Bioengineering

Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Veicoli di consegna basata nanoparticelle hanno mostrato una grande promessa per le applicazioni destinate intracellulari, fornendo un meccanismo per alterare specificamente segnalazione cellulare e l'espressione genica. Questi veicoli possono essere caricati con farmaci, proteine e acidi nucleici progettati per influenzare la risposta cellulare e ottenere un effetto desiderato nei tessuti bersaglio. Molti tipi di nanovettori sono stati esplorati per beneficio terapeutico e diagnostica compresi lipidi, polimeri, silicio e materiali magnetici. Questi sistemi sono interessanti per la loro potenziale per la consegna della droga localizzato, aumento della concentrazione terapeutica nei tessuti bersaglio, e la riduzione della tossicità sistemica.

Nanoparticelle lipidiche solide (linfonodi sentinella) sono un esempio ben studiato di un sistema di erogazione di nanoparticelle che è emerso come un veicolo di consegna promettente farmaco negli ultimi anni. Linfonodi sentinella possono essere facilmente formulati per molteplici applicazioni tra cui bio-sensing ^1, cosmetici ^2, e tconsegna herapeutic ^3-7. La loro utilità deriva dal fatto che essi sono costituiti interamente da riassorbibili, lipidi non tossici, con conseguente maggiore biocompatibilità. Durante la sintesi, farmaci lipofili possono essere incorporati in veicoli SLN, aumentando così la solubilità e l'idoneità farmaco per somministrazione parenterale. Veicoli SLN anche aiutare a stabilizzare terapeutica incapsulati, riducendo la loro degradazione e di liquidazione, e massimizzando azione terapeutica. Questi veicoli sono particolarmente adatti per lunga durata d'azione, le preparazioni a rilascio controllato per la loro stabilità alle ^3,4,8,9 temperatura corporea. È importante sottolineare che l'incapsulamento dei farmaci in nanoparticelle lipidiche altera i profili farmacocinetici intrinseche delle molecole di droga. Ciò fornisce un vantaggio potenziale permettendo il rilascio controllato di farmaci con un ristretto indice terapeutico. Il tasso di rilascio di terapie SLN-incorporato può essere sintonizzato sulla base del tasso di degradazione dei lipidi o il tasso di diffusione della droga nelmatrice lipidica.

Linfonodi sentinella sono spesso progettati ad accumularsi nei tessuti bersaglio specifici. Ad esempio, le loro dimensioni (tipicamente maggiore di 10 nm) potenzia ritenzione nella circolazione, dove la vascolarizzazione del tessuto tumorale leaky facilita la deposizione. Inoltre, la via di somministrazione particella ha dimostrato di alterare biodistribuzione con la possibilità di indirizzare specifiche strutture fisiologiche quali linfonodi ^10,11. Dopo la deposizione nei tessuti bersaglio, ottenendo adeguate interazioni cellulari ed eventuale internalizzazione delle nanoparticelle è difficile a causa della capacità delle membrane cellulari per controllare selettivamente il flusso di ioni e molecole dentro e fuori della cella ^12. Per facilitare assorbimento cellulare, è possibile modificare nanovettori con leganti specifici inclusi peptidi, piccole molecole, e anticorpi monoclonali ^13,14. Diversi meccanismi compresi sia penetrazione passivo e trasporto attivo di nanoparticelleattraverso la membrana cellulare precedentemente descritte ^3,12,15. In generale, è stato dimostrato che le interazioni cellula-nanoparticelle sono influenzati dalle proprietà fisico-chimiche delle nanoparticelle tra cui le dimensioni, la forma, carica superficiale e chimica di superficie, oltre ai parametri specifici delle cellule, quali tipo di cellula o cella fase del ciclo ^12.

Una precedente inchiesta ha dimostrato la sintesi di sub-10 nm linfonodi sentinella per uso topico ¹⁶ e biomarcatori applicazioni di rilevamento ¹ con il metodo del ¹⁷ temperatura di inversione di fase (PIT). Questo è un metodo di sintesi in cui delicato ² la composizione rimane costante mentre la temperatura viene gradualmente cambiata. Continua agitazione della soluzione riscaldata, mentre si raffredda a risultati RT in una nanoemulsione. Questo processo determina la sintesi di linfonodi sentinella con granulometria inferiore ¹ di quella precedentemente riportata utilizzando vari metodi per la sintesi di lipidi nanoparticles ^17-22. La scala di dimensioni risulta, a meno di 20 nm, offre un vantaggio per le applicazioni di targeting intracellulare a causa di una maggiore superficie e il potenziale di interazioni cellulari avanzati.

Uno schema di linfonodi sentinella, destinata a fornire un colorante fluorescente o terapeutico, è mostrata in Figura 1. I linfonodi sentinella costituiti da un lipide interni (ad esempio, alcano lineare) permettendo l'incorporazione di composti lipofili (ad esempio, coloranti o terapeutici) e un esterno tensioattivo (tensioattivo non ionico ad esempio, lineare) circondato da acqua. In questo studio, linfonodi sentinella sono stati caricati con un colorante fluorescente e usati come modello per studiare le interazioni delle particelle-cellula. Fibroblasti dermici umani primari e le cellule dendritiche di topo sono state esposte per tingere-caricato SLN nel tempo al fine di caratterizzare le interazioni in termini di tossicità e l'assorbimento delle particelle. Un test 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium bromuro (MTT) era Utilized al fine di stabilire adeguati livelli di dosaggio. Microscopia a fluorescenza e citometria a flusso sono stati due metodi utilizzati per esaminare l'assorbimento delle particelle in vitro.

Figura 1. Schema del linfonodo sentinella che mostra i principali componenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. Il trattamento di linfonodi sentinella

Sintesi di linfonodi sentinella
Nota: Utilizzare il metodo PIT ^1,17,20 per preparare i sub-20 nm linfonodi sentinella ^1.
1. Utilizzare una tecnica asettica, bioreagents o reagenti di colture cellulari di qualità e materiali sterili (cioè, pipette, spatole, fiale, ecc.)
2. Utilizzare un armadio biosicurezza per la sintesi dei linfonodi sentinella (Figura 2).
3. Combinare 0,6 mg di colorante fluorescente (Nilo Red (NIR), concentrazione NiR è di circa 0,3 mg / ml) e 0,10 g di Heneicosane (Lipid, 5 peso / peso% concentrazione di lipidi) in una fiala (15 ml), co-fonde a 90 ° C, e mescolate.
4. Aggiungere 0,11 g di poliossietilene (10) oleil etere (tensioattivo, 5.5 wt / wt% concentrazione di tensioattivo). Co-melt la miscela risultante a 90 ° C e mescolare.
5. Aggiungere 1,79 g di acqua sterile alla miscela, riscaldare a 90 ° C, e mescolare fino ad avere una nanoemulsione trasparente.
  Nota: In continua agitazione e raffreddamento controllato, SLNs vengono creati. Queste condizioni provocano un'inversione della emulsione acqua-in-olio ad una emulsione olio-in-acqua. Molecole lipofile quali NiR partizione per le gocce lipidiche.
6. Preparare una nanoemulsione in parallelo senza aggiungere il colorante fluorescente, per servire come campione di controllo. Combinare 0,10 g di Heneicosane e 0,11 g di poliossietilene (10) oleil etere in un flacone (15 ml) co-fuso a 90 ° C, e mescolate.
  1. Aggiungere 1,79 g di acqua sterile alla miscela, riscaldare a 90 ° C, e mescolare fino ad avere una nanoemulsione trasparente.
7. Ulteriori sterilizzare ogni nanoemulsione utilizzando una sterile 0,2 micron filtro.
Figura 2. Schema di sintesi di linfonodi sentinella. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Dimensione delle particelle e Polydispersity
1. Utilizzare light scattering dinamico (DLS) per misurare la dimensione delle particelle e polidispersità dei linfonodi sentinella ¹ utilizzando una cuvetta di vetro e uno strumento progettato per misurare la dimensione delle particelle.
2. Prima le misure dei campioni, misurare le dimensioni delle particelle di due standard noti seguendo il protocollo del produttore per la preparazione e la misura standard.
3. Riempire la provetta di vetro con 1,5 ml di soluzione standard e misurare la soluzione standard con le stesse condizioni di misura come i campioni.
  Nota: passo precedente è stato ripetuto per ogni standard.
4. Misurare i campioni così come predisposto. Per ciascuna, utilizzare i seguenti parametri sperimentali: un tempo di esecuzione di 100 sec, indice di rifrazione di acqua (1.33), viscosità dell'acqua a 20 ° C (1.002 mPa · sec).
  Nota: Questa tecnica utilizza frequenza spostata luce per misurare le dimensioni delle nanoparticelle.
5. Riportare il diametro delle particelle media e polidispersità di partidistribuzione delle dimensioni cle.
Punto di fusione e di calore latente di fusione
1. Utilizzare un calorimetro a scansione differenziale (DSC) equipaggiato con un autocampionatore e la sorgente di raffreddamento azoto liquido per studiare il comportamento termico dei linfonodi sentinella ^1.
2. Pipettare i linfonodi sentinella come preparati in una vaschetta di alluminio 40 microlitri con una massa di circa 25 mg e sigillare ermeticamente la padella con una pressa piegatore universale per minimizzare la perdita di umidità durante la scansione DSC.
3. Misurare ogni nanoemulsione da 5 a 80 ° C.
4. Riportano il punto di fusione e il calore latente di fusione DSC dal terreno, dove la valle rappresenta il punto di fusione e l'integrale della area sotto la curva nel grafico DSC diviso per la quantità di materiale rappresenta il calore latente di fusione.

2. linfonodi sentinella Interazione con fibroblasti e cellule dendritiche

Cultura di primari fibroblasti umani
1. Cultura primario fi umanofibroblasti secondo le istruzioni del produttore in mezzo liquido per la coltura di fibroblasti dermici umani (media 106), integrati con il kit supplemento bassa crescita nel siero (LSGS). Mantenere celle in atmosfera umidificata a 37 ° C, 5% CO ₂ e subcultura raggiungimento 80% di confluenza.
2. Per entrambi MTT e analisi di immagini, alveoli in una piastra a 96 pozzetti, ad una densità di 2 x 10 ⁴ cellule per pozzetto, e lasciar equilibrare a 37 ° CO / N prima dell'esposizione SLN.
3. Al tempo zero, diluire linfonodi sentinella in terreno completo come indicato (figura 4), rispetto alla concentrazione di lipidi, e aggiungere 10 ml per pozzetto a ciascun replicarsi bene nella piastra a 96 pozzetti.
4. Mantenere cellule a 37 ° C, 5% CO _2, durante il periodo di incubazione.
MTT Tossicità Assay
1. Dopo 24 ore di incubazione con linfonodi sentinella, determinare la vitalità cellulare con il saggio MTT, secondo il protocollo del produttore. </ li>
2. Lavare le cellule una volta e aggiungere mezzo fresco a ciascun pozzetto (100 l / pozzetto). Uccidi pozzetti di controllo incubando in una soluzione di metanolo al 70% per 10 minuti prima di sostituire con terreno fresco.
3. Aggiungere il reagente MTT (10 ml per pozzetto) in ciascun pozzetto della micropiastra e incubare O / N a 37 ° C.
4. Dopo O / N incubazione, solubilizzare cristalli formazina intracellulari con la soluzione detergente fornito (100 pl per pozzetto) secondo il protocollo del produttore.
5. Dopo 3 ore di incubazione a RT, ottenere valori di assorbanza alla lunghezza d'onda di misura di 570 nm con un lettore di micropiastre.
  Reagente MTT utilizzato deve essere inferiore a 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, bromuro di 5-difenil-tetrazolio: Note.
Microscopia a fluorescenza
1. In punti temporali specifici dopo somministrazione di fibroblasti con SLN, lavare i fibroblasti due volte con sterile tampone fosfato salino (PBS) e fissare per 10 minuti con il freddo il 70% di metanolo.
2. Dopo 10 min, Sostituire il metanolo con PBS e catturare le immagini utilizzando un microscopio invertito, con una banda passante (BP) 690/50 nm set di filtri.
Cultura di cellule di topo midollo osseo dendritiche
1. Indurre le cellule derivate dal midollo osseo di topo dendritiche (BMDC) come precedentemente descritto ^23,24. In breve, le sospensioni piastra singola cellula del C57BL / 10 midollo osseo a 100 mm piastre di Petri a 2 x 10 ⁶ / piastra con il fattore ricombinante murino granulociti-macrofagi stimolante le colonie (GM-CSF, 300 U / ml) e ricombinante murino IL-4 (cellule B fattore, 200 U / ml stimolante). Modificare i media ogni 3 giorni.
2. Il giorno 7, aggiungere linfonodi sentinella NiR caricati ai piatti ad una concentrazione finale di 0,5 e 5,0 mg / ml di lipidi e mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO _{2 incubatore} per la durata di esposizione desiderato.
3. Raccogliere cellule dalle stoviglie aspirando tutti i media nel piatto, raccogliendola in un tubo da 50 ml, seguito da lavaggio accurato della piastra (per rimuovere annuncio liberamentecellule Herent) con 5 ml di tampone fosfato salino (PBS) contenente 4 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Raccogliere la sospensione cellulare ottenuta nello stesso tubo 50 ml.
La valutazione di linfonodi sentinella incorporazione tramite Citometria a Flusso
1. Determinare la concentrazione della sospensione cellulare ottenuta al punto 2.4.3 e distribuire 3x10 ⁵ cellule in un fondo rotondo tubo FACS 12 mm x 75 mm.
2. Lavare le cellule aggiungendo 1 ml di PBS e quindi i tubi centrifugazione per 5 minuti a 400 xg, ad una temperatura di 4 ° C.
3. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con 100 ml di PBS / 2 mM EDTA / 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) (tampone colorazione) contenenti anticorpo monoclonale anti-CD11c-FITC (0,25 mg / ml finale). Incubare per 30 min in ghiaccio al buio.
4. Lavare le cellule con 1 ml di PBS e centrifugare le provette per 5 minuti a 400 xg, ad una temperatura di 4 ° C.
5. Scartare il surnatante e risospendere ognipellet con 400 ml di buffer di colorazione. Le cellule sono ora pronti per l'acquisizione dei campioni con un citometro a flusso (eventualmente dotato di laser blu e rosso).
6. Utilizzando il software di analisi di citometria a flusso, valutare il livello di incorporazione di linfonodi sentinella da DC dal gating sulla popolazione di CD11c + cellule (FITC positivo) e confrontando l'intensità di linfonodi sentinella-associati fluorescenza (misurata nei canali PerCP-Cy5.5 o APC).

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Representative Results

Il metodo è stato utilizzato PIT per sintetizzare i linfonodi sentinella e la temperatura di inversione di fase è stato determinato utilizzando un bagno di acqua. I campioni erano riscaldata lentamente e delicatamente agitata finché la soluzione appariva chiaro. La temperatura inversione di fase per i linfonodi sentinella effettuate utilizzando lipidi heneicosane è di 45 ° C. La tabella 1 riassume la dimensione delle particelle, polidispersità, punto di fusione e calore latente di fusione per i linfonodi sentinella. I linfonodi sentinella sintetizzati utilizzando le condizioni di trasformazione sopra descritte hanno determinato linfonodi sentinella controllo e linfonodi sentinella NiR caricati con un diametro medio delle particelle di 18,59 e 16,87 nm e con una polidispersità di 5.83 e 4.47, rispettivamente (Figura 3). La stabilità della dispersione linfonodi sentinella è stata monitorata attraverso la misura della dimensione delle particelle in 6 giorni a due temperature differenti stoccaggio (4 e 23 ° C). La dimensione delle particelle non è cambiata in 6 giorni (dati non mostrati).

Il comportamento termico dei linfonodi sentinella è stata investigated utilizzando calorimetria differenziale a scansione. I linfonodi sentinella sintetizzati hanno un punto di fusione di 38,0 (± 0,4) e 36,8 (± 0,2) ° C per i linfonodi sentinella controllo e linfonodi sentinella NiR caricati rispettivamente. Al contrario, il punto di fusione della massa lipidica è 40,0 ° C, indicando la soppressione del punto di linfonodi sentinella rispetto al lipide bulk fusione. Come previsto, il confinamento di piccole dimensioni ed elevato rapporto superficie zona-volume deprimere il punto di nanoparticelle di fusione ^1. Inoltre, il calore latente di fusione per i linfonodi sentinella controllo e linfonodi sentinella NiR caricati 5,1 (± 0,2) e 4,0 (± 0,1) J / g, rispettivamente. Questi risultati indicano che il livello di cristallinità dei linfonodi sentinella è influenzata dal carico utile, in cui i linfonodi sentinella NiR caricati mostrato una cristallinità inferiore rispetto ai linfonodi sentinella controllo.

Figura 3. distribuzione granulometrica dinanoemulsioni tipici. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Campione	Dimensione delle particelle (nm)	Polidispersità	Punto di Fusione (° C)	Latente Calore di fusione (J / g)
Linfonodi sentinella (Control)	18.59	5.83	38.0 ± 0.4	5.1 ± 0.2
NIR linfonodi sentinella	16.87	4.47	36.8 ± 0.2	4,0 ± 0,1

Tabella 1. Sintesi delle proprietà fisiche e comportamento termico dei linfonodi sentinella controllo e linfonodi sentinella NiR caricati compreso granulometria, polidispersità, punto di fusione e calore latente di fusione.

Al fine di esplorare le interazioni delle particelle e modelli cellulari, i limiti di dose del SLN applicati come direttamente alle cellule primarie in coltura, sono stati stabiliti prima. Utilizzando un saggio MTT, l'effetto dose-risposta sul metabolismo cellulare è stata misurata, dove l'aumento della concentrazione di particelle ha comportato una riduzione della vitalità cellulare (rispetto alle cellule di controllo non trattati). Non c'era differenza osservata tossicità tra le cellule esposte a SLN solo contro SLN NiR-caricato in queste dosi predeterminati. In parallelo, le cellule sono state esaminate visivamente per adesione alla cultura tissutale polistirene e le immagini sono state prese per dimostrare sia la morfologia cellulare e rappresentante l'assorbimento di particelle fluorescenti nel tempo (Figura 5). Utilizzando una dose pari a 5 mg / ml di lipidi (circa l'80% cellulare vitalità) assorbimento di particelle è stato osservato da post esposizione 2 hr.

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Figura 4. La vitalità di primari fibroblasti dermici umani dopo 24 ore di incubazione con nanoparticelle. Vitalità è stata misurata utilizzando un test MTT, e dati rappresentano cellule vitali per cento rispetto ai controlli non trattati. Concentrazioni rappresentano peso / volume lipidico. Dati riflettono almeno tre esperimenti indipendenti condotti in triplicato. Le barre di errore indicano l'errore standard della media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. primari fibroblasti dermici umano dopo (A) 2 e (B) 24 ore di incubazione con nanoparticelle NiR-caricati. Concentrazione di nanoparticelle è pari a 5 mg / ml di lipidi.Le immagini sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti, condotti in doppio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Sulla base dei risultati degli studi limitazione della dose, la correlazione tra la dose di linfonodi sentinella e livello di incorporazione in murino BMDC stato studiato. Queste cellule sono ampiamente considerati i migliori modello in vitro di più sottoinsiemi DC esistenti in vivo e permettono indagini di base a livello di ricerca di entrambi gli effetti cellulari e molecolari delle manipolazioni previsti. BMDC stati lasciati non trattata o esposto O / N a 0.5 o 5.0 mg / lipidi ml dei linfonodi sentinella NiR-caricati (simile a fibroblasti umani, l'uso di 50 ug / lipidi ml determinato cellule vitali meno del 10%) e il livello di nanoparticelle incorporazione determinata misurando l'intensità della fluorescenza BMDCs NiR tramite citometria di flusso. Un corre direttamento tra la concentrazione di linfonodi sentinella utilizzati e la quantità di fluorescenza valutata BMDCs stato osservato (Figura 6A). L'analisi della cinetica di NiR-caricato linfonodi sentinella incorporazione rivelato un rapido assorbimento da parte BMDC. Il segnale fluorescente SLN era già evidente dopo 1 ora di esposizione, mentre plateauing a circa 5h di esposizione (Figura 6B).

Figura 6. SLN incorporazione dalle cellule dendritiche è correlato con la concentrazione di esposizione. (A) osso Murine osseo derivate cellule dendritiche (BMDC) sono stati esposti O / N a NiR-linfonodi sentinella, alla concentrazione di lipidi indicato, e il livello di incorporazione valutato tramite citometria a flusso. Sovrapposizioni Istogramma sono tutti gated sul CD11c + popolazione. (B) cinetica di incorporazione SLN da BMDC. Le cellule sono state esposte a NiR-linfonodi sentinella (5mg / ml) per il tempo indicato e il livello di fluorescenza (su CD11c + cellule gated) è stata valutata mediante citometria a flusso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo studio, la sintesi di linfonodi sentinella e loro applicabilità per le applicazioni destinate intracellulari sono state esplorate. Queste nanoparticelle biocompatibili hanno mostrato risultati promettenti come veicoli di consegna per più applicazioni, tra cui la somministrazione di farmaci, silenziamento genico, e le tecnologie di vaccini ^25-30. Ultra-piccoli linfonodi sentinella sono stati sintetizzati utilizzando un processo facile, e sono state esplorate le loro interazioni con le cellule della pelle primarie e cellule immunitarie primarie. Linfonodi sentinella sono stati progettati per includere l'incapsulamento di un colorante fluorescente (NIR), che servì da modello carico terapeutica.

Il metodo PIT è stato impiegato per sintetizzare SLN e le proprietà delle particelle risultanti (granulometria, polidispersità, punto di fusione, e latente calore di fusione) sono stati valutati utilizzando dynamic light scattering e calorimetria differenziale a scansione. La dimensione delle particelle e analisi polidispersione rivelato la sintesi di ultra-piccoli linfonodi sentinella con strette polidispersità, ideale per bersaglio intracellulareing applicazioni. Come riportato in precedenza, la dimensione delle particelle in grado di giocare un ruolo importante su interazioni cellulari ^12. Le dimensioni delle nanoparticelle ha dimostrato di avere un effetto drammatico, influenzando l'efficienza di assorbimento, selezione percorso interiorizzazione, localizzazione intracellulare, e la citotossicità ^12. Alcune delle tendenze complessive rispetto alle interazioni cellula-nanoparticelle documentati in letteratura sono: dimensione critica può variare con il tipo di cellule e di superficie proprietà delle nanoparticelle, e le piccole nanoparticelle hanno una maggiore probabilità di essere internalizzati da passivo up-take di quelle grandi ¹² . Analisi termica delle particelle in questo studio ha rivelato un diverso livello di cristallinità (cioè, calore latente di fusione) tra i linfonodi sentinella controllo e quelli caricati con NiR colorante. La cristallinità dei linfonodi sentinella diminuito a causa della aggiunta del colorante fluorescente, che agisce come impurezza. La cristallinità del sistema di erogazione terapeutica ha dimostrato di ball'e un fattore importante che influenza la consegna e la dose ^31. Una diminuzione cristallinità del veicolo SLN può influenzare parametri quali capacità di carico terapeutico e la cinetica di rilascio del farmaco ^31. Il metodo PIT è una tecnica di sintesi più dolce rispetto ad altri metodi, con la limitazione che solo i farmaci lipofili possono essere incorporati nelle particelle. Nonostante questo limite, linfonodi sentinella sintetizzati con questo metodo sono altamente biocompatibile, rendendo la piattaforma di consegna quindi adatto a molte applicazioni nella ricerca biomedica.

Gli effetti di interazione SLN sulla vitalità cutanea fibroblasti umani sono stati analizzati utilizzando un test MTT. Una riduzione dose-dipendente della vitalità è stata osservata con concentrazioni crescenti di SLN. Durante la sintesi SLN, le particelle lipidiche sono stabilizzati con uno strato di tensioattivo. Come la dimensione delle particelle diminuisce, aumenta Superficie, così come il potenziale di interazioni della superficie cellulare e cellulare esposizione to lo strato di tensioattivo, che può danneggiare le membrane cellulari. Questi esperimenti permesso la determinazione della concentrazione di dosaggio in cui l'assorbimento cellulare di particelle potrebbe essere osservata evitando una significativa diminuzione della vitalità cellulare dovuta alla rottura della membrana. Analisi MTT è una tecnica quantitativa che può essere applicata in generale a comprendere la salute cellulare. In parallelo, le cellule sono state esaminate tramite microscopia a fluorescenza per visualizzare la fluorescenza del colorante fluorescente carico, NiR. Utilizzando questa tecnica, l'assorbimento di particelle è stato osservato dopo solo 2 ore di incubazione con fibroblasti umani. Microscopia a fluorescenza fornisce informazioni qualitative relative a morfologia e le caratteristiche cellulari. Si deve prestare attenzione per evitare colorazione di fondo eccessiva e l'imaging di artefatti. Inoltre, come modelli murini sono generalmente la prima scelta per profondità cellulare e indagini molecolari, abbiamo analizzato l'interazione tra linfonodi sentinella e cellule murine. In particolare, una grandeinteresse risiede nell'uso di nanoparticelle per il rilascio selettivo e controllato di farmaci che modificano il comportamento del sistema immunitario. Di conseguenza, la citometria a flusso è stato impiegato per misurare l'assorbimento di particelle da parte delle cellule dendritiche del mouse. Questi dati hanno confermato che le cellule fagocitiche come cellule dendritiche possono tollerare un simile intervallo di concentrazione linfonodi sentinella (con ridotta vitalità osservata a 50 mg / ml come lipidi con fibroblasti umani) e il livello di incorporazione è direttamente correlata con la concentrazione di esposizione SLN. Inoltre, DC ha rivelato un rapido inserimento dei linfonodi sentinella, suggerendo che questa popolazione potrebbe rappresentare un bersaglio valido tramite somministrazione di farmaci SLN-mediata.

Questo studio comprende la descrizione di un metodo per la sintesi di ultra-piccole popolazioni di nanoparticelle biocompatibili, così come diversi metodi in vitro per valutare le loro interazioni cellulari. In studi futuri, test aggiuntivopossono essere impiegati per caratterizzare ulteriormente le interazioni delle particelle di cellule e infine guidare lo sviluppo positivo di nanovettori terapeutici. Queste potrebbero includere studi di cinetica di rilascio di farmaci, analisi di tropismo cellulare, misurazione dei livelli di citochine pro-infiammatorie, e l'analisi di cellulari cambiamenti di trascrittomica nel corso del tempo.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

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References

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