemidir. Isıtılmış çözeltinin sürekli karıştırma, gibi nanoemülziyon RT sonuçlarına soğur. Daha küçük bir partikül boyutuna sahip ¹ SLNs sentezinde Bu işlem, daha önce sonuçlar lipid nan sentezi için çeşitli yöntemler kullanılarak raporoparticles ^17-22. Elde edilen boyut ölçeği, en az 20 nm, artan yüzey alanı ve gelişmiş bir hücresel etkileşimler için potansiyeli, hücre içi hedef uygulamalar için avantaj sağlamaktadır.

Bir floresan boya veya terapötik sağlamak üzere tasarlanmıştır SLNs şematik, Şekil 1 'de gösterilmiştir. SLNs bir lipit iç (örneğin, lineer alkan) lipofilik bileşiklerin (örneğin, boyalar veya terapötik) dahil edilmesine izin veren ve bir yüzey aktif dış oluşmaktadır su ile çevrili (örneğin, doğrusal noniyonik yüzey aktif madde). Bu çalışmada, SLNs bir floresan boya ile yüklenir ve partikül-hücre etkileşimleri incelemek için bir model olarak kullanılmıştır. Primer insanlara özgü dermal fibroblastlar ve fare dendritik hücreler toksisite ve parçacık alımı ile ilgili etkileşimler karakterize etmek amacıyla zaman SLN yüklü boyamaktadır maruz bırakıldı. A: 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium bromid (MTT) deneyi utili olduUygun doz seviyelerinin kurmak amacıyla zed. Floresan mikroskobu ve akım sitometri in vitro parçacık alımını incelemek için kullanılan iki yöntem vardı.

figür 1
Önemli bileşenlerini gösteren SLN Şekil 1. şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

SLNs 1. İşleme

SLNs sentezi
Not: alt 20 nm SLNs ¹ hazırlamak için PIT yöntemi ^1,17,20 kullanın.
1. Aseptik teknik, bioreagents veya hücre kültürü sınıf reaktifler ve steril malzemeler (yani, pipetler, spatula, şişeler, vs.) kullanın.
2. SLNs sentezinde (Şekil 2) için bir biyogüvenlik kabini kullanın.
3. Floresan boya, 0.6 mg birleştirin ve bir viyal (15 ml) içine Heneicosane (Lipid, 5 ağırlık / ağırlık olarak% lipid konsantrasyonu), 0.10 g, en ortak eriyik (Nil Kırmızısı (NIR), NIR konsantrasyonu yaklaşık 0,3 mg / ml'dir) 90 ° C ve heyecan.
4. 0,11 g polioksietilen (10) oleil eter (yüzey aktif madde, 5,5 ağırlık / ağırlık olarak% sürfaktan konsantrasyonu) eklenir. 90 ° C ve karıştırın de elde edilen karışımın Co-eritebilir.
5. 90 ° C'ye kadar karışıma ısı steril su 1,79 g ekleyin ve şeffaf nanoemülsiyondur oluşana dek karıştırın.
  Not: sürekli karıştırma ve kontrollü bir soğutma, SL altındaNs oluşturulur. Bu koşullar, bir yağ-içinde-su emülsiyonu su içinde yağ emülsiyonu, bir inversiyon neden olur. Böyle lipid damlacıkları Nir bölüm olarak lipofilik moleküller.
6. Bir kontrol numunesi olarak hizmet vermek üzere, floresan boya eklemeden paralel nanoemülziyon hazırlayın. 90 ° C ve kızgın bir şişeye (15 mi) birlikte eriyik halinde Heneicosane 0.10 g ve 0.11 g polioksietilen (10) oleil eter birleştirin.
  1. 90 ° C'ye kadar karışıma ısı steril su 1,79 g ekleyin ve şeffaf nanoemülsiyondur oluşana dek karıştırın.
7. Dahası steril 0.2 mikron filtre kullanarak her nanoemülziyon sterilize edin.
Şekil SLNs sentezi 2. şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Partikül Boyutu ve Polydispersity
1. Parçacık boyutu ve bir çoklu-dağınıklığa cam küvet kullanıldığında SLNs ¹ ve tanecik boyutunu ölçmek için tasarlanmış bir cihaz ölçmek için dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanın.
2. Numunelerin ölçümleri önce, standart hazırlanması ve ölçümü için, imalatçının protokolü takip eden iki bilinen standartların parçacık boyutlarına ölçer.
3. Standart çözeltinin 1,5 ml 'si ile, cam küvet doldurun ve örnekleri gibi aynı ölçüm koşulları kullanılarak standart solüsyonu ölçer.
  Not: Önceki adım, her standart için tekrarlandı.
4. Hazırlanan numuneler ölçün. Her biri için, aşağıdaki deney parametreleri kullanın: 100 saniye, suyun kırılma indeksi (1.33), su viskozitesi bir çalışma süresi 20 ° C (1,002 mPa saniye).
  Not: Bu teknik frekans nanopartiküllerin boyutunu ölçmek için ışık kaymıştır kullanır.
5. Partiküller ortalama parçacık çapı ve poli dağılım raporcle boyut dağılımı.
Erime Noktası ve erime gizli ısısı
1. SLNs ¹ termal davranışını incelemek için bir otomatik numune alıcı ve sıvı nitrojen soğutma kaynağı ile donatılmış bir diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC) kullanarak.
2. Yaklaşık 25 mg değerinde bir kütle ile 40 ul alüminyum tavaya olarak hazırlanmış SLNs pipet ve hava geçirmez bir şekilde DSC taraması sırasında nem kaybını en aza indirmek için evrensel bir kıvırma presi kullanılarak pan mühür.
3. 5-80 ° C arasında, her nanoemülziyon ölçün.
4. Erime noktası ve vadi erime noktasına ve malzeme miktarına bölünmesiyle DSC arsa eğri altında kalan alan integralini temsil DSC arsa gelen erime latent ısı erime için gerekli gizli ısının temsil bildirin.

Fibroblastları ve dendritik hücrelerle 2. SLNs Etkileşim

Primer insanlara özgü fibroblastlar Kültür
1. Kültür primer insan fibroblasts düşük serum büyüme ek (LSGS) kiti ile desteklenmiş (106 ortamı), insan dermal fibroblastlar, kültürü için sıvı ortam içinde üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir. % 80 kaynaşmaya eriştikten sonra 37 ° C'de,% 5 _CO2 ve alt-kültür nemlendirilmiş bir atmosferde hücreleri koruyun.
2. MTT ve görüntüleme oyuk başına 2 x 10 ⁴ hücre yoğunluğunda analizi bir 96-çukurlu plaka içinde tohum hücrelerinde, ve 37 ° CO / N önceden SLN maruz en dengelenmeye olanak her ikisi için.
3. Lipit konsantrasyonuna göre (Şekil 4) belirtilmiştir, ve her bir oyuk başına 10 ul olarak Sıfır zamanında, tam bir ortamda SLNs seyreltik 96 oyuklu plakanın üzerindeki çukurların çoğaltırlar.
4. Kuluçka süresi boyunca, 37 ° C'de,% 5 _CO2 hücreleri koruyun.
MTT Deneyi Toksisite
1. SLNs inkübasyonu 24 saat sonra, üreticinin protokolüne uygun olarak, MTT deneyi kullanılarak hücre canlılığı belirler. </ li>
2. Bir kez hücre yıkayın ve her bir oyuğa (100 ul / çukur) taze ortam ilave edin. Taze ortam ile değiştirmeden önce 10 dakika boyunca% 70'lik bir metanol çözeltisi içinde inkübe edilerek kontrol kuyuları öldürmek.
3. Mikrolevhanın her çukuruna MTT ayıracı (oyuk başına 10 ul) ilave edin ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
4. O / N inkübasyondan sonra, üreticinin protokolüne göre elde edilen bir deterjan çözeltisi ile hücre içi formazin kristaller (oyuk başına 100 ul) çözünür.
5. Oda sıcaklığında kuluçkalamadan 3 saat sonra, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 570 nm'lik bir dalga boyunda ölçülmesi absorbans değerlerini elde.
  Not: 3- (4,5-Dimetiltiazolil-2) -2, 5-difenil-tetrazolyum bromid (ağırlık / hacim)% 1'den daha az olmalıdır kullanılan MTT ayıracı.
Floresan Mikroskopi
1. SLN olan fibroblastların uygulamayı takiben belirli bir zaman noktalarında, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkama fibroblastlar ve soğuk% 70 metanol ile 10 dakika boyunca sabitlemek.
2. 10 dakika sonraBir grup geçiş (BP) 690/50 nm filtre seti kullanarak, ters bir mikroskop kullanılarak PBS ve yakalama görüntüleri ile metanol değiştirin.
Fare Kemik İliği Hücrelerinin Kültürü Dendritik
1. Indükleyin fare kemik iliğinden elde edilen dendritik hücreler (BMDC) halinde, daha önce tarif edildiği ^23,24. Kısaca, yeniden birleştirici sıçangil granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF, 300 U / ml) ve rekombinant fare IL-4 ile 2 x 10 ⁶ / plaka 100 mm Petri tabaklarda C57BL / 10 kemik iliği levhası tek hücre süspansiyonları (B hücre faktörü, 200 U / ml uyarıcı). 3 günde ortamı değiştirmek.
2. 7. günde, 37 ° C hücreleri 0,5 ve 5,0 ug / ml lipid nihai konsantrasyonda yemekleri NIR yüklü SLNs eklemek ve korumak, maruz kalma istenen uzunluğu için,% 5 _CO2 kuluçka makinesine kondu.
3. Plakasının ayrıntılı yıkanır, 50 ml'lik bir tüp içinde toplanacak şekilde plakanın tüm ortamı aspire yemekler hücreleri toplamak (gevşek reklam çıkarmak için4 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml (PBS) herent hücreleri) içerir. Aynı 50 ml bir tüp içinde elde edilen hücre süspansiyonu toplanır.
Akım Sitometrisi aracılığıyla SLNs Kuruluş Değerlendirilmesi
1. Alanına 2.4.3 'de elde edilen hücre süspansiyonu konsantrasyonunu belirlemek ve 12 mm x 75 mm yuvarlak tabanlı tüp içine FACS 3x10 ⁵ hücreleri dağıtın.
2. 1 ml PBS ilave edilmesi ve daha sonra 4 ° C arasındaki bir sıcaklıkta, 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje tabi tüpler hücreleri yıkayın.
3. Süpernatant atılır ve anti-CD11c-FITC monoklonal antikoru (0.25 ug / ml nihai) ihtiva eden PBS / 2 mM EDTA /% 0.1 sığır serum albümini, 100 ul (BSA) (boyama tamponu) pelletini. Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edilir.
4. 1 ml PBS ile hücreleri yıkanır ve daha sonra 4 ° C arasındaki bir sıcaklıkta, 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj tüpleri.
5. Süpernatantı atın ve her tekrar süspansiyonlekeleme tampon maddesi içinde 400 ul pelet. Hücreler artık bir akış sitometresinin (muhtemelen mavi ve kırmızı lazer ile donatılmış) örneklerin edinimi için hazırız.
6. Analiz yazılımı kullanılarak akış sitometrisi, CD11c + hücreleri (FITC pozitif) nüfusu üzerindeki yolluk ve (PerCP Cy5.5-veya APC kanalları olarak ölçülür) SLNs ilişkili floresans yoğunluğunu karşılaştırarak DC ile SLNs dahil edilme düzeyini değerlendirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PIT yöntemi SLNs sentezlemek için kullanılmış ve faz tersinmesi sıcaklık bir su banyosu kullanılarak belirlenmiştir. Numuneler yavaş yavaş ısıtılır ve çözelti berrak göründü kadar yavaşça ajite edildi. Heneicosane lipid kullanılarak yapılan SLNs için faz tersinmesi sıcaklığı 45 ° C. Tablo 1 parçacık boyutuna, polidispersiteye, erime noktası ve SLNs erimeye latent ısı özetlemektedir. Yukarıda tarif edilen işlem koşulları kullanılarak sentezlenmiştir SLNs 18,59 ve 16,87 nm bir ortalama parçacık çapı 5.83 ve 4.47, bir polidispersite (sırasıyla Şekil 3) kontrol SLNs ve NIR yüklü SLNs sonuçlandı. SLNs dispersiyonun istikrarı, iki farklı saklama sıcaklıkları (4 ve 23 ° C) 6 gün boyunca parçacık boyutunun ölçülmesi ile izlenmiştir. Parçacık büyüklüğü 6 gün boyunca değişmedi (veriler gösterilmemiştir).

SLNs termal davranışları Investig oldudiferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak bir-. Sentezlenmiş SLNs sırasıyla kontrol SLNs ve NIR yüklü SLNs ° C de 38.0 (0.4 ±) ve (± 0.2), 36.8 kadar bir erime noktasına sahiptir. Bunun aksine, bulk lipid erime noktası bulk lipide SLNs nisbetle erime noktası bastırma gösteren, 40.0 ° C'dir. Beklendiği gibi, küçük boyutları ve yüksek yüzey alanlı-hacim oranı sınırlandırıcı nanopartikül erime noktasına ¹ baskılar. Ayrıca, kontrol SLNs ve NIR yüklü SLNs erimeye latent ısı, sırasıyla (0.1 ±) (± 0.2): 5.1 ve 4.0 J / g olup, bu. Bu sonuçlar, SLNs kristallik düzeyi NIR yüklü SLNs kontrol SLNs ile karşılaştırıldığında daha düşük bir kristallik göstermiştir yük etkilenir olduğunu göstermektedir.

Şekil 3,
Şekil 3. Partikül büyüklük dağılımıTipik nanoemülsiyonlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Örnek	Partikül Boyutu (nm)	Polidispersite	Erime Noktası (° C)	Erime latent ısı (J / g)
SLNs (Kontrol)	18.59	5.83	38.0 ± 0.4	5,1 ± 0,2
Nir-SLNs	16.87	4.47	36.8 ± 0.2	4.0 ± 0.1

Fiziksel özellikleri ve tanecik büyüklüğü, polidispersite, erime noktası ve gizli ısı dahil kontrol SLNs ve NIR yüklü SLNs termal davranışı Tablo 1. Özeti erime.

Parçacıklar ve hücre modellerinde etkileşimlerini incelemek amacıyla, SLN doz kısıtlamaları doğrudan kültür içinde birincil hücreler uygulanan ilk kurulmuştur. Artan partikül konsantrasyonu (muamele edilmemiş kontrol hücrelerine göre), hücre canlılığında bir düşüşe neden burada bir MTT testi kullanılarak, hücre metabolizması ile ilgili doz-cevap etkisi ölçülmüştür. Bu, önceden belirlenmiş dozlarda NIR yüklü SLN tek başına karşı SLN maruz hücreler arasında toksisite açısından bir fark yoktu. Buna paralel olarak, hücrelerin görsel doku kültür polistiren bağlılık açısından incelendi ve görüntüler için temsili hücre morfolojisi ve zaman içinde parlak partiküllerin alımını (Şekil 5) her iki göstermek için alınmıştır. 5 ug / ml lipid eşit bir doz kullanılarak (yaklaşık% 80 hücre canlılığı) partikül alımı 2 saat sonra maruz bırakılarak gözlemlendi.

ys ">

Nanopartiküller ile 24 saat inkübe edildikten sonra, primer insan dermal fıbroblastlarının Şekil 4. Canlılık. Canlılık, bir MTT testi ile ölçülür ve veriler muamele edilmemiş kontrollere göre yüzde canlı hücreleri temsil etmektedir. Konsantrasyonları ağırlık / hacim lipit temsil etmektedir. Veriler üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir, en az üç bağımsız deneyin yansıtmaktadır. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil (A) 2 ve (B) NIR yüklü nanoparçacıklar ile 24 saat inkübasyon. Nanopartikül konsantrasyonu 5 ug / ml lipid eşittir 5. sonra primer insan dermal fibroblastlar.Görüntüler iki nüsha halinde gerçekleştirilen en az üç bağımsız deneyler, temsilcisi vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Doz sınırlama çalışmaların sonuçlarına dayanarak, SLNs dozu ve murin BMDC içine dahil edilmek seviyesi arasındaki ilişki araştırılmıştır. Bu hücreler yaygın in vivo mevcut çoklu DC alt gruplarının vitro model en iyi olarak kabul edilir ve amaçlanan manipülasyon hem hücresel ve moleküler etkileri temel araştırma düzeyinde araştırmalar için izin vardır. BMDC tedavi edilmediği ya da maruz kalan O / N, ya 0.5 ya da 5.0 ug / ml NIR yüklü SLNs lipid (benzer şekilde, insan fibroblast için 50 ug / ml lipid kullanımı% 10'dan daha az canlı hücreleri sonuçlandı) ve düzeyi nanoparçacık dahil akış sitometrisi ile BMDCs NIR floresans yoğunluğunu ölçülmesi ile tespit edildi. Doğrudan bir correkullanılan SLNs konsantrasyonu ve gözlenmiştir BMDCs değerlendirilen flüoresans miktarı (Şekil 6A) arasında lasyon. Nir yüklü SLNs esas kinetik analizi BMDC tarafından çok hızlı bir tutulum saptandı. Maruz kalma yaklaşık 5 saat (Şekil 6B) platolaşmasının ise SLN flüoresan sinyal, pozlama 1 saat sonra daha önce açıktı.

Şekil 6,
Dendritik hücreler tarafından Şekil 6. SLN dahil maruz konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. (A) murin, kemik iliği türevli dendritik hücreleri (BMDC) O maruz bırakıldı / N NIR SLNs için, lipid konsantrasyonunda gösterilen ve esas düzeyi değerlendirilmiştir flow sitometri aracılığı ile. Histogram bindirmeleri tüm. CD11c + nüfus kapı BMDC tarafından SLN dahil (B) Kinetik edilir. Hücreler, 5 NIR SLNs (maruz bırakıldıug / ml), belirtilen süre ve Geçitli CD11c + hücreleri üzerinde floresan düzeyde (için), flow sitometri ile değerlendirildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, SLNs sentezi ve hücre içi uygulamalar için hedefleme uygulanabilirlikleri incelenmiştir. Bu biyouyumlu nanopartiküller ilaç dağıtımı, gen susturma ve aşı teknolojilerine ^25-30 olmak üzere birden fazla uygulama için dağıtım araçları olarak söz göstermiştir. Ultra küçük SLNs bir uyduruk işlemi kullanılarak sentezlendi ve primer deri hücreleri ve primer immün hücreleri ile etkileşimleri incelenmiştir. SLNs model terapötik kargo olarak görev yapan bir floresan boya (NIR), kapsüllenmesini ihtiva edecek şekilde tasarlanmışlardır.

PIT yöntemi SLN ve elde edilen partikül özellikleri (erime parçacık boyutu, polidispersite, erime noktası ve latent ısı), dinamik ışık saçılması ve diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak değerlendirildi sentezlenmesi için kullanılmıştır. Hücre içi hedef Tane boyutu ve polidispersite analizi dar polidispersiteyle ultra küçük SLNs sentezini ortaya idealing uygulamaları. Daha önce belirtildiği gibi, tanecik boyutu, hücresel etkileşimler ¹² üzerinde önemli bir rol oynayabilir. Nanopartiküllerin büyüklüğü alımı verimliliği, içselleştirme yolu seçimi, hücre içi lokalizasyonu ve sitotoksisite ¹² etkileyen, dramatik bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Literatürde hücre nanoparçacık etkileşimleri açısından genel eğilimleri bazıları şunlardır: kritik boyut nanopartiküllerin hücre tipi ve yüzey özelliklerine göre değişebilir ve küçük nanopartiküller yüksek bir olasılık var tarafından içselleştirilmesi için büyük olanlardan ¹² daha yukarı çekmek pasif . Bu çalışmada parçacıkların termal analiz, kontrol SLNs ve Nir boya yüklü olanlar arasında kristalliğinden (erime, yani gizli ısı) farklı bir seviyede ortaya koymuştur. SLNs kristalliği bir safsızlık olarak hareket flüoresan boya, eklenmesi nedeniyle azalmıştır. Terapötik iletim sisteminin kristalinite b gösterilmiştirteslim etkileyen önemli bir faktör e ve ³¹ doz. SLN aracın kristallik bir azalma, bu tür terapötik yükleme kapasitesi ve ilaç salgılama kinetikleri ³¹ gibi parametreleri etkileyebilir. PIT yöntemi, yalnızca lipofilik ilaçlar parçacıklar içine dahil edilebilir sınırlandırması diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında daha yumuşak bir sentez tekniğidir. Bu sınırlama rağmen, bu yöntem kullanılarak sentezlendi SLNs biyomedikal araştırmalar birçok uygulama için müsait dağıtım platformu, yapım yüksek biyo-uyumludurlar.

Insan dermal fibroblast canlılığı üzerinde SLN etkileşim etkileri, MTT deneyi kullanılarak analiz edildi. Canlılığında bir doza bağımlı azalma SLN artan konsantrasyonlarda gözlenmemiştir. SLN Sentez sırasında, lipid parçacıkları bir yüzey aktif tabaka ile stabilize edilir. Parçacık boyutu azaldıkça, yüzey alanı artar, hücre yüzeyi ve hücre etkileşimleri maruz t potansiyeli olduğu gibihücre zarları zarar verebilir yüzey tabakasının, o. Bu deneyler nedeniyle membran parçalanması, hücre canlılığı önemli bir azalma kaçınarak parçacıkların hücresel alımı görülmeyinceye kadar dozlama konsantrasyonunun belirlenmesini sağladı. MTT analizi, geniş olarak selüler sağlık anlamak için uygulanabilen bir nicel bir tekniktir. Buna paralel olarak, hücreler, yük floresan boya, NIR floresan görselleştirmek için floresan mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Bu teknik kullanılarak, partikül alımı insan fibroblastlarında inkübasyonu, sadece 2 saat sonra gözlenmiştir. Floresan mikroskopi, hücresel morfoloji ve özellikleri ile ilgili nitel bilgiler sağlar. Bakım aşırı arka plan boyama ve eserleri görüntüleme önlemek için alınmalıdır. Buna ek olarak, fare modelleri genellikle hücresel derinlik ve moleküler araştırmalarda, biz SLNs ve kemirgen hücreler arasındaki etkileşimi analiz için ilk seçenektir. Özellikle, büyük birİlgi bağışıklık sisteminin davranışı değiştirmek güçlendiren ilaçların seçici ve kontrollü serbest bırakılması için nanopartiküllerin kullanılması yatmaktadır. Sonuç olarak, fare sitometrisi dendritik hücreler tarafından parçacıkların alınmasının ölçümü için kullanılmıştır akış. Bu veriler (indirgenmiş canlılığı, insan dermal fibroblastlar ile olduğu gibi 50 ug / ml lipid gözlenmiştir) ile ve birleşme seviyesi ile doğrudan SLN maruz konsantrasyonu ile korelasyon dendritik hücreler gibi fagosit hücrelerinin SLNs konsantrasyon benzer bir dizi tolere doğruladı. Ayrıca, DC bu nüfus SLN aracılığında ilaç vermenin yoluyla değerli bir hedefi temsil olabileceğini öne süren, SLNs çok hızlı bir birleşme saptandı.

Bu çalışma, biyolojik olarak uyumlu nanopartiküllerinin ultra küçük popülasyonlar sentezi için bir yöntemin bir açıklama, hem de hücresel etkileşiminin belirlenmesi ile bir kaç in vitro yöntem içerir. Gelecekteki çalışmalarda, ek deneylerbaşka terapötik nanocarriers başarılı gelişimi parçacık hücre etkileşimlerini karakterize etmek ve sonuç olarak yönlendirmek için kullanılabilir. Bu ilaç salma kinetiğine, hücresel tropizm, pro-enflamatuar sitokin seviyelerinin ölçümü ve zaman içinde hücre transkriptomik değişikliklerin analizi analiz çalışmaları dahil olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).